1、生物制药工艺学实验南京师范大学生命科学学院南京师范大学生命科学学院20152015年年3 3月月从蛋清中提取溶菌酶实验流程实验流程 柱层析前的准备工作柱层析前的准备工作 离子交换层析法从蛋清中初步提取溶菌酶离子交换层析法从蛋清中初步提取溶菌酶 超滤法进一步分离纯化溶菌酶和盐析法浓缩、透析法除超滤法进一步分离纯化溶菌酶和盐析法浓缩、透析法除盐盐 SDS-PAGESDS-PAGE法检测溶菌酶的纯度法检测溶菌酶的纯度 测定溶菌酶的活力和冷冻干燥溶菌酶测定溶菌酶的活力和冷冻干燥溶菌酶实验一、柱层析前的准备工作实验一、柱层析前的准备工作实验目的：实验目的：1.1.掌握离子交换树脂预处理的方法；掌握离子交
2、换树脂预处理的方法；2.2.掌握离子交换层析柱装填的方法。掌握离子交换层析柱装填的方法。实验材料实验材料1.1.树脂：树脂：724724型阳离子交换树脂型阳离子交换树脂2.2.层析柱层析柱:1.6cm1.6cm30cm30cm3.3.溶液：溶液：0.1M NaOH0.1M NaOH，0.1M0.1M HClHCl4.4.其他材料：其他材料：布氏漏斗，抽滤瓶，铁架台，恒流泵，核酸布氏漏斗，抽滤瓶，铁架台，恒流泵，核酸蛋白检测仪等蛋白检测仪等实验原理实验原理 离子交换树脂及其预处理离子交换树脂及其预处理 离子交换层析系统的组装离子交换层析系统的组装 离子交换层析的参数离子交换层析的参数背景知识离子
3、交换树脂结构离子交换树脂结构骨架：骨架：接有功能基团，本身是惰接有功能基团，本身是惰性性功能基团：功能基团：连接在骨架上，可与连接在骨架上，可与相反离子结合相反离子结合活性离子：活性离子：与功能基团所带电荷与功能基团所带电荷相反的可移动的离子相反的可移动的离子待交换分子：待交换分子：在吸附阶段可与活在吸附阶段可与活性离子交换，与骨架上的功能基性离子交换，与骨架上的功能基团结合团结合实验原理实验原理 724724型阳离子交换树脂型阳离子交换树脂 骨架：骨架：丙烯酸型；丙烯酸型；功能基团：功能基团：羧基；羧基；pK4.5；适用的适用的pH范围：范围：pH514；系弱酸性阳离子交换剂，所以系弱酸性阳
4、离子交换剂，所以 交换容量随缓冲液交换容量随缓冲液pH值的变化而变化，值的变化而变化，pH7时，交换时，交换容量是容量是8.0mmol/g；Na型树脂比型树脂比H型树脂更容易与溶菌酶进行交换。型树脂更容易与溶菌酶进行交换。树脂的预处理树脂的预处理 树脂的再生树脂的再生 钠型阳树脂可用钠型阳树脂可用23M 23M NaClNaCl溶液再生；溶液再生；氢型阳树脂用强酸再生，如盐酸。氢型阳树脂用强酸再生，如盐酸。若有强吸附物则可用若有强吸附物则可用0.1N 0.1N NaOHNaOH溶液洗树脂；若有脂溶溶液洗树脂；若有脂溶性物质则可先用非离子型去污剂或者乙醇洗树脂然后再性物质则可先用非离子型去污剂或
5、者乙醇洗树脂然后再生。生。l转型：转型：树脂在去杂后，为了发挥其交换性能，按树脂在去杂后，为了发挥其交换性能，按照使用要求人为地赋予活性离子的过程。照使用要求人为地赋予活性离子的过程。弱酸或者弱碱性树脂：弱酸或者弱碱性树脂：用碱（用碱（NaOHNaOH）或者酸（）或者酸（HClHCl）转型；转型；强酸或者强碱性树脂：强酸或者强碱性树脂：除了碱、酸还可用除了碱、酸还可用NaClNaCl溶溶液转型。液转型。层析的装置层析的装置 层析的参数层析的参数 柱床体积：柱床体积：离子交换树脂装柱后，从柱的底离子交换树脂装柱后，从柱的底 板到树脂沉积表面的体积。板到树脂沉积表面的体积。计算方法：计算方法：柱床
6、体积横截面积柱床体积横截面积高度高度实验内容实验内容 预处理预处理724724型阳离子交换树脂型阳离子交换树脂 装填层析柱装填层析柱 配制磷酸钠缓冲液配制磷酸钠缓冲液 平衡离子交换树脂平衡离子交换树脂预处理预处理724724型阳离子交换树脂型阳离子交换树脂 碱酸碱的方法（碱酸碱的方法（NaNa型）型）每次用每次用0.1N0.1N NaOHNaOH或者或者0.1N HCl0.1N HCl溶液溶液（体积约为树脂的（体积约为树脂的2323倍）浸泡树脂倍）浸泡树脂1015min1015min后，都要用蒸馏水将碱液、酸后，都要用蒸馏水将碱液、酸液冲洗掉。液冲洗掉。实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤 装填离
7、子交换层析柱（重力沉降法）装填离子交换层析柱（重力沉降法）1.1.固定层析柱，保持层析柱固定层析柱，保持层析柱垂直垂直；2.2.将蒸馏水倒入层析柱中，以将蒸馏水倒入层析柱中，以排出管道中的空气排出管道中的空气，当蒸馏水高度约为层析柱高的一半时，将层析柱当蒸馏水高度约为层析柱高的一半时，将层析柱下端的塑料管夹紧；下端的塑料管夹紧；3.3.用玻璃棒将树脂搅拌均匀，倒入层析柱内，松开用玻璃棒将树脂搅拌均匀，倒入层析柱内，松开下端的塑料管，树脂下端的塑料管，树脂自然沉降自然沉降，最后保持蒸馏水，最后保持蒸馏水面高于树脂表面约面高于树脂表面约2cm2cm。严防树脂中出现断层、气泡；严防树脂中出现断层、气
8、泡；保持树脂浸于蒸馏水中、不能干涸；保持树脂浸于蒸馏水中、不能干涸；保持树脂表面水平，不被蒸馏水扰动保持树脂表面水平，不被蒸馏水扰动实验步骤实验步骤配制配制0.1M磷酸钠缓冲液磷酸钠缓冲液pH7.0 先配制先配制 1M Na 1M Na2 2HPOHPO4 4 57.7mL 57.7mL 1M NaH 1M NaH2 2POPO4 4 42.3mL 42.3mL 将两者混合后稀释至将两者混合后稀释至1000mL1000mL，装于试，装于试 剂瓶中。剂瓶中。实验步骤实验步骤平衡离子交换树脂平衡离子交换树脂 0.1M0.1M磷酸钠缓冲液磷酸钠缓冲液恒速缓慢恒速缓慢流经树脂，流经树脂，直至流出液的直
9、至流出液的pHpH值与缓冲液相同，平衡值与缓冲液相同，平衡结束。结束。1、请第一组同学留下来打扫卫生。2、各组同学清洗各自的玻璃器皿，收拾打扫自己的台面。生物制药工艺学实验南京师范大学生命科学学院南京师范大学生命科学学院20152015年年4 4月月蛋清中提取溶菌酶实验二 柱层析法提取溶菌酶实验目的 掌握静态和动态离子交换的方法；掌握静态和动态离子交换的方法；掌握从生物材料中提取活性蛋白质方法。掌握从生物材料中提取活性蛋白质方法。实验材料 起始缓冲液：起始缓冲液：0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗脱液：洗脱液：50mM NaCl溶液200mL（溶剂：起始缓冲液）500mM NaCl溶液15
10、0mL（溶剂：起始缓冲液）l再生溶液：再生溶液：0.5M NaOH溶液 仪器：仪器：磁力搅拌器等磁力搅拌器等 其他材料：其他材料：新鲜鸡蛋新鲜鸡蛋实验流程样品的预处理样品的预处理静态吸附和洗涤静态吸附和洗涤动态洗脱杂质和溶菌酶动态洗脱杂质和溶菌酶再生树脂再生树脂洗涤管道洗涤管道背景知识 蛋清中的溶菌酶蛋清中的溶菌酶 一种碱性球蛋白一种碱性球蛋白，MwMw14700Da14700Da，pIpI10.511.010.511.0，在酸性条件在酸性条件下（下（pH4pH47 7）较耐热，而在中、碱性条件下热稳定性较差。）较耐热，而在中、碱性条件下热稳定性较差。蛋清中主要的蛋白质蛋清中主要的蛋白质 卵白
11、蛋白，占卵白蛋白，占5454，pIpI4.54.54.84.8，分子量约为，分子量约为 45000Da45000Da；卵伴白蛋白，卵伴白蛋白，pIpI6.056.056.66.6，分子量约为，分子量约为 7000078000Da7000078000Da；卵球蛋白，卵球蛋白，pIpI5.55.85.55.8，分子量约为，分子量约为360003600045000Da45000Da；卵类粘蛋白，卵类粘蛋白，pIpI3.93.94.34.3，分子量约为，分子量约为28000Da28000Da；卵粘蛋白粘度较大且不溶于水。卵粘蛋白粘度较大且不溶于水。实验原理蛋清中的蛋白质大多数呈酸性或者弱酸性，在蛋清中
12、的蛋白质大多数呈酸性或者弱酸性，在pHpH7.07.0的条件下，这些蛋白质的条件下，这些蛋白质带负电荷或者少量的正电带负电荷或者少量的正电荷荷；而等电点约为；而等电点约为11.011.0的溶菌酶的溶菌酶带正电荷带正电荷，牢固地，牢固地吸附在阳离子交换树脂上，再通过吸附在阳离子交换树脂上，再通过不同离子强度的不同离子强度的 NaClNaCl溶液将弱酸性蛋白质和溶菌酶溶液将弱酸性蛋白质和溶菌酶分级洗脱分级洗脱下来。下来。离子交换层析分离溶菌酶离子交换层析分离溶菌酶Na+阳离子交阳离子交换树脂换树脂阳离子交阳离子交换树脂换树脂阳离子交阳离子交换树脂换树脂+-静态和动态离子交换法l 静态离子交换法静态
13、离子交换法优点：优点：操作简单；操作简单；设备要求低；设备要求低；适合于粘度较高适合于粘度较高的样品。的样品。缺点：缺点：交换不完全；交换不完全；不适宜用作多种不适宜用作多种成分的分离；成分的分离；而且树脂有一定而且树脂有一定的损耗。的损耗。动态离子交换法动态离子交换法优点：优点：分辨率高，适分辨率高，适合多组分样品合多组分样品的分离；的分离；交换完全；交换完全；洗脱液中溶质洗脱液中溶质浓度高；浓度高；缺点：缺点：设备要求高；设备要求高；操作参数多。操作参数多。洗脱1.1.改变离子强度，在缓冲液中加入适改变离子强度，在缓冲液中加入适当的当的KClKCl、NaClNaCl等非缓冲盐类等非缓冲盐类
14、2.2.改变改变pHpH值，用缓和的酸或者碱洗脱值，用缓和的酸或者碱洗脱。1.1.分阶段分阶段梯度洗脱：梯度洗脱：先采用先采用洗脱能力弱洗脱能力弱的溶的溶液，使易解吸附的组分流出，然后依次使用液，使易解吸附的组分流出，然后依次使用洗脱能力强洗脱能力强的溶液，解吸附较难洗脱的组分。的溶液，解吸附较难洗脱的组分。2.2.连续梯度洗脱：连续梯度洗脱：其洗脱效果优于分阶段梯其洗脱效果优于分阶段梯度洗脱，适合于度洗脱，适合于高分辨率高分辨率的分离目的，或者的分离目的，或者摸索分阶段梯度洗脱的条件。摸索分阶段梯度洗脱的条件。离子强度离子强度分阶段洗脱分阶段洗脱连续洗脱连续洗脱离子强度离子强度洗脱峰洗脱峰洗
15、脱峰洗脱峰连续梯度洗脱的装置连续梯度洗脱的装置 C=C C=CB B-（C CB B-C-CA A）（）（1-V1-V2 2/V/V1 1）B1/A1B1/A1 C CA A、C CB B 梯度混合器梯度混合器A A瓶、瓶、B B瓶的浓度；瓶的浓度；A1 A1、B1 B1 A A瓶、瓶、B B瓶的横切面积；瓶的横切面积；V V2 2流经层析柱的体积，流经层析柱的体积，V V1 1梯度洗脱液的总体积。梯度洗脱液的总体积。总结离子交换的操作流程离子交换的操作流程1.1.树脂的选择（阳离子交换树脂还是阴离子交树脂的选择（阳离子交换树脂还是阴离子交换树脂）换树脂）2.2.树脂的预处理（盐型还是氢型、羟
16、型）树脂的预处理（盐型还是氢型、羟型）3.3.缓冲液的种类、缓冲液的种类、pHpH值和离子强度值和离子强度4.4.洗脱洗脱5.5.树脂的再生树脂的再生 离子交换的操作参数离子交换的操作参数1.1.流速（吸附的速度和洗脱速度）流速（吸附的速度和洗脱速度）2.2.样品的体积和浓度样品的体积和浓度实验步骤 样品的预处理样品的预处理 取取2 2个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积1.51.5倍倍的起始缓冲液，搅拌均匀，用的起始缓冲液，搅拌均匀，用4 4层纱布过滤除去不溶性物质，层纱布过滤除去不溶性物质，检查其检查其pHpH值是否为
17、值是否为7.07.0，否则用，否则用0.5M0.5M酸、碱调节。酸、碱调节。静态吸附和洗涤静态吸附和洗涤1.1.静态吸附溶菌酶：静态吸附溶菌酶：倾出层析柱中平衡好的树脂，倾去多余平衡缓冲液，倾出层析柱中平衡好的树脂，倾去多余平衡缓冲液，将蛋清溶液倒入树脂中，在磁力搅拌器上将蛋清溶液倒入树脂中，在磁力搅拌器上轻轻搅拌轻轻搅拌，室温下搅拌吸附约，室温下搅拌吸附约45min45min，注意搅拌速度（勿起大量泡沫、勿打破树脂）。吸附结束，吸，注意搅拌速度（勿起大量泡沫、勿打破树脂）。吸附结束，吸取取 200L 200L 上清于上清于 dorfdorf管中、管中、4 4度保存备用（度保存备用（标记标记“
18、1 1”），倾倒上清。），倾倒上清。2.2.洗涤杂质：洗涤杂质：取取与树脂体积相当与树脂体积相当的起始缓冲液的起始缓冲液搅拌洗涤树脂约搅拌洗涤树脂约5min5min，重复重复2 2次次，每次洗涤后，吸取，每次洗涤后，吸取 200L 200L 洗涤液于洗涤液于 dorfdorf管中、管中、4 4度保存备用度保存备用（标记标记“2”2”“3”3”），倾去洗涤液。），倾去洗涤液。动态洗脱动态洗脱1.1.用少量起始缓冲液将树脂调匀，重新装填层析柱，用少量起始缓冲液将树脂调匀，重新装填层析柱，装填结束后，用起始缓冲液（装填结束后，用起始缓冲液（用滴管沿层析柱内用滴管沿层析柱内壁缓缓加入，勿冲击树脂面，高
19、度约壁缓缓加入，勿冲击树脂面，高度约2cm2cm即可即可）封闭树脂面，将层析系统组装好，核酸蛋白检测封闭树脂面，将层析系统组装好，核酸蛋白检测仪调基线（仪调基线（T T档调档调“100”100”，A A档调档调“0”0”），开始），开始用用 50mM NaCl50mM NaCl洗脱液洗脱液恒速洗脱杂质恒速洗脱杂质。（流速约。（流速约23mL/min)23mL/min)2.2.洗脱杂蛋白：洗脱杂蛋白：洗脱开始，即计时，然后洗脱开始，即计时，然后每隔每隔2min2min，记录下吸光值，记录下吸光值和电和电导率值（使用导率值（使用LPLP层析系统的同学记录电导率值），当层析系统的同学记录电导率值），
20、当洗脱峰结束洗脱峰结束（流出液的吸光值从开始上升到下降，直至平稳流出液的吸光值从开始上升到下降，直至平稳），洗脱完成。），洗脱完成。在在洗脱峰洗脱峰吸光值最大处吸光值最大处收集少量洗脱液于收集少量洗脱液于 dorfdorf管管中，中，标记标记“4 4”）3.3.收集溶菌酶：收集溶菌酶：更换更换 500mM NaCl500mM NaCl洗脱液洗脱液，同样记录，同样在吸光值最，同样记录，同样在吸光值最大处收集少量洗脱液于大处收集少量洗脱液于dorfdorf管中，管中，标记标记“5 5”），），此时是此时是溶菌酶的洗脱峰，所以溶菌酶的洗脱峰，所以整个洗脱峰要收集于烧杯中，整个洗脱峰要收集于烧杯中，4
21、 4度保存度保存。再生树脂再生树脂 用用0.5M NaOH0.5M NaOH溶液（约溶液（约1 1倍柱床体积）洗涤树脂，倍柱床体积）洗涤树脂，然后用蒸馏水将碱液冲洗干净，树脂回收于烧杯然后用蒸馏水将碱液冲洗干净，树脂回收于烧杯中，浸泡于蒸馏水中，保鲜膜蒙好，室温放置。中，浸泡于蒸馏水中，保鲜膜蒙好，室温放置。l洗涤管道洗涤管道 将管道系统连接好，用约将管道系统连接好，用约100mL 70%100mL 70%乙醇冲洗管乙醇冲洗管道，冲洗层析柱。道，冲洗层析柱。绘制层析图谱绘制层析图谱 以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制层析图谱，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制层析图谱，使用使用LPLP层析
22、系统的同学，分别以吸光值和电导率层析系统的同学，分别以吸光值和电导率为纵坐标。为纵坐标。请各组同学清理自己的台面请各组同学清理自己的台面请第二组同学打扫卫生请第二组同学打扫卫生生物制药工艺学实验南京师范大学生命科学学院南京师范大学生命科学学院20152015年年4 4月月蛋清中提取溶菌酶实验三实验三 超滤法分离溶菌酶和盐析超滤法分离溶菌酶和盐析 浓缩溶菌酶浓缩溶菌酶实验目的实验目的掌握超滤分离技术的原理和操作；掌握超滤分离技术的原理和操作；掌握盐析的原理和操作。掌握盐析的原理和操作。实验流程实验流程超滤法进一步分离溶菌酶超滤法进一步分离溶菌酶透过液盐析法沉淀溶菌酶透过液盐析法沉淀溶菌酶透析法除
23、盐透析法除盐实验材料实验材料溶液：溶液：0.5M NaOH0.5M NaOH溶液溶液透析缓冲液：透析缓冲液：0.1M0.1M磷酸钠缓冲液（磷酸钠缓冲液（pH7.0pH7.0）其他材料：其他材料：透析袋（透析袋（800010000Da800010000Da），超），超滤膜（滤膜（30kD30kD），固体硫酸铵，研钵，捣杵），固体硫酸铵，研钵，捣杵等。等。实验原理实验原理超滤分离技术超滤分离技术1.1.原理：原理：它是一种它是一种膜分离膜分离技术，它的特点是使用技术，它的特点是使用不对称多孔膜，根据不对称多孔膜，根据分子的大小分子的大小来分离溶液中来分离溶液中的大分子物质与小分子物质。它是的大分子
24、物质与小分子物质。它是一种流体一种流体切切向流动向流动和和压力驱动压力驱动的过滤过程的过滤过程。2 2、分离方式：、分离方式：切向流过滤切向流过滤切向流过滤：切向流过滤：溶液沿与超滤溶液沿与超滤膜平行的方向流动，可避免膜平行的方向流动，可避免浓差极化，提高超滤速度。浓差极化，提高超滤速度。封头过滤：封头过滤：溶液流动方向与溶液流动方向与过滤方向一致，随着过滤的过滤方向一致，随着过滤的进行，膜表面形成的滤饼层进行，膜表面形成的滤饼层厚度逐渐增大，流速逐渐降厚度逐渐增大，流速逐渐降低。低。3 3、超滤分离过程示意图、超滤分离过程示意图4 4、选择超滤膜、选择超滤膜截留分子量：截留分子量：阻留率达阻
25、留率达90%90%以上的最小被截留物质的分以上的最小被截留物质的分子量。子量。膜的材质：膜的材质：非特异性吸附低，耐酸碱性好。非特异性吸附低，耐酸碱性好。Hydrosart Hydrosart膜：膜：纤维素衍生膜，对蛋白质非特异性吸附纤维素衍生膜，对蛋白质非特异性吸附低，在低，在pH2-14pH2-14酸碱度范围内使用，可以用酸碱度范围内使用，可以用1N NaOH 1N NaOH 清清洗再生洗再生多次，流量恢复率高。多次，流量恢复率高。5 5、超滤的基本流程、超滤的基本流程选择合适的膜包（考察膜的截留分子量等）；选择合适的膜包（考察膜的截留分子量等）；将膜包固定在夹具中（不超过膜的耐受压力）；
26、将膜包固定在夹具中（不超过膜的耐受压力）；选择合适的切向流速率（不超过膜包的最大允选择合适的切向流速率（不超过膜包的最大允许背压）；许背压）；超滤结束后要冲洗膜包；超滤结束后要冲洗膜包；观察回流液速率，确定是否预过滤溶液。观察回流液速率，确定是否预过滤溶液。观察水透过通量，适时清洗膜包；观察水透过通量，适时清洗膜包；膜包需保存在含防腐剂的溶液中。膜包需保存在含防腐剂的溶液中。盐析沉淀蛋白质盐析沉淀蛋白质1.1.原理：原理：大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，使蛋白质分子周围的使蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失水化膜层减弱乃至消失，蛋，蛋白
27、质相互聚集而沉淀。白质相互聚集而沉淀。大量的盐离子能够中和蛋白质表面的电荷，使蛋大量的盐离子能够中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质之间的白质之间的静电斥力降低静电斥力降低，导致蛋白质相互聚集，导致蛋白质相互聚集而沉淀。而沉淀。由于蛋白质分子的水化膜被破坏，由于蛋白质分子的水化膜被破坏，暴露出其疏水暴露出其疏水区域区域，蛋白质的疏水区域越多，越易沉淀。，蛋白质的疏水区域越多，越易沉淀。2 2、优点：、优点：较少引起蛋白质变性较少引起蛋白质变性；3 3、缺点：、缺点：在盐析过程中，易产生在盐析过程中，易产生共沉现象共沉现象，故分辨率不高；，故分辨率不高；盐析后需进行脱盐步骤。盐析后需进行脱盐步骤。4
28、4、注意事项：、注意事项：蛋白质浓度可蛋白质浓度可适当降低适当降低，以减少共沉；，以减少共沉；pHpH值一般选择在蛋白质的值一般选择在蛋白质的等电点附近等电点附近，盐析效率高；，盐析效率高；在高盐下，蛋白质的溶解度一般随温度的升高而降低，因在高盐下，蛋白质的溶解度一般随温度的升高而降低，因此，通常盐析在此，通常盐析在室温下进行盐析室温下进行盐析。透析除盐透析除盐1、原理：原理：在常压下，依靠小分子物质的扩在常压下，依靠小分子物质的扩散运动将两类分子量差别较大的物质分离开散运动将两类分子量差别较大的物质分离开来。来。2 2、注意事项、注意事项透析袋要透析袋要留一定空间留一定空间，以防透析袋胀裂，
29、以防透析袋胀裂，和因透析袋膨胀引起膜孔径的变化；和因透析袋膨胀引起膜孔径的变化；透析装置常加上透析装置常加上搅拌系统搅拌系统，并定期或连续，并定期或连续更换新鲜的溶剂，以提高透析效率。更换新鲜的溶剂，以提高透析效率。3 3、透析袋：、透析袋：一般是再生纤维素，具有亲水性、一般是再生纤维素，具有亲水性、惰性和良好的物理性能，可再生。惰性和良好的物理性能，可再生。4 4、透析袋的预处理：、透析袋的预处理：5050乙醇煮沸乙醇煮沸1h1h，再分，再分别用别用5050乙醇、乙醇、0.01mol/L NaHCO0.01mol/L NaHCO3 3 和和0.001mol/L EDTA0.001mol/L
30、EDTA溶液依次洗涤，最后用蒸溶液依次洗涤，最后用蒸馏水浸洗，存放与馏水浸洗，存放与7070乙醇溶液中。乙醇溶液中。透析示意图透析示意图实验步骤实验步骤1.1.超滤分离（四组同学的溶菌酶洗脱液合并超滤）：超滤分离（四组同学的溶菌酶洗脱液合并超滤）：将溶菌酶洗脱液以合适的流速经过超滤膜（将溶菌酶洗脱液以合适的流速经过超滤膜（进口进口压力不超过压力不超过 2.0bar2.0bar ），），收集透过液收集透过液，回流回流液（吸取液（吸取 200200L L于于dorfdorf管中，管中，标记为标记为“6 6”），），当透过液与回流液体积比约为当透过液与回流液体积比约为3:13:1时，超滤可结时，超滤
31、可结束。束。超滤结束后，需要用超滤结束后，需要用50mM 50mM 磷酸缓冲液冲洗膜包；磷酸缓冲液冲洗膜包；当透当透过液与回流液体积比约为过液与回流液体积比约为1:11:1时，冲洗即可结束。时，冲洗即可结束。如果透过液流速减慢，需要用如果透过液流速减慢，需要用0.5M NaOH0.5M NaOH溶液清洗膜包，溶液清洗膜包，然后再用蒸馏水将碱液冲洗干净。然后再用蒸馏水将碱液冲洗干净。2 2、盐析：盐析：在透过液中加入研细的固体硫酸铵粉末在透过液中加入研细的固体硫酸铵粉末（边搅拌边加入边搅拌边加入），硫酸铵的终浓度为），硫酸铵的终浓度为3535（即即100mL 100mL 溶液中溶液中 35g 3
32、5g 硫酸铵硫酸铵），室温下静置约），室温下静置约2030min2030min，4 4度、度、10000rpm10000rpm、20min20min。3 3、透析除盐：透析除盐：取少量取少量 0.1M 0.1M 磷酸钠缓冲液（磷酸钠缓冲液（pH7.0pH7.0）溶解沉淀，装入透析袋中，置于适量的溶解沉淀，装入透析袋中，置于适量的0.1M 0.1M 磷磷酸钠缓冲液室温下搅拌透析过夜，次日更换缓冲酸钠缓冲液室温下搅拌透析过夜，次日更换缓冲液继续透析液继续透析24h24h。透析结束后，。透析结束后，将透析袋内将透析袋内的溶菌酶样品装入离心管中的溶菌酶样品装入离心管中，4 4度保存备度保存备用（用（标
33、记标记“7 7”）。）。请各组同学收拾自己的玻璃器皿和台请各组同学收拾自己的玻璃器皿和台面；面；请第三组同学打扫卫生。请第三组同学打扫卫生。生物制药工艺学实验南京师范大学生命科学学院南京师范大学生命科学学院20132013年年4 4月月蛋清中提取溶菌酶实验四实验四 SDS-PAGESDS-PAGE检测溶菌酶的纯检测溶菌酶的纯 度和含量度和含量实验目的 掌握掌握SDSSDSPAGEPAGE的原理和操作；的原理和操作；掌握掌握SDS-PAGESDS-PAGE的应用。的应用。实验材料 制胶的试剂：制胶的试剂：丙烯酰胺（丙烯酰胺（AcrAcr）：甲叉双丙烯酰胺（）：甲叉双丙烯酰胺（BisBis)292
34、9：1 1 避光保存避光保存 神经毒神经毒 四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）剧毒剧毒 过硫酸铵（过硫酸铵（AP AP）新鲜配制新鲜配制 缓冲液：缓冲液：100mmol/L 100mmol/L Tris-HClTris-HCl 4%SDS 0.2%4%SDS 0.2%溴酚蓝溴酚蓝 20%20%甘油甘油 200 200 mmolmmol/LL-巯基乙醇巯基乙醇 pH6.8pH6.8 Tris-HClTris-HCl pH 8.8 pH 8.8，0.5M 0.5M Tris-HClTris-HCl pH6.8 pH6.8250mmol/L 250mmol/L Tris-HClTri
35、s-HCl 2.5 2.5 mmolmmol/L/L 甘氨酸甘氨酸 1%SDS pH8.3 4 1%SDS pH8.3 4度保存度保存 染色液：染色液：考马氏亮蓝考马氏亮蓝 R250 R250 染色液染色液 仪器：仪器：垂直电泳系统垂直电泳系统实验原理凝胶聚合的原理凝胶聚合的原理不连续凝胶电泳的原理不连续凝胶电泳的原理变性凝胶电泳的原理变性凝胶电泳的原理凝胶聚合的原理凝胶聚合的原理原理：原理：TEMED TEMED 的碱基可催化的碱基可催化AP AP 水溶液产生游离氧原水溶液产生游离氧原子，氧原子再激活子，氧原子再激活AcrAcr 单体形成长链，在交联剂单体形成长链，在交联剂BisBis 的作
36、用下长链聚合成三维网孔结构的凝胶。的作用下长链聚合成三维网孔结构的凝胶。优点：优点：聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶性能稳定、无吸附作用、无性能稳定、无吸附作用、无电渗作用；电渗作用；可分离不同分子量的生物大分子，并且电泳重可分离不同分子量的生物大分子，并且电泳重复性好。复性好。HH凝胶单体（凝胶单体（AcrAcr）交联剂（交联剂（BisBis）（2 2）影响聚合的因素：）影响聚合的因素：某些某些金属离子金属离子、低温低温和和氧气氧气能延长或阻止聚合作用；能延长或阻止聚合作用；在在pH 5pH 510 10 时时TEMEDTEMED能够加速聚合作用。能够加速聚合作用。a/ba/b与凝胶的与凝胶的机
37、械性能密机械性能密切相关。切相关。a/ba/b约为约为3030，凝胶透明并凝胶透明并且有弹性。且有弹性。（3 3）胶浓度（）胶浓度（）分离范围分离范围/KDaKDa1515121210107.57.55.05.010-4310-4312-6012-6020-8020-8036-9436-9457-21257-212 凝胶浓度及其分离的分子量范围凝胶浓度及其分离的分子量范围不连续凝胶电泳的原理不连续凝胶电泳的原理 凝胶电泳的分类：凝胶电泳的分类：连续和不连续系统连续和不连续系统 连续系统：连续系统：不连续系统：不连续系统：电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应浓缩效应浓缩效应电荷效应电荷效应分子筛
38、效应分子筛效应（1 1）浓缩效应）浓缩效应1.1.缓冲体系缓冲体系离子成分离子成分及及pHpH值值的不连续性的不连续性2.2.凝胶孔径凝胶孔径的不连续性的不连续性3.3.电位梯度电位梯度的不连续性的不连续性浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶SDS-PAGESDS-PAGE的应用的应用 1 1、蛋白质纯度的分析；、蛋白质纯度的分析；2 2、蛋白质相对分子质量的测定；、蛋白质相对分子质量的测定；注意事项：注意事项：1.1.不适合测定电荷或者构象异常的蛋白质，以及带有较大辅基的不适合测定电荷或者构象异常的蛋白质，以及带有较大辅基的蛋白质如糖蛋白和一些结构蛋白质如胶原蛋白的相对分子质量；蛋白质如糖蛋白和一些结构
39、蛋白质如胶原蛋白的相对分子质量；2.2.对于由亚基或者对于由亚基或者2 2条以上肽链组成的蛋白质，条以上肽链组成的蛋白质，SDS-PAGE SDS-PAGE 测定的测定的是其亚基或单条肽链的分子量。是其亚基或单条肽链的分子量。电泳槽图片电泳槽图片插板插板主体主体矮玻璃板矮玻璃板高玻璃板高玻璃板制胶器制胶器堵板堵板将主体放在胶器将主体放在胶器内，内，旋转手柄，旋转手柄，使底座箭头指向使底座箭头指向手柄手柄1.0mm1.0mm标志处标志处，此时完成胶室的此时完成胶室的密封密封。实验流程制胶室的组装制胶室的组装配制分离胶配制分离胶灌胶，加水层液封灌胶，加水层液封配制浓缩胶，灌胶，加配制浓缩胶，灌胶，
40、加“梳子梳子”组装电泳槽，加入电泳缓冲液组装电泳槽，加入电泳缓冲液拔梳子，制样，加样拔梳子，制样，加样电泳电泳染色，脱色染色，脱色分析结果分析结果实验步骤实验步骤 配制分离胶配制分离胶12123030胶贮胶贮存液存液去离子去离子水水1.5M 1.5M Tris-Tris-HClHCl pH8.8 pH8.8 10%SDS10%SDS10%AP10%APTEMEDTEMED4.0 4.0 mLmL3.35 3.35 mLmL2.5 2.5 mLmL100100LL5050LL7 7LL 注意事项：注意事项：1.1.各种溶液在洁净干燥的烧杯中混合均匀，勿使胶各种溶液在洁净干燥的烧杯中混合均匀，勿使
41、胶液产生大量气泡液产生大量气泡，迅速沿玻璃板边缘加入胶液，迅速沿玻璃板边缘加入胶液，至短板约至短板约2/32/3高处，灌注胶液时避免混入气高处，灌注胶液时避免混入气泡，泡，迅速加入去离子水至短板顶端，覆盖住胶面，迅速加入去离子水至短板顶端，覆盖住胶面，待凝胶聚合，倒去水层，并用滤纸将水分吸干。待凝胶聚合，倒去水层，并用滤纸将水分吸干。配制浓缩胶配制浓缩胶 5 5 3030胶贮胶贮存液存液去离子去离子水水0.5M 0.5M Tris-Tris-HClHCl pH6.8 pH6.8 10%SDS10%SDS 10%AP10%AP TEMEDTEMED1.3 1.3 mLmL6.1 6.1 mLmL
42、2.5 2.5 mLmL100L100L50L50L10L10L注意事项：注意事项：1.1.迅速沿玻璃板边缘加入胶液至接近顶部，斜插入迅速沿玻璃板边缘加入胶液至接近顶部，斜插入“梳子梳子”，确保确保“梳齿梳齿”底端无气泡，和底端无气泡，和“梳子梳子”水平。水平。灌注分离胶灌注分离胶灌注浓缩胶灌注浓缩胶插入插入“梳子梳子”水封水封分离胶分离胶浓缩胶浓缩胶“梳子梳子”加入加入1 1电泳缓冲液电泳缓冲液1.1.加入约加入约200mL 200mL 1 1电泳缓冲液电泳缓冲液，使凝胶，使凝胶上、下端都浸泡上、下端都浸泡在电泳缓冲液中，并且在电泳缓冲液中，并且内槽缓冲液高于外槽内槽缓冲液高于外槽；2.2.
43、确保加样孔内无无气泡，以保证电流畅通。确保加样孔内无无气泡，以保证电流畅通。制备样品制备样品1.1.将将15L15L样品与样品与15L 215L 2样品缓冲液在样品缓冲液在dorfdorf管中混合均匀，管中混合均匀，100100度度煮沸煮沸5min5min，8000rpm 8000rpm 离心离心 5min5min；2.2.样品（从左至右）样品（从左至右）蛋白质蛋白质 MarkerMarker（1010L L，不加，不加2 2样品缓冲液，煮沸，离心）样品缓冲液，煮沸，离心）标记标记“1 1”（吸附后的上清液）（吸附后的上清液）标记标记“2 2”（洗涤后的上清液）（洗涤后的上清液）标记标记“3
44、3”（50mM NaCl50mM NaCl洗脱峰）洗脱峰）标记标记“4 4”（500mM NaCl500mM NaCl洗脱峰）洗脱峰）标记标记“5 5”（超滤回流液）（超滤回流液）标记标记“6 6”（透析除盐后的溶菌酶样品）（透析除盐后的溶菌酶样品）蛋白质蛋白质 MarkerMarker（1010L L，不加，不加2 2样品缓冲液，煮沸，离心）样品缓冲液，煮沸，离心）加样：加样：用移液枪缓慢地用移液枪缓慢地加入加入 30L 30L 样品于样品样品于样品孔中，孔中，让样品沉于样让样品沉于样品孔内品孔内，避免加入气避免加入气泡泡。可在加样前可在加样前吸取电泳缓冲液吸取电泳缓冲液冲洗冲洗一一下样品孔
45、，除去未聚合下样品孔，除去未聚合的丙烯酰胺等。的丙烯酰胺等。电泳电泳1.1.恒压电泳恒压电泳 100V100V；2.2.当溴酚蓝迁移至凝胶底部约当溴酚蓝迁移至凝胶底部约0.5cm0.5cm处，停止电泳；处，停止电泳；3.3.小心剥离凝胶，将凝胶浸入考马斯亮蓝小心剥离凝胶，将凝胶浸入考马斯亮蓝 R250R250染染液中，浸泡过夜；液中，浸泡过夜；4.4.第二天回收染色液，用脱色液均匀脱去凝胶上的第二天回收染色液，用脱色液均匀脱去凝胶上的剩余染液。剩余染液。注意事项：注意事项：1.1.染色和脱色都应该均匀，所以如果条件允许，应染色和脱色都应该均匀，所以如果条件允许，应在脱色摇床上进行。在脱色摇床上
46、进行。考马氏亮蓝考马氏亮蓝R250R250染色染色1.1.原理原理：考马氏亮蓝考马氏亮蓝R250R250通过范德华力与蛋白质结合，通过范德华力与蛋白质结合，适用于蛋白质电泳微量蛋白质染色，当蛋白质浓度超适用于蛋白质电泳微量蛋白质染色，当蛋白质浓度超过一定范围时，对其染色不符合过一定范围时，对其染色不符合BeerBeer定律，不适合作定律，不适合作定量分析。定量分析。2.2.灵敏度：灵敏度：每一条蛋白质条带最低质量为每一条蛋白质条带最低质量为0.1g0.1g。分析结果分析结果Q:Q:样品中有不溶性物质样品中有不溶性物质A:A:加样前离心加样前离心 或者因为样品溶解性不佳，加入增溶剂，如非离子型表
47、面活性剂或者因为样品溶解性不佳，加入增溶剂，如非离子型表面活性剂Q Q：加样量过多加样量过多A A：每孔上样的最大蛋白质量为每孔上样的最大蛋白质量为40g40g 或者因为浓缩胶过短，可适当增加浓缩胶长度和降低浓缩阶段的电压或者因为浓缩胶过短，可适当增加浓缩胶长度和降低浓缩阶段的电压Q Q：电泳过程中凝胶中间比两侧热，导致同种蛋白质相对迁移率不同电泳过程中凝胶中间比两侧热，导致同种蛋白质相对迁移率不同A A：适当降低电压适当降低电压 或者将电泳槽置于冷水中降温或者将电泳槽置于冷水中降温Q Q：胶和玻璃板之间底部有气泡或者靠近边缘的凝胶聚合不完全胶和玻璃板之间底部有气泡或者靠近边缘的凝胶聚合不完全
48、生物制药工艺学实验南京师范大学生命科学学院南京师范大学生命科学学院20152015年年5 5月月摸索双水相萃取酵母蔗糖酶的条件实验目的了解双水相萃取的原理；了解双水相萃取的原理；掌握蔗糖酶比活力测定的原理和方法。掌握蔗糖酶比活力测定的原理和方法。实验材料试剂：试剂：0.1 mol/L 0.1 mol/L 磷酸钠缓冲液磷酸钠缓冲液（pH7.4pH7.4），），1 mol/L NaOH1 mol/L NaOH溶液，溶液，5%5%蔗糖溶液，蔗糖溶液，DNSDNS溶液溶液，1 mg/mL1 mg/mL葡萄糖标准溶液葡萄糖标准溶液；固体试剂：固体试剂：PEG1500,PEG6000,PEG20000,P
49、EG1500,PEG6000,PEG20000,硫酸铵硫酸铵仪器：仪器：低速离心机，可见分光光度计，水浴锅低速离心机，可见分光光度计，水浴锅。实验原理定义：定义：某些某些高聚物之间高聚物之间或或高聚物与无机盐高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓之间在水中以适当的浓度溶解会形成度溶解会形成互不相溶的两水相系统互不相溶的两水相系统。相图：相图：两水相的形成条件和定量关系，常用相图来表示，它是一两水相的形成条件和定量关系，常用相图来表示，它是一条条双结点线双结点线。双水相萃取双水相萃取99双结点线双结点线系线系线均相区均相区两相区两相区例如：例如：MM点，两相有不同的组成和密度，上相（点，两相有不同的
50、组成和密度，上相（T T）主要含）主要含PEGPEG，下相（下相（B B）主要含葡聚糖。直线）主要含葡聚糖。直线TMBTMB称为系线，所有在该系线上称为系线，所有在该系线上的点，其上、下相组成均与的点，其上、下相组成均与T T和和B B点相同，但体积比不同。点相同，但体积比不同。当系线长度趋于零时，即当系线长度趋于零时，即C C点，两相差别消失，点，两相差别消失，C C点称为临界点点称为临界点（critical pointcritical point）。）。临界点临界点影响分配系数的主要因素影响分配系数的主要因素聚合物的相对分子质量聚合物的相对分子质量 在聚合物浓度不变的前提下，当聚合物在聚合
