1、抗抗 体体 酶酶（abzyme）（catalytic antibody）知知 识识 要要 点点1、什么是什么是抗体酶抗体酶？2、抗体抗体和和酶酶的特点比较的特点比较3、抗体酶的抗体酶的作用特点作用特点4、抗体酶的抗体酶的制备制备5、抗体酶的抗体酶的应用前景应用前景什么是什么是抗体酶抗体酶？在免疫球蛋白的在免疫球蛋白的易变区易变区赋予赋予酶的属性酶的属性，成为具，成为具有有催化活性的抗体催化活性的抗体生物学生物学与与化学化学的研究成果的研究成果在分子水平上在分子水平上交叉的交叉的产物产物抗体的抗体的多样性多样性+酶分子的酶分子的高效催化高效催化=新酶设计新酶设计酶反应酶反应过渡态类似物过渡态类似
2、物作为作为半抗原半抗原免疫动物产生有催化免疫动物产生有催化活性的抗体，采用活性的抗体，采用单克隆抗体技术单克隆抗体技术获得这种具有酶特获得这种具有酶特性的抗体。性的抗体。基本概念基本概念免疫免疫？抗体抗体？抗原抗原？半抗原半抗原？多克隆抗体多克隆抗体？单克隆抗体单克隆抗体？免疫系统和免疫球蛋白功能免疫系统和免疫球蛋白功能 免疫免疫是人类和脊椎动物最重要的防御机制，免疫系统能在分子水平上是人类和脊椎动物最重要的防御机制，免疫系统能在分子水平上识别识别“自我自我”和和“非我非我”，然后破坏那些被鉴定为非我的，然后破坏那些被鉴定为非我的成分成分。在生理水。在生理水平上免疫系统对入侵的反应或应答是多种
3、类型的蛋白质、分子和细胞之间平上免疫系统对入侵的反应或应答是多种类型的蛋白质、分子和细胞之间的一套复杂而协同的相互作用，的一套复杂而协同的相互作用，如果从如果从个别蛋白质水平个别蛋白质水平来看，来看，免疫反应免疫反应可可以看作是一种以看作是一种配体与蛋白质可逆结合的生化系统。配体与蛋白质可逆结合的生化系统。1抗原、抗体和免疫球蛋白的概念抗原、抗体和免疫球蛋白的概念2免疫球蛋白的类别免疫球蛋白的类别3免疫球蛋白结构和免疫系统免疫球蛋白结构和免疫系统4多克隆抗体和单克隆抗体多克隆抗体和单克隆抗体什么是什么是“免疫球蛋白免疫球蛋白”？(immunoglobulin)具有抗体活性的动物蛋白具有抗体活性
4、的动物蛋白,是一种糖蛋白。主要存在于是一种糖蛋白。主要存在于血浆中，也见于其他体液、组织和一些分泌液中。人血浆内的免疫球蛋白大血浆中，也见于其他体液、组织和一些分泌液中。人血浆内的免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白（多数存在于丙种球蛋白（-球蛋白）中。可分为球蛋白）中。可分为五类五类，即免疫球蛋白，即免疫球蛋白G G（IgG）、免疫球蛋白）、免疫球蛋白A A（IgA）、免疫球蛋白）、免疫球蛋白M M（IgM）、免疫球蛋白）、免疫球蛋白D D（IgD）和免疫球蛋白）和免疫球蛋白E E（IgE）。其中）。其中IgG是最主要的免疫球蛋白，约占人是最主要的免疫球蛋白，约占人血浆丙种球蛋白的血浆丙种球蛋白
5、的70%70%，分子量约，分子量约1515万，含糖万，含糖2 23%3%。IgGIgG分子由分子由4 4条肽链组条肽链组成。其中分子量为成。其中分子量为2.52.5万的肽链，称轻链，分子量为万的肽链，称轻链，分子量为5 5万的肽链，称重链。轻万的肽链，称重链。轻链与重链之间通过二硫键（链与重链之间通过二硫键（S SS S）相连接。免疫球蛋白是机体受抗原）相连接。免疫球蛋白是机体受抗原（如病原体）刺激后产生的，其主要作用是与抗原起免疫反应，生成抗原（如病原体）刺激后产生的，其主要作用是与抗原起免疫反应，生成抗原-抗体复合物，从而阻断病原体对机体的危害，使病原体失去致病作用。另一抗体复合物，从而阻
6、断病原体对机体的危害，使病原体失去致病作用。另一方面，免疫球蛋白有时也有致病作用。临床上的过敏症状如花粉引起的支气方面，免疫球蛋白有时也有致病作用。临床上的过敏症状如花粉引起的支气管痉挛，青霉素导致全身过敏反应，皮肤荨麻疹（俗称风疹块）等都是由免管痉挛，青霉素导致全身过敏反应，皮肤荨麻疹（俗称风疹块）等都是由免疫球蛋白制剂能增强人体抗病毒的能力，可作药用。如注射人血清或人胎盘疫球蛋白制剂能增强人体抗病毒的能力，可作药用。如注射人血清或人胎盘中提取的丙种球蛋白制剂可防治麻疹、传染性肝炎等传染病。中提取的丙种球蛋白制剂可防治麻疹、传染性肝炎等传染病。人免疫球蛋白的分类人免疫球蛋白的分类 IgG I
7、gA IgM IgD IgE重链类别重链类别轻链类别轻链类别 或或 或或 或或 或或 或或链的组成链的组成 2222n22522522n2222222222免疫球蛋白免疫球蛋白IgG的一级结构的一级结构 IgG结构 IgM的一级结构的一级结构IgG的空间结构的空间结构IgG与抗原形成与抗原形成 的交联晶格的交联晶格多克隆抗体和单克隆抗体多克隆抗体和单克隆抗体 如果给动物注射抗原如果给动物注射抗原,虽然抗原与各种抗体产生细胞的亲和虽然抗原与各种抗体产生细胞的亲和性有所不同性有所不同,但是还是有大量抗体产生细胞将与之结合但是还是有大量抗体产生细胞将与之结合,结果血结果血液中出现的抗体源于数种不同的
8、细胞克隆，这些抗体就是液中出现的抗体源于数种不同的细胞克隆，这些抗体就是多克多克隆抗体隆抗体（polyclonal antibodies）。如果可以分离到抗体产生细）。如果可以分离到抗体产生细胞的单克隆，然后使所有的抗体均来自同样的克隆，这样制备胞的单克隆，然后使所有的抗体均来自同样的克隆，这样制备的抗体称为的抗体称为单克隆抗体单克隆抗体（monoclonal antibodies）。）。由于单抗细胞的寿命有限，严重限制了单抗的常规制备。由于单抗细胞的寿命有限，严重限制了单抗的常规制备。1975年，年，Milsetein和和Kohler创建了不受限制地大量制备针对特创建了不受限制地大量制备针对
9、特异抗原的单抗技术，将可产生专一性抗体的异抗原的单抗技术，将可产生专一性抗体的B淋巴细胞与具有淋巴细胞与具有无限繁殖能力的恶性淋巴瘤细胞（骨髓瘤细胞）融合，融合体无限繁殖能力的恶性淋巴瘤细胞（骨髓瘤细胞）融合，融合体称为杂交瘤细胞，它既可以永久地培养，又可分泌大量的均一称为杂交瘤细胞，它既可以永久地培养，又可分泌大量的均一的抗体。由于用这个技术产生的抗体具有很高的专一性，现已的抗体。由于用这个技术产生的抗体具有很高的专一性，现已成为研究的常用工具。成为研究的常用工具。抗体抗体和和酶酶的特点比较的特点比较 酶酶 抗体抗体底物结合专一性 比较高 非常高非常高底物结合形变 容易变形 不易变形种类 比
10、较多 非常多非常多物质转变活性 高 无 如何将如何将抗体抗体转变成转变成酶？酶？19481948年年Linus Pauling提出了提出了酶的过渡态催化理酶的过渡态催化理论论,认为酶和底物结合认为酶和底物结合不是在基态上不是在基态上，因为酶与，因为酶与基态底物的结合十分困难，需要克服很大的能障。基态底物的结合十分困难，需要克服很大的能障。过渡态结构过渡态结构十分容易与酶结合，因为酶结构经过十分容易与酶结合，因为酶结构经过底物诱导等，亲和力最强。十分容易越过能障，底物诱导等，亲和力最强。十分容易越过能障，加速催化速度。加速催化速度。所以酶具有催化速度快和高选择性（专一性）所以酶具有催化速度快和高
11、选择性（专一性）在没有催化剂存在的情况下，能障（即活化能）是在没有催化剂存在的情况下，能障（即活化能）是S S和和S S之间的能量差。在有酶催化时，能障是之间的能量差。在有酶催化时，能障是ESES和和ESES间间的能量差。这种能量差越小，过渡态就越容易达到，过的能量差。这种能量差越小，过渡态就越容易达到，过渡态的浓度越高，反应速度就越快。渡态的浓度越高，反应速度就越快。ESES具有的自由能显然比具有的自由能显然比S S的低。的低。ESES与过渡态（与过渡态（ESES）是不同的概念。酶促反）是不同的概念。酶促反应速度由应速度由ESES和和ESES之间的能量差决定！这个差值之间的能量差决定！这个差
12、值越小，酶促反应速度就越快。越小，酶促反应速度就越快。在有催化剂存在下，在有催化剂存在下，ESES和和ESES之间的能量差显著减小之间的能量差显著减小 ESES复合物是不稳定的复合物是不稳定的，它容易解离成，它容易解离成 E ES S。在。在ESES复合物中，底物与酶的结合并不是处复合物中，底物与酶的结合并不是处于最适状态，即不是处于完全互补的状态。换于最适状态，即不是处于完全互补的状态。换句话说，酶活性部位的基团以及能与底物发生句话说，酶活性部位的基团以及能与底物发生弱的相互作用的氨基酸残基并未全部参与到同弱的相互作用的氨基酸残基并未全部参与到同底物的结合中去。底物的结合中去。只有当只有当E
13、SES进行转变，进入到进行转变，进入到转换态转换态ESES，才能使底物处于一种最适的结合，才能使底物处于一种最适的结合状态。状态。这就是说，这就是说，底物与过渡态的底物与过渡态的酶酶是互补的是互补的!应当注意！应当注意！转换态本身是不稳定的，但由转换态本身是不稳定的，但由于转换态与酶的互补结合是由众多的相互作用于转换态与酶的互补结合是由众多的相互作用所释放出的能量所释放出的能量(即所谓结合能即所谓结合能)使转换态变得使转换态变得稳定。稳定。在7080年代，W.P.Jencks预言，抗某个反应过抗某个反应过 渡态的抗体具有催化该反应的能力渡态的抗体具有催化该反应的能力。1975年前后，抗体酶处于
14、探索的开始阶段，一般 采用诱导法诱导法、引入法引入法进行尝试，一般效率很低效率很低，有的还测定不出活性有的还测定不出活性。主要原因是具有催化活性 的抗体太少，在大量的抗体中只有少数几个有活性，甚至都没有活性。1975年时，G.Kohler&C.Milstein 发明了单克单克 隆抗体技术后隆抗体技术后，就有了后来的抗体酶。1986年，美国的Schultz小组研究“对硝基苯酚磷酸胆碱脂（pNPPC）”相应的羧酸二酯水解反应的过渡态类似物时，推测用这个过渡态类似物作半抗原 这样的分析，后来的确从中 选出了两株有催化活性的单 克隆抗体,一株MOPC167的 水解速度达到了1.2x104倍。经过测定，
15、这个抗体 酶符合米氏方程，具有底物专一性需要一定的温 度等酶的催化特征。结果表明底物类似物的结构与抗体酶有关。结果表明底物类似物的结构与抗体酶有关。另一实验：合成一个含吡啶甲酸的磷酸酯化合物合成一个含吡啶甲酸的磷酸酯化合物 用这个用这个过渡态类似物过渡态类似物作半抗原免役小鼠，得到作半抗原免役小鼠，得到1212株单抗。株单抗。结果结果：3 3株有抗体酶活性，其中一株株有抗体酶活性，其中一株6D46D4能与半抗原能与半抗原分子结合外，还能催化不含吡啶甲酸的相应磷酸分子结合外，还能催化不含吡啶甲酸的相应磷酸酯化合物水解，速度快酯化合物水解，速度快10103 3倍，具有底物专一性和倍，具有底物专一性
16、和对对pHpH的依赖性。的依赖性。用半抗原可以竞争性地抑制这个反应。用半抗原可以竞争性地抑制这个反应。还发现单抗的结合位点的氨基酸改变，可以还发现单抗的结合位点的氨基酸改变，可以影响它的催化活性。影响它的催化活性。后来，有了成功的经验后，抗体酶的研究文后来，有了成功的经验后，抗体酶的研究文章越来越多。章越来越多。抗体酶的作用特点：抗体酶的作用特点：在在专一性专一性方面方面超过或相当于超过或相当于我们讲的普通酶。我们讲的普通酶。在在反应速度反应速度方面接近普通酶，目前在总体上要方面接近普通酶，目前在总体上要低一些低一些。原因：原因：抗体酶没有抗体酶没有结构诱导结构诱导等动态变化；等动态变化；产物
17、释放困难；产物释放困难；底物、产物的交换困难。底物、产物的交换困难。抗体酶的抗体酶的制备制备一、酶蛋白诱导法一、酶蛋白诱导法二、半抗原诱导法二、半抗原诱导法三、抗体分子修饰法（引入法）三、抗体分子修饰法（引入法）O C A.酯酶的底酯酶的底 物物酯酯B.酯的羧基碳酯的羧基碳原子受到亲核原子受到亲核攻击形成四面攻击形成四面体过渡态体过渡态C.设计的磷酸设计的磷酸酯类似物酯类似物,作作为抗原去免疫为抗原去免疫实验动物实验动物磷酸酯类似物磷酸酯类似物(半抗原半抗原)对酯水解反应有催化对酯水解反应有催化作用的单克隆作用的单克隆抗体抗体免疫免疫免疫反应免疫反应诱导法制备具有诱导法制备具有酯酶活性酯酶活性
18、的抗体的抗体 酶蛋白诱导法（拷贝法）酶蛋白诱导法（拷贝法）用用已知的酶已知的酶作为作为抗原抗原对动物进行第一次免疫对动物进行第一次免疫,获得获得该酶该酶的抗体的抗体;再用这种抗体作为抗原进行第二次免疫获得再用这种抗体作为抗原进行第二次免疫获得抗抗抗体抗体,抗抗体实际上就是具有原来酶活性的抗体酶。抗抗体实际上就是具有原来酶活性的抗体酶。优点优点:可以大量生产单克隆的抗体酶可以大量生产单克隆的抗体酶缺点缺点:有相当大的盲目性和偶然性，并不能产生新酶。有相当大的盲目性和偶然性，并不能产生新酶。酶酶第一次免疫第一次免疫抗酶抗体抗酶抗体第二次免疫第二次免疫抗体酶抗体酶拷贝法制备抗体酶拷贝法制备抗体酶 半
19、抗原诱导法（细胞融合法）半抗原诱导法（细胞融合法）先用特定的半抗原(过渡态底物决定)与载体蛋白相连(如牛血清白蛋白等)。此 偶联的物质作为抗原 免疫动物，产生抗体 产生抗体的脾脏细胞与骨髓融合，然后在体外培养，杂交体克隆化，然后繁殖成单一细胞或菌落单一细胞或菌落产生抗体。用标准单克隆抗体技术来制备、分离、筛选抗体酶关键关键：用什么样的抗原才能诱导出具有特定的酶催化功能的抗体？即由抗体向酶即由抗体向酶 的转变过程的转变过程。aa过渡态类似物过渡态类似物载体蛋白载体蛋白抗体酶抗体酶半抗原诱导法制备抗体酶半抗原诱导法制备抗体酶引入法引入法(辅助因子辅助因子）：是用选择性的化学修饰、基因工程或者蛋白质
20、工程方法，将催化是用选择性的化学修饰、基因工程或者蛋白质工程方法，将催化基团和辅助因子引入抗体的抗原结合部位。基团和辅助因子引入抗体的抗原结合部位。SchultzSchultz等人在等人在IgAMOP315抗体结合部位选择性引入抗体结合部位选择性引入巯基巯基，然后，然后用亲和色谱纯化。结果：它水解香豆酯的速度比对照高用亲和色谱纯化。结果：它水解香豆酯的速度比对照高6 610104 4倍倍酶的活性中心很多有酶的活性中心很多有金属离子金属离子。LernerLerner等将金属离子引入抗体酶，等将金属离子引入抗体酶，成功地催化了肽键的选择性水解。他们用三乙撑胺成功地催化了肽键的选择性水解。他们用三乙
21、撑胺CoCo3+3+盐作为金盐作为金属离子辅因子，半抗原分子带有一肽键属离子辅因子，半抗原分子带有一肽键,通过羧酸根及仲胺基与通过羧酸根及仲胺基与金属离子相连金属离子相连,再共价连接在载体蛋白上，免疫动物后产生的抗再共价连接在载体蛋白上，免疫动物后产生的抗体，在金属离子复合物作为辅因子的参与下，这些抗体酶能选择体，在金属离子复合物作为辅因子的参与下，这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键，其转化数达性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键，其转化数达6 610104 4。吸毒是一个困绕着很多国家的难题，尤其是吸毒上吸毒是一个困绕着很多国家的难题，尤其是吸毒上瘾后很难戒掉。目前，直接拮抗可卡因上瘾
22、的抗体瘾后很难戒掉。目前，直接拮抗可卡因上瘾的抗体还没有找到。还没有找到。替换的方法是阻断可卡因、鸦片和受体的结合。虽替换的方法是阻断可卡因、鸦片和受体的结合。虽说抗鸦片的抗体能有效拮抗注射海洛因上瘾的猴子，说抗鸦片的抗体能有效拮抗注射海洛因上瘾的猴子，然而由于抗体和抗原形成复合物后不能再生，必须然而由于抗体和抗原形成复合物后不能再生，必须使用高剂量的抗体使用高剂量的抗体,使这一应用受到限制。使这一应用受到限制。抗体酶则不一样，不但能和抗原结合，而且能使抗抗体酶则不一样，不但能和抗原结合，而且能使抗原水解而再生，这不但能减少抗体酶的用量，也能原水解而再生，这不但能减少抗体酶的用量，也能减少抗体
23、酶的免疫原性。因此比其它抗体临床应用减少抗体酶的免疫原性。因此比其它抗体临床应用前景更好。前景更好。抗体酶用于戒毒抗体酶用于戒毒LandryLandry等用可卡因水解的等用可卡因水解的过渡态类似物过渡态类似物-磷酸单酯磷酸单酯为半抗原为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多，水解后的可卡因片断失去了可卡因刺激功能。不多，水解后的可卡因片断失去了可卡因刺激功能。因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾，达到戒毒目
24、的。上瘾，达到戒毒目的。酶活性的调节酶活性的调节一、一、共价修饰酶共价修饰酶活性的调节活性的调节二、二、酶原酶原活性的调节活性的调节三、三、同工酶同工酶与酶活性调节与酶活性调节四、四、激活剂激活剂和和抑制剂抑制剂对酶活性的调节（略）对酶活性的调节（略）共价修饰酶活性的调节共价修饰酶活性的调节 某些酶可以通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共某些酶可以通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。这类酶称为。这类酶称为共价修饰酶共价修饰酶。目前发现有数百种酶被翻译后都要。目前发现有数百种
25、酶被翻译后都要进行共价修饰，其中一部分处于分支代谢途径，成为对代谢流进行共价修饰，其中一部分处于分支代谢途径，成为对代谢流量起调节作用的量起调节作用的关键酶或限速酶关键酶或限速酶。由于这种调节的生理意义广泛，反应灵敏，节约能量，机制多样，在体由于这种调节的生理意义广泛，反应灵敏，节约能量，机制多样，在体内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联放大反应，内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联放大反应，所以日益引人注目。所以日益引人注目。AP1GEDCBHEa-bEc-dEc-g关键酶（限速酶）关键酶（限速酶）P2蛋白激酶蛋白激酶ATPADP蛋白质蛋白质蛋白质蛋白
26、质Pn蛋白磷酸酶蛋白磷酸酶nPiH2O反应类型反应类型 共价修饰共价修饰 被修饰的氨基酸残基被修饰的氨基酸残基共共价价修修饰饰反反应应的的例例子子磷酸化磷酸化腺苷酰化腺苷酰化尿苷酰化尿苷酰化Tyr,Ser,Thr.HisTyrTyr甲基化甲基化GluS-腺苷腺苷-MetS-腺苷腺苷-同型同型 Cys糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶的结构和作用机制的结构和作用机制 糖原磷酸化酶是由两个相同的亚基构成的二糖原磷酸化酶是由两个相同的亚基构成的二聚体，每个亚基都有一个大的聚体，每个亚基都有一个大的N-端结构域（端结构域（484个个残基）和一个小的残基）和一个小的C-端结构域。端结构域。级联系统调控级联系统调控
27、糖原分解示意图糖原分解示意图意义意义：由于由于酶的共价修饰酶的共价修饰反应是酶促反反应是酶促反应应，只要有少，只要有少量信号分子量信号分子（如激素）存（如激素）存在，即可通过在，即可通过加速这种酶促加速这种酶促反应，而使大反应，而使大量的另一种酶量的另一种酶发生化学修饰，发生化学修饰，从而获得放大从而获得放大效应。这种调效应。这种调节方式快速、节方式快速、效率极高。效率极高。肾上腺素或肾上腺素或胰高血糖素胰高血糖素1、腺苷酸环化酶、腺苷酸环化酶（无活性）（无活性）腺苷酸环化酶（活性）腺苷酸环化酶（活性）2、ATPcAMPR、cAMP3、蛋白激酶、蛋白激酶（无活性）（无活性）蛋白激酶（活性）蛋白
28、激酶（活性）4、磷酸化酶激酶、磷酸化酶激酶（无活性）（无活性）磷酸化酶激酶（活性）磷酸化酶激酶（活性）5、磷酸化酶、磷酸化酶 b（无活性）（无活性）磷酸化酶磷酸化酶 a（活性）（活性）6、糖原、糖原6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖1-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖葡萄糖葡萄糖血液血液ATP ADPATP ADP肾上腺素或肾上腺素或胰高血糖素胰高血糖素132 102 104 106 108葡萄糖葡萄糖456（极微量）（极微量）（大量）（大量）糖 原 磷 酸糖 原 磷 酸化酶以两种构化酶以两种构象状态存在，象状态存在，即有活性的即有活性的R R态 和 低 活 性态 和 低 活 性(或无活性或无活性)的的T T态。态
29、。AMP启启动向动向R R态构象态构象转变，而转变，而ATPATP、葡萄糖葡萄糖-6-6-磷磷酸等则有利于酸等则有利于向低活性的向低活性的T T态转换。态转换。糖原磷酸化酶和糖原合酶的别构调节糖原磷酸化酶和糖原合酶的别构调节糖原磷酸化和糖原合酶的共价修饰调节糖原磷酸化和糖原合酶的共价修饰调节 糖原磷酸化酶存在两种形式，即低活性的磷酸化酶糖原磷酸化酶存在两种形式，即低活性的磷酸化酶b b和 有 活 性 的和 有 活 性 的磷酸化酶磷酸化酶a,a,相 应 的相 应 的“转转换 酶换 酶”能 将能 将低活性的低活性的b b形形式 转 变 成 有式 转 变 成 有活性的活性的a a形式。形式。这 种
30、转 换 涉这 种 转 换 涉及 到 磷 酸 化及 到 磷 酸 化的 共 价 修 饰的 共 价 修 饰机制机制.共价修饰调节共价修饰调节也是也是GS活性调节的一种活性调节的一种重要的方式。重要的方式。GS的共价修饰调节是的共价修饰调节是通过腺通过腺苷酸化苷酸化（降低或失去活性）和（降低或失去活性）和去腺苷酸化去腺苷酸化（恢复活性）来实现的。（恢复活性）来实现的。GS的腺苷酸化是的腺苷酸化是由腺苷酰基转移酶催化的。由腺苷酰基转移酶催化的。GS亚基亚基397位的位的Tyr残基的腺苷酸化，增大了对累积方式反残基的腺苷酸化，增大了对累积方式反馈抑制的敏感性，因而使馈抑制的敏感性，因而使GS的活性降低。的
31、活性降低。GS的活性降低取决于它的腺苷酸化的程度。的活性降低取决于它的腺苷酸化的程度。腺苷酰基转移酶与一种叫做腺苷酰基转移酶与一种叫做P的四聚体蛋的四聚体蛋白形成一种复合物（白形成一种复合物（图图）。当）。当P尿苷酸化时，尿苷酸化时，该复合物使该复合物使GS去腺苷酸化。当去腺苷酸化。当P失去尿苷酸失去尿苷酸时，该复合物使时，该复合物使GS腺苷酸化。腺苷酸化。P尿苷酸化的尿苷酸化的水平又取决于同一蛋白上的尿苷酰基转移酶水平又取决于同一蛋白上的尿苷酰基转移酶（它使（它使P尿苷酸化）和去尿苷酰基酶（它使尿苷酸化）和去尿苷酰基酶（它使P去尿苷酸化）两种酶的相对活性。去尿苷酸化）两种酶的相对活性。尿苷酰
32、基尿苷酰基转移酶的活性可被转移酶的活性可被-酮戊二酸和酮戊二酸和ATP激活，但可激活，但可被被Gln和和Pi抑制。抑制。去尿苷酰基酶对这些代谢物是去尿苷酰基酶对这些代谢物是不敏感的。不敏感的。这种代谢级联反映这种代谢级联反映E.coli GS对细胞对细胞氮素的需要极端灵敏。氮素的需要极端灵敏。腺苷酰基腺苷酰基转移酶转移酶尿苷酰尿苷酰基转移基转移酶酶 酶原的激活酶原的激活1.1.酶原酶原生物体自身合成的、没有活性的生物体自身合成的、没有活性的 酶前体。酶前体。2.2.酶原的激活酶原的激活酶原在一定条件下，从无酶原在一定条件下，从无 活性转变成有活性的过程。活性转变成有活性的过程。3.3.酶原激活
33、机制酶原激活机制切除某一肽段切除某一肽段4.4.酶原激活的生理意义酶原激活的生理意义 （1 1）避免对细胞的自身消化）避免对细胞的自身消化 （2 2）酶原到达特定部位才发挥作用）酶原到达特定部位才发挥作用胰蛋白酶原胰蛋白酶原胰蛋白酶胰蛋白酶六肽六肽肠肠激激酶酶活性中心活性中心胰蛋白酶原的激活示意图胰蛋白酶原的激活示意图 从无从无活性的活性的蛋白质蛋白质原或酶原或酶原转变原转变成有活成有活性的蛋性的蛋白质或白质或酶的过酶的过程即称程即称激活或激活或活化。活化。酶原的激活酶原的激活（胰凝乳蛋白酶原激活过程）（胰凝乳蛋白酶原激活过程）激活的关键是激活的关键是选择性地切断了选择性地切断了Arg15和和
34、Ile16之间的肽键之间的肽键，使使Ile16游离游离。在中性条件下在中性条件下，Ile16的的NH3能和能和Asp194的的COO通过静电作用形成离子键通过静电作用形成离子键，有助于有助于Ser195和和His57之间以之间以及及His57和和 Asp102之间通过氢键形成一个之间通过氢键形成一个“电荷转接系统电荷转接系统”，使使Ser195的侧链具有更强的亲核性，有利于和底物进行作用，于是的侧链具有更强的亲核性，有利于和底物进行作用，于是就表现出胰凝乳蛋白酶的完整的催化功能。就表现出胰凝乳蛋白酶的完整的催化功能。胰蛋白酶原胰蛋白酶原胰蛋白酶胰蛋白酶六肽六肽肠肠激激酶酶胰蛋白酶对各种胰脏蛋白
35、酶的激活作用胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶原弹性蛋白酶原弹性蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶原羧肽酶羧肽酶.酶的多种分子形式酶的多种分子形式同工酶同工酶概念：概念：存在于同一种属或不同种属，同一个体的不同组织或同一存在于同一种属或不同种属，同一个体的不同组织或同一组织，同一细胞的不同亚单位，具有不同分子形式（结构、分子量组织，同一细胞的不同亚单位，具有不同分子形式（结构、分子量、等电点），但却能催化相同的化学反应的一组酶，称之为、等电点），但却能催化相同的化学反应的一组酶，称之为同工同工酶酶（isoenzymeisoenzyme）
36、。）。乳酸脱氢酶是研究得最多的同工酶。乳酸脱氢酶是研究得最多的同工酶。生物学功能：生物学功能：遗传的标志遗传的标志 和个体发育及组织分化密切相关和个体发育及组织分化密切相关 适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要乳酸脱氢酶同工酶形成示意图乳酸脱氢酶同工酶形成示意图多肽多肽亚基亚基mRNA四聚体四聚体结构基因结构基因a b乳酸脱氢酶同乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱工酶电泳图谱+H4MH3M2H2M3HM4点样线点样线不同组织中不同组织中LDH同工酶的电泳图谱同工酶的电泳图谱LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M
37、4)心肌心肌 肾肾 肝肝 骨骼肌骨骼肌 血清血清-+原点原点同工酶在各学科中的应用同工酶在各学科中的应用 (1)遗传学和分类学遗传学和分类学：提供了一种精良的判别遗传标志的工具。：提供了一种精良的判别遗传标志的工具。(2)发育学发育学：有效地标志细胞类型及细胞在不同条件下的分化情：有效地标志细胞类型及细胞在不同条件下的分化情况，以及个体发育和系统发育的关系。况，以及个体发育和系统发育的关系。(3)生物化学和生理学生物化学和生理学：根据不同器官组织中同工酶的动力学、：根据不同器官组织中同工酶的动力学、底物专一性、辅助因子专一性、酶的变构性等性质的差异，从而底物专一性、辅助因子专一性、酶的变构性等
38、性质的差异，从而解释它们代谢功能的差别。解释它们代谢功能的差别。（4）医学和临床诊断医学和临床诊断：体内同工酶的变化，可看作机体组织损：体内同工酶的变化，可看作机体组织损伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。同一种酶的不同的同工酶在对底物的亲同一种酶的不同的同工酶在对底物的亲和力和和力和Vmax以及对产物所造成的抑制作用的以及对产物所造成的抑制作用的敏感性等通常都是不同的，这反映出代谢上敏感性等通常都是不同的，这反映出代谢上的需要。谷氨酰胺合成酶的需要。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)是氮素代谢中的一种重要的是氮素代谢中
39、的一种重要的酶，该酶催化依赖于酶，该酶催化依赖于ATP、由谷氨酸和、由谷氨酸和NH4合成谷氨酰胺的反应。在高等植物的叶片中，合成谷氨酰胺的反应。在高等植物的叶片中，大多存在两种不同类型的大多存在两种不同类型的GS同工酶，即胞质同工酶，即胞质型的型的GS1和叶绿体型的和叶绿体型的GS2。这两种同工酶。这两种同工酶在发育上以及在代谢中起着非重叠的作用。在发育上以及在代谢中起着非重叠的作用。酶酶 生生 物物 合合 成成 的的 调调 节节 操纵子模型操纵子模型（原核生物）（原核生物）原核生物酶生物合成调节的必要性原核生物酶生物合成调节的必要性生活环境生活环境变化大、变化大、食物供应食物供应无保证无保证
40、根据环境条件合成不同的蛋白质根据环境条件合成不同的蛋白质代谢与环境变化适应、维持生存与繁衍代谢与环境变化适应、维持生存与繁衍组成型酶组成型酶适应型酶适应型酶原核生物原核生物酶生物合成调节的酶生物合成调节的总体原则总体原则负责某个负责某个代谢过程的酶体系往往代谢过程的酶体系往往在需要时打开在需要时打开，而而不需要时则关闭不需要时则关闭，构成一个，构成一个基因表达调控基因表达调控的的“开关开关”系统系统。基因表达基因表达？基因表达调控基因表达调控？转录水平转录水平 mRNA加工成熟水平加工成熟水平 翻译水平翻译水平 翻译后水平？翻译后水平？营养状况、环境因素、激素水平、发育阶段营养状况、环境因素、
41、激素水平、发育阶段原核生物（细菌）原核生物（细菌）真核生物（动物）真核生物（动物）转录水平转录水平的调节的调节至关重要至关重要 1、代谢产物代谢产物对酶基因表达的调节对酶基因表达的调节 2、弱化弱化/衰减子衰减子对酶基因表达的调节对酶基因表达的调节 3、降解物降解物对酶基因表达的调节对酶基因表达的调节调节物与调节物与DNA结合结合?正调节正调节负调节负调节是是 开启开启 关闭关闭 否否 关闭关闭 开启开启代谢产物调节代谢产物调节（1）可诱导调节可诱导调节酶基因在特殊代谢物或化合物的作用下酶基因在特殊代谢物或化合物的作用下由原来的由原来的关闭状态转变为工作状态关闭状态转变为工作状态，即在某些物质
42、的诱导，即在某些物质的诱导下使基因活化（进入转录状态）。下使基因活化（进入转录状态）。大肠杆菌大肠杆菌乳糖操纵子乳糖操纵子（2）可阻遏调节可阻遏调节原来处于工作状态原来处于工作状态（合成相关代谢酶）的基因由（合成相关代谢酶）的基因由于受到某种特殊代谢物或化合物积累的影响而于受到某种特殊代谢物或化合物积累的影响而关关闭闭，即在某些物质的作用下基因去活化（停止转，即在某些物质的作用下基因去活化（停止转录）录）大肠杆菌大肠杆菌色氨酸操纵子色氨酸操纵子弱化子调节弱化子调节信号分子：具有特殊负载的氨酰信号分子：具有特殊负载的氨酰tRNAtRNA弱化子：操纵子被阻遏，弱化子：操纵子被阻遏，mRNA合成被终
43、止合成被终止时，起转录终止信号作用的核苷酸序列。时，起转录终止信号作用的核苷酸序列。酶酶的的诱诱导导和和阻阻遏遏操操纵纵子子模模型型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因操纵基因启动基因启动基因调节基因调节基因结构基因结构基因 阻遏蛋白阻遏蛋白(有活性有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达结构基因不表达诱导物诱导物诱导物与阻遏蛋白结合诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用到阻挡操纵基因的作用,结构基因可
44、以表达结构基因可以表达酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合阻遏蛋白不能跟操纵基因结合,结构基因可以表达结构基因可以表达阻遏蛋白阻遏蛋白(无活性无活性)酶蛋白酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达结构基因不表达代谢产物代谢产物 根据细菌酶的合成对环境的反应不同，酶的合成可分为两种根据细菌酶的合成对环境的反应不同，酶的合成可分为两种类型：组成酶和适应酶。适应酶可分为诱导酶和阻遏酶。类型：组成酶和适应酶。适应酶可分为诱导酶和阻遏酶。19611961年，年，法国科学家法国科学家JacobJaco
45、b和和MonodMonod根据酶合成的诱导和阻遏根据酶合成的诱导和阻遏的现象，提出了操纵子（的现象，提出了操纵子（operonoperon）模型。操纵子是指编码一特定）模型。操纵子是指编码一特定代谢途径酶的结构基因和控制这些基因转录的控制顺序所构成的代谢途径酶的结构基因和控制这些基因转录的控制顺序所构成的转录单位。（这样的转录单位在原核生物中即称为操纵子。）转录单位。（这样的转录单位在原核生物中即称为操纵子。）一一)乳糖操纵子（乳糖操纵子（laclac operon operon）是酶诱导合成的例子）是酶诱导合成的例子1.1.乳糖操纵子的组织结构乳糖操纵子的组织结构结构基因：结构基因：Z Z基
46、因基因编码编码半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。Y Y基因基因编码半乳糖苷透过酶编码半乳糖苷透过酶 A A基因基因编码硫代半乳糖苷转乙酰基酶编码硫代半乳糖苷转乙酰基酶操纵基因操纵基因（operatoroperator）:是阻遏蛋白结合部位。是阻遏蛋白结合部位。启动基因启动基因（又称启动子，（又称启动子，promoterpromoter）:是是RNARNA聚合酶结合的部位。聚合酶结合的部位。2.2.乳糖操纵子的调节乳糖操纵子的调节 在含有在含有GlucoseGlucose作为碳源的培养基中培养作为碳源的培养基中培养E.coliE.coli时，时，调节基因（调节基因（i i）表达的产物阻遏蛋白结合到操纵基因
47、上，）表达的产物阻遏蛋白结合到操纵基因上，阻止阻止RNARNA聚合酶对结构基因的转录。与乳糖利用有关的聚合酶对结构基因的转录。与乳糖利用有关的酶不能合成。酶不能合成。（这时合成与乳糖利用有关的酶则是一种浪费）。（这时合成与乳糖利用有关的酶则是一种浪费）。在以乳糖为唯一碳源时，乳糖或它的异构体别乳糖在以乳糖为唯一碳源时，乳糖或它的异构体别乳糖（1,61,6allolactoseallolactose）作为效应物，与阻遏蛋白结合，）作为效应物，与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象发生改变，失去与操纵基因结合的能力使阻遏蛋白构象发生改变，失去与操纵基因结合的能力,从而丧失抑制活性从而丧失抑制活性,解除了对
48、结构基因的转录的抑制。解除了对结构基因的转录的抑制。这里乳糖就作为一种诱导物，诱导与乳糖代谢有关酶的这里乳糖就作为一种诱导物，诱导与乳糖代谢有关酶的表达。表达。大大肠肠杆杆菌菌乳乳糖糖操操纵纵子子模模型型调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 关关 闭闭启启动动子子ORPLacZLacYLaca调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因启启动动子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白（无活性）（无活性）基基 因因 表表达达mRNAA、乳糖操纵子的结构、乳糖操纵子的结
49、构B、乳糖酶的诱导、乳糖酶的诱导 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏 当当E.coli在含有在含有Glucose的培养基中生长的培养基中生长时，培养基中即使含有乳糖，在时，培养基中即使含有乳糖，在Glucose被用完之前，是不会产生与乳糖利用有关被用完之前，是不会产生与乳糖利用有关的酶的，这种效应称为的酶的，这种效应称为Glucose效应或分效应或分解代谢物阻遏。解代谢物阻遏。因为乳糖操纵子的启动子可分为两部分：因为乳糖操纵子的启动子可分为两部分：RNARNA聚合酶结合部位聚合酶结合部位:富含富含ATAT对，并在它的侧翼富含对，并在它的侧翼富含GCGC对
50、对CAPCAP（or CRPor CRP）识别）识别/结合部位结合部位:富含富含GCGC对，且是回文结构对，且是回文结构。CAPCAP叫做分解代谢物基因活化蛋白（叫做分解代谢物基因活化蛋白（CRPCRP称为称为cAMPcAMP受体蛋白）它受体蛋白）它能能使使GCGC对变得不稳定，可促进对变得不稳定，可促进ATAT对分开，从而有利于转录对分开，从而有利于转录。但但CAPCAP的活性受的活性受cAMPcAMP水平的调节。当水平的调节。当cAMPcAMP与与CAPCAP结合后才能使结合后才能使CAPCAP同启动子的同启动子的CAPCAP结合部位结合。结合部位结合。C CAMPAMP的水平受的水平受G
