1、 第五章第五章基因结构和表达变化基因结构和表达变化与疾病的关系与疾病的关系 基因结构与表达异常与疾病基因结构与表达异常与疾病 蛋白质是生命的物质基础，人体各种生命现象和生命过程主要是通过蛋白质的生理功能体现。疾病的本质是由各种原因引起蛋白质的质和量的改变的导致的蛋白质空间结构的紊乱。蛋白质的质和量的改变从分子生物学角度讲，又是基因结构及表达的改变的结果，故基因结构与表达的改变是疾病发生发展的重要机制。3第一节第一节 不同基因通过不同机制导致疾病发生不同基因通过不同机制导致疾病发生 蛋白质功能紊乱是疾病发生的基因病理机制，但蛋白质功能紊乱是疾病发生的基因病理机制，但不同的基因通过不同机制引起蛋白
2、质功能紊乱。不同的基因通过不同机制引起蛋白质功能紊乱。基因结构改变基因结构改变 环境因素影响了基因的表达环境因素影响了基因的表达 外源致病基因的进入表达：产生了毒性蛋白；产外源致病基因的进入表达：产生了毒性蛋白；产 生了合成非蛋白毒性物生了合成非蛋白毒性物 质的酶。质的酶。一、一、基因结构改变导致蛋白质结构或基因结构改变导致蛋白质结构或量变化引起疾病量变化引起疾病 由于体内外各种因素改变了某基因特定的由于体内外各种因素改变了某基因特定的DNA序列碱基组成和排列顺序，导致序列碱基组成和排列顺序，导致DNA一一级结构发生改变，改变了基因结构即级结构发生改变，改变了基因结构即基因突基因突变变。其分子
3、机制可以是替换、插入或缺失，。其分子机制可以是替换、插入或缺失，因而产生不同的突变类型。因而产生不同的突变类型。(一)基因突变的多种类型1.点突变点突变是单个碱基的改变：转换和颠换2.缺失缺失是一个或多个核苷酸的丢失3.插入插入是一个或多个核苷酸的增加4.倒位倒位是一段核苷酸序列方向倒转基因突变还分为配子突变配子突变与体细胞突变体细胞突变动态突变动态突变指串联重复序列（拷贝数）随世代的传递而改变。基因突变基因突变的类型的类型1.1.点突变点突变:单个碱基的改变单个碱基的改变 在基因一级结构的某个位点上，一种碱基在基因一级结构的某个位点上，一种碱基被另一种碱基取代。被另一种碱基取代。分为：分为：
4、转换转换 （transitiontransition）颠换颠换 （transversiontransversion）基因突变的类型2.2.缺失（缺失（delelationdelelation）是一个或多个核苷酸的丢失：在基因一级结构中某个位点上，一个核苷酸或一段核苷酸序列丢失造成的基因结构改变。3.插入（插入（insertioninsertion）基因突变的类型4.倒位倒位是一段核苷酸序列方向倒转：基因内部的DNA序列重组，使一段DNA序列的方向倒转。5.配子突变配子突变与体细胞突变体细胞突变6.动态突变动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变（dynamic mutation）(1)(1)
5、基因突变引起遗传密码的改变：根据基因基因突变引起遗传密码的改变：根据基因突变产生的遗传效应不同分为突变产生的遗传效应不同分为(二)不同的基因突变引起不同的遗传效应a.a.同义突变(consense mutation)b.错义突变 (missense mutation)c.无义突变(nonsense mutation)d.移码突变（frame-shifting mutation）同义突变(same sense mutation)：密码子发生改变,但所编码的氨基酸不变。例如：CUU CUC CUG 亮氨酸 错义突变错义突变（missense mutation）指DNA分子中碱基的取代，经转录产生的
6、mRNA后，相应密码子发生改变，编码另一种氨基酸，使蛋白质中的氨基酸组成和排列顺序发生改变。由于碱基的取代、缺失或插入，使原来编码某种氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变无义突变(nonsense mutation)。亮氨酸的密码子亮氨酸的密码子UUA，中间的，中间的U变为变为A这样一个碱基变化这样一个碱基变化就会成为（终止密码子）就会成为（终止密码子）UAA。酪氨酸的密码子是UAC，置换突变使UAC变为密码子UAG后翻译便到此停止。无义突变无义突变：指DNA链上插入或丢失1个、2个甚至多个碱基（但不是三联体密码子及其倍数），在读码时，由于原来的密码子移位，导致在插入或丢失碱基
7、部位以后的编码都发生了相应改变。移码突变造成的肽链延长或缩短，取决于移码终止密码子推后或提前出现。移码突变移码突变(frame-shift mutation)(2)(2)基因突变影响基因突变影响 hnRNA hnRNA 的剪接的剪接 基因突变发生在 hnRNA 的一级结构上特定的剪接位点上，导致 hnRNA 的剪接错误，产生异常的 mRNA，最终产生异常的蛋白表达产物，改变生物性状。(三三)结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病1.血红蛋白病(hemoglobinopathy)：血红蛋白(hemoglobin,Hb)的结构特点 珠蛋白(globin)基因的时、空特
8、异性表达 血红蛋白结构血红蛋白结构 血红蛋白是由血红蛋白是由4条肽链（两个条肽链（两个和两个和两个链）组成链）组成的。每条肽链都类似于肌红蛋白的肽链，都结合的。每条肽链都类似于肌红蛋白的肽链，都结合一个血红素。一个血红素。血红蛋白的脱氧（血红蛋白的脱氧（T）和氧合（）和氧合（R）构象在氧）构象在氧的亲和性方面有很大区别。由于结构上的相互的亲和性方面有很大区别。由于结构上的相互作用是与它的三级和四级结构有关，所以血红作用是与它的三级和四级结构有关，所以血红蛋白在结合氧的过程中显示出别构效应和协同蛋白在结合氧的过程中显示出别构效应和协同性。性。血红蛋白分子一级结构上的轻微差血红蛋白分子一级结构上的
9、轻微差别就可能导致功能上的很大不同，别就可能导致功能上的很大不同，正常成年人血红蛋白中的正常成年人血红蛋白中的链的第链的第六位的谷氨酸残基被缬氨酸取代就六位的谷氨酸残基被缬氨酸取代就会导致镰刀形细胞贫血病的异常血会导致镰刀形细胞贫血病的异常血红蛋白红蛋白HbS HbS 的生成。的生成。血红蛋白病血红蛋白病镰刀形细胞贫血症镰刀形细胞贫血症血红蛋白病类型血红蛋白病类型异常血红蛋白异常血红蛋白:珠蛋白结构珠蛋白结构(质质)变异，导致贫血。变异，导致贫血。地中海贫血地中海贫血:珠蛋白合成珠蛋白合成(量量)减少，又称珠蛋减少，又称珠蛋白合成障碍性贫血。白合成障碍性贫血。20四、基因调控序列变异导致表达水
10、平变化四、基因调控序列变异导致表达水平变化引起疾病引起疾病 通过对珠蛋白基因的转录调控序列研究，发现这些调控序列如发生基因突变，就会降低珠蛋白基因的转录水平，珠蛋白合成减少，引起型地中海性贫血。除了调控序列改变会影响相应基因的表达外，基因内的内含子变异也会影响蛋白质合成。二、细胞间信号异常导致基因表达异常引起疾病二、细胞间信号异常导致基因表达异常引起疾病 人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌信号等保持细胞间的联系，调节彼此的代谢。基信号等保持细胞间的联系，调节彼此的代谢。基因表达也受到细胞间信号的调控。通过细胞间信因表达也受到细胞间信号的调控。通过细胞间
11、信号传递，能保证基因表达的时间特异性和空间特号传递，能保证基因表达的时间特异性和空间特异性以及表达水平正常。异性以及表达水平正常。AFP AFP 是胚胎发育过程中表达的蛋白，具有免疫抑是胚胎发育过程中表达的蛋白，具有免疫抑制作用，保护胎儿免受母体免疫攻击。在接受异制作用，保护胎儿免受母体免疫攻击。在接受异常的细胞增殖信号作用下，其基因表达，导致肝常的细胞增殖信号作用下，其基因表达，导致肝癌细胞逃避机体免疫监视。成为肝癌发生的重要癌细胞逃避机体免疫监视。成为肝癌发生的重要因素。因素。三、细胞内因素导致基因表达异常引起疾病三、细胞内因素导致基因表达异常引起疾病 异常的细胞内信号导致基因表达异常引起
12、异常的细胞内信号导致基因表达异常引起疾病疾病 高血糖 DAG PKC ACE Ang 异常的异常的DNADNA甲基化导致基因表达异常引起疾甲基化导致基因表达异常引起疾病病 hCG5转录起始区低甲基化低甲基化非滋养层细胞hCG 受体结合 cAMP信号途径 调节其它生长因子产生，促进Tumor形成 刺激蛋白质合成心肌肥大23 四、四、病原生物基因的体内表达病原生物基因的体内表达1、外原病原生物进入人体内，大量繁殖，生长，引起机械或生物学损伤2、与人体争夺营养，引起疾病3、产生生物毒素作用人体，引起疾病4、外源基因的整合到人基因组上，引变了一些基因结构或表达。二、二、基因结构和表达与疾病的研究策略基
13、因结构和表达与疾病的研究策略1通过结构分析确定基因变异通过结构分析确定基因变异 核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、化学切割错配、酶促切割错配化学切割错配、酶促切割错配3通过功能学研究确定致病基因通过功能学研究确定致病基因 转基因技术、基因敲除、转基因技术、基因敲除、反义技术、基因诱导超表达反义技术、基因诱导超表达2基因表达水平分析基因表达水平分析 差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析核糖核酸酶切分析核糖核酸酶切分析基本原理基本原理:在一定条件下，异源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中错配碱基可被核糖核酸酶RNa
14、se识别并切割，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小，即可确定错配的位置。核糖核酸酶切分析（核糖核酸酶切分析（RNase cleavageRNase cleavage）缺点：缺点：当RNA探针上错配的碱基为嘌呤嘌呤时，核糖核酸核糖核酸酶切割效率低甚至不切割；酶切割效率低甚至不切割；分析分析DNADNA的一条链，突变检出率为的一条链，突变检出率为 30%30%；同时；同时分析分析DNADNA的两条链，突变检出率为的两条链，突变检出率为 70%70%；需要制备特异性的需要制备特异性的RNA探针杂合双链分析法杂合双链分析法 （heteroduplex analgsis,HA）直接在非变性凝胶上分离杂交的突
15、变型直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型野生型DNA双链。由于突变型和野生型双链。由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成单在其错配处会形成单链环形突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生链环形突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应同源双链与相应同源双链DNA不同的迁移率不同的迁移率。检测缺失突变只适于检测缺失突变只适于200-300bp长度片段长度片段,且不能确定位置且不能确定位置,检出率只有检出率只有80%.化学切割错配法化学切割错配法 （Chemical cleavage of mismatch,CCM）基本原理基本原理：将待测含DNA片段与相
16、应的野生型DNA片段或RNA片段混合变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺和哌啶切割，错配的T能被四氧化锇切割，经变性凝胶电泳可确定是否存在突变。化学切割错配法化学切割错配法特点特点：突变检出率高；如使用荧光检测系统，灵敏度较高；可检测长度达 2Kb的核酸片段；步骤多、费时、有毒；如对正义链与反义链都进行分析,检测率达100%.酶促切割错配酶促切割错配(enzyme mismatch cleavage)酶促切割错配是一种与Rnase酶切分析相类似的方法.不同之处是该方法采用的酶是T4核酸内切酶能够识别12种错配的碱基,并在错配碱基附近进行酶切.优点优点:对检测DNA片段可用DN
17、A探针杂交检测.最长检测长度达到1.5Kb.缺点缺点:可出现非特异性切割,对错配认别也不是100%.RFLP-Restriction Fragment Length PolyhmorphismRFLPsMicrosatellite repeats35二、通过基因表达水平分析确定基因在疾病发生中作用 人类疾病发生的另一个重要原因是基因表达水平的改变，因基因表达水平的改变涉及的往往不是单一基因，而是多基因，即一些基因表达增加，一些基因表达降低，导致由其编码蛋白组成的代谢及调节系统异常，引发疾病。因此通过基因水平找到正常与疾病状态下的差异表达基因，确定其在疾病中作用。方法：Northern杂交法，消
18、减杂交技术、差异显示法、定量RT-PCR、基因表达芯片等差异显示技术(mRNA differential display reverse transcription chain reaction,DDRT-PCR)在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同阶段、在生物体对疾病的反应以及不同的环境下调控基因的表达是不同的，这就是基因的差别表达（differential expression）。原理：利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。3 3端引物端引物：利用mRNA的poly A尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，poly A尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合：根据这12种排列组
19、合，设计12种不同的引物，这样就将所有mRNA分成了12组。这些引物由1112个T及两个其它的碱基组成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。5端引物：5端为10个碱基（10-mer）组成的随机引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA的不同位点上。用一种3锚定引物和一种5随机引物进行扩增，可获得50100条100500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5随机引物。抑制性差减杂交抑制性差减杂交(SSH)-Diatchen
20、ko L,SSH)-Diatchenko L,et al.et al.PNASPNAS 1996;93:6025-60301996;93:6025-6030 Suppression subtractive hybridization:Suppression subtractive hybridization:a method for generating differentially a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA regulated or tissue-specific cDNA
21、 probes and librariesprobes and libraries 抑制性差减杂交抑制性差减杂交 (suppressive subtractive hybridization,SSH)suppressive subtractive hybridization,SSH)原理原理 SSH是差减杂交与是差减杂交与PCR结合的快速分离差异基结合的快速分离差异基因的方法。运用杂交动力学原理，丰度高的单链因的方法。运用杂交动力学原理，丰度高的单链DNA退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，使使不同丰度的单链不同丰度的单链DNA得到均衡得到均
22、衡；抑制；抑制PCR利用链内利用链内退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构,无法作无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，从而使的扩增，从而使目的基因得到富集、分离。目的基因得到富集、分离。n 方法方法 提取提取实验组和对照组实验组和对照组mRNAmRNA合成双链合成双链cDNAcDNA，经经识别识别 4 4 碱基的限制性内切酶切割碱基的限制性内切酶切割 实验组实验组cDNAcDNA平均分为平均分
23、为2 2份，分别连接份，分别连接2 2个接头个接头 进行进行2 2轮差减杂交和抑制性轮差减杂交和抑制性PCRPCR 获得富集的目的基因获得富集的目的基因 抑制性抑制性 差减杂交差减杂交 (SSH)SSH)流程图流程图 检测组检测组 (Tester)Tester)含目的基因含目的基因cDNAcDNA，加接头，加接头驱逐组驱逐组 (Driver)Driver)不含目的基因不含目的基因cDNAcDNA，不加接头，不加接头*接头接头含含PCR PCR 引物引物正向正向SSH:SSH:易感者易感者(Tester)+Tester)+不易感者不易感者(Driver)Driver)易感者特异表达或高表达基因易
24、感者特异表达或高表达基因 反向反向SSH:SSH:不易感者不易感者(Tester)+Tester)+易感者易感者(Driver)Driver)不易感者特异表达或高表达基因不易感者特异表达或高表达基因 抑制性差减杂交抑制性差减杂交(SSH)SSH)优点优点 采用两次差减杂交和采用两次差减杂交和PCRPCR，保证了高特保证了高特异性异性 (假阳性率可降至假阳性率可降至6 6););在杂交过程中可在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，获得低丰度差异表达使不同丰度基因均衡化，获得低丰度差异表达基因基因;操作相对简便，是目前分离新基因的主操作相对简便，是目前分离新基因的主要方法要方法 缺点缺点 起始材料需
25、要起始材料需要 g 级量级量mRNA;SSHSSH差减差减克隆片段较小，获取克隆片段较小，获取cDNAcDNA全长序列有一定难度全长序列有一定难度 抑制性差减杂交抑制性差减杂交(SSH)SSH)Elkeles A,et al.Elkeles A,et al.Mol Cell BiolMol Cell Biol 1999;19:2594-2600 1999;19:2594-2600 The c-The c-fosfos proto-oncogene is a target for transactivation by proto-oncogene is a target for transact
26、ivation by the p53 tumor suppressorthe p53 tumor suppressor 采用采用SSHSSH法证实法证实,在在p53p53介介导的细胞凋亡过程中，导的细胞凋亡过程中，c-c-fosfos是是p53p53转转录刺激的靶基因录刺激的靶基因,从而提供了这两种重要调控蛋白相互作用的直接从而提供了这两种重要调控蛋白相互作用的直接依据依据抑制性差减杂交抑制性差减杂交(SSH)SSH)n Kostic C and Shaw PH.Kostic C and Shaw PH.OncogeneOncogene 2000;19:3978-39872000;19:397
27、8-3987n Isolation and characterization of sixteen novel p53 Isolation and characterization of sixteen novel p53 response genesresponse genesn 通过通过SSHSSH比较了比较了p53p53缺失和含缺失和含p53p53的结肠癌细胞株间基因差异表的结肠癌细胞株间基因差异表达，发现达，发现1616个个p53p53依赖的下游靶基因依赖的下游靶基因 抑制性差减杂交抑制性差减杂交(SSH)SSH)基因表达系列分析基因表达系列分析(Serial Analysis of
28、Gene Expression,SAGE)是一种用于定量、高通量基因表达分析的实是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法验方法(Velculescu et al.,1995)。SAGE原理原理:分分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签（约（约9-14个碱基对），这些短的序列被连接、克隆个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因的表达丰度。基因的表达丰度。Serial analysis of gene expression(SAGE)技术流程技术流程反转录
29、反转录酶切酶切连接连接测序测序单条测序对单条测序对3040条条EST测序测序分析分析由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析：由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析：基因表达量分析、寻找新基因等等基因表达量分析、寻找新基因等等转基因技术转基因技术 指在生物基因组中带有插入或整合入指在生物基因组中带有插入或整合入的外源基因，生物个体能将它一传给的外源基因，生物个体能将它一传给后代，并表达出该基因的生物活性物后代，并表达出该基因的生物活性物质，从而使受体生物获得新的性状。质，从而使受体生物获得新的性状。Transgenic Animal Animal in which a segment o
30、f DNA has been physically inserted into the genome.The genome of all cells of the organism contains the DNA segment.The DNA segment is present in the germ line so it can be transmitted to progeny as a Mendelian trait.Retroviral Mediated Gene TransferMoMuLV Producing CellsMouseembryosInsertion of vir
31、al DNA containingtransgene into embryosTransgenic MouseX1-cell pronuclear stagemouse embryo.PMS+HCGto superovulate Pregnant Foster MotherOviduct Transfer+2-cell stage embryoHolding PipetteInjection Pipette基因敲除（基因敲除（Knock outKnock out）Step 1.Isolate developing embryo at blastocyst stage.This embryo i
32、s from a strain of mice with gray fur.Step 2.Remove embryonic stem cells from gray-fur blastocyst.Grow stem cells in tissue culture.Step 3.Transfect stem cells with homologous recombination construct.Select for homologous recombination by growing stem cells in neomycin and GCV.+neomycin+gancyclovirS
33、tep 4.Remove homologously recombined stem cells from petri dish and inject into a new blastocyst that would have only white fur.Step 5.Implant several chimeric blastocysts into pseudo-pregnant,white fur mouse.Step 6.Mother will give birth to a range of mice.Some will be normal white fur mice but oth
34、ers will be chimeric mice.Chimeric mice have many of their cells from the original white fur blastocyst but some of their cells will be derived from recombinant stem cells.Fur cells from recombinant stem cells produce gray patches which are easily detected.Step 7.Mate the chimeric mice with wild-typ
35、e white fur mice.If the gonads of the chimeric mice were derived from recombinant stem cells,all the offspring will have gray fur.Every cell in gray mice are heterozygous for the homologous recombination.Step 8.Mate heterozygous gray mice(+/H)and genotpye the gray offspring.Identify homozygous recom
36、binants(H/H)and breed them to produce a strain of mice with both alleles knocked out.The pure breeding mouse strain is a knockout mouse.knockout mouse核酶技术确定基因在疾病中的作用核酶技术确定基因在疾病中的作用1.RNA分子，催化核糖体RNA中内含子的自我拼接；除了催化RNA的剪切，还可催化DNA的剪切、RNA的聚合、RNA链的复制等。2.优点:其底物的碱基配对特异性。核酶与底物结合常形成“发夹”结构或“锤头”结构。3.设计核酶特异性地结合于靶点
37、，以其本身酶活性进行剪切。What is RNAi?RNA干扰（干扰（RNA interference，RNAi）内源性或外源性双链内源性或外源性双链RNA介导的细胞内介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。相应的功能表型的缺失现象。转录后基因表达抑制现象的发现转录后基因表达抑制现象的发现CHS GeneCHS Gene矮牵牛花矮牵牛花(Jorgensen,R,1990)RNAi现象的发现现象的发现线虫（线虫（C.elegans)C.elegans)(Fire,1998)+Par-1 Gene Disru
38、ptionExpressionDownDouble Strand RNA线线 虫，虫，果果 蝇蝇微生物，微生物，植植 物物 dsRNADicer cleavage of dsRNAsiRNARNAi 抑制基因表达的机理抑制基因表达的机理siRNA associatedWith RISC complexCell Membrane5POH3Target mRNARNA干扰干扰(RNA interference,RNAi)RNAi 是将一段双链的RNA 序列导入机体或细胞中,机体或细胞中与之有同源序列的基因的表达将会受到抑制,甚至表达受到完全抑制基因诱导超表达技术确定基因在疾病中的作用 将目的基因全
39、长序列与高活性启动子或组织将目的基因全长序列与高活性启动子或组织特异性启动子融合，经过转化后，在诱导特异性启动子融合，经过转化后，在诱导剂的作用下或在特定的组织细胞中，目的剂的作用下或在特定的组织细胞中，目的基因超表达，相应的基因表达产物大量积基因超表达，相应的基因表达产物大量积累。比较加入诱导剂前后的表型变化，从累。比较加入诱导剂前后的表型变化，从而确定目的基因在疾病发生中的作用。而确定目的基因在疾病发生中的作用。三、三、疾病相关基因的功能克隆和定位克隆疾病相关基因的功能克隆和定位克隆1 1 疾病相关基因疾病相关基因2 2 功能克隆功能克隆3 3 定位克隆定位克隆疾病相关基因与疾病 单基因病
40、(一个基因位点上的缺陷)多基因病(涉及两个以上的基因位点)染色体病(染色体结构与数目的改变)获得性基因病(遗传易感性或病原微生物)功能克隆(Functional cloning)以获得的蛋白质表达及功能信息为线索，以获得的蛋白质表达及功能信息为线索，分离鉴定出相应的基因，叫未知基因的分离鉴定出相应的基因，叫未知基因的功能克隆。功能克隆。基因克隆基因克隆（gene cloning)功能克隆功能克隆（functional cloning）-根据特异蛋白质分离目的基因的策略根据特异蛋白质分离目的基因的策略 表型克隆表型克隆（phenotype cloning）-根据特异根据特异mRNA 分离目的基因
41、的策略分离目的基因的策略 功能克隆功能克隆 氨基酸序列核苷酸序列氨基酸序列核苷酸序列PCR特异蛋白质特异蛋白质 目的基因目的基因 抗体抗体 基因文库筛选基因文库筛选评价评价优点优点 -在单基因性状的基因分离方面仍为在单基因性状的基因分离方面仍为常用常用策略策略缺点缺点 -特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难*-难以分离微量表达基因难以分离微量表达基因 -无法研究无无法研究无蛋白质蛋白质产物的基因产物的基因 -难以进行多基因控制性状的基因分离难以进行多基因控制性状的基因分离通过蛋白质的抗原抗体反应分离鉴定未知基因通过蛋白质的抗原抗体反应分离鉴定未知基因 基因转录后在核
42、糖体上翻译合成蛋白质，基因转录后在核糖体上翻译合成蛋白质，形成核糖体形成核糖体-mRNA-蛋白质产物部分氨基酸蛋白质产物部分氨基酸序列的复合体，运用抗体与蛋白质产物的序列的复合体，运用抗体与蛋白质产物的免疫共沉淀反应，可以分离此复合体，进免疫共沉淀反应，可以分离此复合体，进而分离到而分离到mRNA，最终克隆到未知基因最终克隆到未知基因。智力智力发育不全、严重发育不全、严重的呕吐，皮肤、的呕吐，皮肤、毛发颜色变浅，毛发颜色变浅，虹膜颜色减退、虹膜颜色减退、尿、汗有特殊腐尿、汗有特殊腐臭。臭。定位克隆定位克隆又称为又称为“逆向遗传学逆向遗传学”，始于始于2020世纪世纪8080年代后期年代后期利用
43、遗传连锁或细胞学利用遗传连锁或细胞学定位技术将致病基因定定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带。位于染色体的特定区带。定位：通过连锁分析找定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的遗传标记在染色体上的位置。的位置。克隆：从定位的染色体克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其基因，并进一步研究其功能。功能。疾病遗传标记，染色体定位基因序列mRNAcDNA蛋白质产物生物学功能 定位克隆：通过遗传标记定位克隆：通过遗传标记，先获得某一表型基因，先获得某一表型基因在染色体上的定位在染色体上的定位，再在候选区域内选择已知基
44、，再在候选区域内选择已知基因，进行致病突变的筛选因，进行致病突变的筛选，并获得，并获得cDNA及全基及全基因。因。基本思路基本思路是通过连锁分析原理进行基因是通过连锁分析原理进行基因定位定位。若多态标记与待定基因距离较远若多态标记与待定基因距离较远，则它们在，则它们在向子代传递时会发生自由分离向子代传递时会发生自由分离，呈，呈“连锁平衡连锁平衡”；反之；反之，则不发生自由分离，则不发生自由分离，而呈现，而呈现“共分离共分离”现象现象，即，即“连锁不平衡连锁不平衡”。据此可在染色体上定。据此可在染色体上定位与某一位与某一DNA标记相连锁的基因。标记相连锁的基因。1.将基因定位将基因定位于染色体于
45、染色体 特定区段特定区段2.候选基因筛候选基因筛选鉴定选鉴定 定位克隆的主要步骤之一是将目标定位克隆的主要步骤之一是将目标基因定位于特定染色体上。基因定位于特定染色体上。主要方法：主要方法：家系遗传调查分析法、染色体断裂点分析家系遗传调查分析法、染色体断裂点分析 （家系选择、分离分析、连锁分析家系选择、分离分析、连锁分析）体细胞杂交法体细胞杂交法 核酸杂交技术核酸杂交技术 突变分析技术突变分析技术 家系遗传分析法 选择一个含有40多个能提供信息的减数分裂事件的三代以上 的家系，要排除家系的异质性；除了对照基本遗传表型的各种表现型的几率外，还要考虑外显不全；以数学计算机模型模拟分析；选择一定的遗
46、传标记，进行基因分型，确定疾病基因在染色体上的位置。基因连锁分析基因连锁分析 连锁分析主要是应用限制酶片段长度多态性（连锁分析主要是应用限制酶片段长度多态性（RFLP）为）为遗传标志进行家系分析遗传标志进行家系分析 在人类基因组中，平均约在人类基因组中，平均约 200 bp可发生一对变异可发生一对变异（称为（称为中心突变中心突变）中心突变造成了序列上的多态性，不少序列多态性发生在限中心突变造成了序列上的多态性，不少序列多态性发生在限制酶识别位点上，产生了限制酶酶切位点的多态性制酶识别位点上，产生了限制酶酶切位点的多态性 用该限制酶水解用该限制酶水解 DNA就会产生长度不同的片段，称就会产生长度
47、不同的片段，称RFLP。定位候选克隆定位候选克隆该方法是定位克隆的进该方法是定位克隆的进一步发展一步发展将疾病相关基因定位于将疾病相关基因定位于染色体相关区域染色体相关区域该染色体区域得到若干该染色体区域得到若干候选基因候选基因进一步分析得到目的进一步分析得到目的cDNAcDNA蛋白质功能研究蛋白质功能研究疾病染色体定位若干候选基因确定目的基因蛋白质功能 cDNAcDNA筛选筛选染色体定位只是定位克隆的其染色体定位只是定位克隆的其中一步。由于中一步。由于DNADNA筛选、确认的困难筛选、确认的困难 ，是定，是定位克隆策略的位克隆策略的“瓶颈瓶颈”。目前获得基因序列的方法大致有目前获得基因序列的
48、方法大致有:(1)(1)对对 500kb 500kb 的关键部位进行直接测序；的关键部位进行直接测序；(2)(2)比较基因组作图和测序；比较基因组作图和测序；(3)(3)基因结构特征分析；基因结构特征分析；(4)cDNA(4)cDNA捕获，主要有捕获，主要有pGpG岛捕捉层析法、岛捕捉层析法、外显子捕捉法、直接筛选外显子捕捉法、直接筛选PCRPCR法等方法法等方法cDNAcDNA筛选筛选 直接法：用基因组直接法：用基因组DNADNA直接从直接从cDNAcDNA文库文库中筛选位于该基因组片段内的中筛选位于该基因组片段内的cDNAcDNA。选择法：将基因组选择法：将基因组DNADNA固定在膜上，与
49、固定在膜上，与总总cDNAcDNA或或cDNAcDNA文库的文库的PCRPCR产物杂交，找产物杂交，找到能杂交到膜上的到能杂交到膜上的cDNAcDNA片段，再用片段，再用PCRPCR扩增这些扩增这些cDNAcDNA片段。片段。通过通过EST拼接拼接 如：已知小鼠某基因在人当中有高度同源序列如：已知小鼠某基因在人当中有高度同源序列 用该小鼠用该小鼠cDNAcDNA比对人的比对人的ESTEST数据库数据库 得到一簇得到一簇ESTEST后，将相邻的后，将相邻的ESTEST通过相互重叠部通过相互重叠部分进行拼接。分进行拼接。得到人对应的完整得到人对应的完整cDNAcDNA的序列后，两端设计引的序列后，
50、两端设计引物在物在cDNAcDNA文库中进行文库中进行PCRPCR，得到该，得到该cDNAcDNA的克隆。的克隆。至此，与小鼠对应的人的该基因得以克隆出来。至此，与小鼠对应的人的该基因得以克隆出来。基因芯片技术的应用基因芯片技术的应用 使用传统方法寻找新基因，不仅需要投使用传统方法寻找新基因，不仅需要投入大量的资金，而且针对性不强，效率入大量的资金，而且针对性不强，效率低下，大部分工作繁琐重复低下，大部分工作繁琐重复。通过基因芯片分析正常组织和疾病组织通过基因芯片分析正常组织和疾病组织基因表达情况的差异，往往能够从那些基因表达情况的差异，往往能够从那些表达异常的基因中发现新的致病基因。表达异常
