1、学号:20095322姓名:单海丽班级:09级生物工程(4)班2022-12-241 白细胞介素-2(IL2)是由Morgan和 Ruscetti发现的由T细胞产生的一种淋巴因子,是一个分子质量为14500的糖蛋白。可使细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞(N K)和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)增殖,并升高其杀伤活性,进而清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。还可促进干扰素、肿瘤坏死因子等细胞因子的分泌和抗体产生,是一种免疫增强剂,具有抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫功能等作用。2022-12-242免疫作用机理:IL-2 能与任何能形成IL-2 受体的细胞,如辅助性T 细胞(T H)、细胞毒性T 细胞(
2、T e)、B 细胞和自然杀伤细胞结合,但结合的强度以T c 细胞为最高。IL-2 与相应受体结合后,细胞即从G 相进入S 相并开始分化增殖。2022-12-2431.肿瘤治疗:在恶性肿瘤的发病机制中,肿瘤病人的白介素-2 含量较正常的水平低,不能使NK、CT L、LAK 等杀伤细胞活化和增殖,使肿瘤细胞逃逸,得不到清除。此时必须提供外源白介素-2,帮助病人完成免疫监视功能,这就是白介素-2 治疗肿瘤的免疫学基础。2022-12-2442.抗病毒感染3.对感染性疾病的治疗作用4.对其他疾病的治疗:白介素-2 在急性白血病、抗高血压、抗寄生虫、免疫佐剂等方面都有着积极的应用。2022-12-245
3、IL-2一级结构2022-12-246 IL-2为螺旋状的长肽链,由133个氨基酸组成,其中共有三个半胱氨酸(cys)分别在第58、105、125位,其中58位与105位的cys生成的二硫键为活性所必需,且易错配或生成二聚体,降低生物活性。基因工程重组IL-2用点突变的方法把125位的cys改成Ser或Ala,使IL-2分子稳定性增强。如果用点突变的方法把58或105位的cys变成其他氨基酸,则rIL-2的活性几乎完全丧失。2022-12-2471.提高白细胞介素2的比活性2.提高白细胞介素2的稳定性:由于野生型白细胞介素2分子中125位cyt是游离的,易于与58或105位的cyt形成错配的二
4、硫键,或分子间形成二硫键而导致二聚体的形成,不利于白细胞介素2的稳定。125位丝氨酸型白细胞介素2则不存在二硫键错配问题。2022-12-2483.易于纯化:在重组白细胞介素2的纯化过程中,白细胞介素2要被还原剂还原为一级结构,然后再氧化为有活性的白细胞介素2。由于125位cyt是游离的,易于与58或105位的cyt形成错配的二硫键,或分子间形成二硫键而导致二聚体的形成。这些形成的异构体和二聚体一方面会给纯化工作带来麻烦,另一方面比活性降低。125位cyt被ser或Ala取代的IL-2则不纯在错配问题,因而有利于IL-2的纯化。4.降低毒性:125位cyt被ser或Ala取代的IL-2由于比活
5、性进一步提高,在给予同等活性的IL-2时,新型IL-2由于蛋白质的绝对数量较少而可能具有较小的毒性,更容易被病人耐受,从而有利于临床治疗的进行。2022-12-249对蛋白进行化学修饰后可以提高其抗酶消化的能力,延长其在体内的作用时间,提高药效,降低或消除其在体内的免疫原性。对IL-2 进行修饰的主要为PEG,。1992 年有人利用N-羟基丁二酰胺活化PEG 修饰r IL-2,作用时间提高10 倍,而且免疫原性下降,抗肿瘤性能提高,毒副作用有所降低。1994 年和1997 年及其后都有人用PEG 修饰rIL-2 得到生物活性基本不变而抗原性降低的修饰蛋白的报道;随后白介素-2 的化学修饰研究与
6、其它蛋白的化学修饰一样成为了研究的热点。2022-12-2410IL-2 cDNA IL-2 cDNA 文库的构建文库的构建利用探针杂交筛选利用探针杂交筛选IL-2 cDNAIL-2 cDNA阳性克隆阳性克隆与质粒载体与质粒载体pBV220pBV220连接,连接,并转入大肠杆菌并转入大肠杆菌DH5aDH5aIL-2IL-2基因表达基因表达分离纯化包涵体分离纯化包涵体溶解,复性,纯化溶解,复性,纯化纯化的纯化的rIL-2rIL-2T T细胞细胞mRNAmRNA反转录反转录cDNAcDNA2022-12-2411一种制备方法:1.构建工程菌:将载有IL-2基因的质粒导入大肠杆菌细胞中,筛选出目的菌
7、。2.挑单菌落接种于装有LB培养基的摇瓶中,在30 振荡培养8-10小时,然后转入含有合成培养基的发酵罐中,30 下培养11-13小时,再在42 下培养5-6小时,发酵后收集菌体。3.包涵体提取:取菌体,用PH8.5,浓度为50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-1mMol DTT缓冲液洗两遍,沉淀物再悬于同样缓冲液中,加溶菌酶,4 下作用30分钟,冰浴超声至完全破裂为止,离心除去可溶性杂志,沉淀悬于PH8.5浓度为50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-2mMol DTT。搅拌下缓慢滴加同体积PH8.5,浓度为50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-
8、8mMol 尿素,室温下缓慢搅拌20-40分钟,离心除去可溶性杂志,沉淀再用缓冲液洗两遍,再将沉淀溶于PH8.5,浓度为50mMol Tris.Hcl-10mMol DTT-7至8Mol GuHCL,溶解1.5小时后离心取上清在4 保存。2022-12-24124.(1)凝胶层析:取上清装入sephacrylus-200中,用PH8.5,浓度为 50mMol Tris.Hcl-3至6Mol GuHcl充分平衡后上样,平衡液洗脱,结果出现三个蛋白峰,收集第三峰,4 保存;(2)复性:取凝胶层析后样品,浓度为50mMol Tris.Hcl稀释三倍,加氧化和还原性谷胱甘肽,至1mMol和5-10mM
9、ol,调PH使为7-9,室温放置两小时,浓缩至10倍,过sephadex G25柱,用PH3.0,浓度为0.1molGlyHcl平衡并洗脱,收蛋白峰。(3)高效液相层析:用HPLC仪进行纯化,用0.1%三氟乙酸平衡Cl反相柱后,泵入rIL-2样品,进行乙啨梯度洗脱,收集活性峰,低温减压下快速去除乙啨,即可得到rIL-2纯品。2022-12-2413通用名:注射用重组人白细胞介素-2英文名:Recombinant Human Interleukin-2 for Injection主要组成成分:重组人白细胞介素-22022-12-2414 本品为白色粉末状,易溶于水,溶解后呈透明液体,无肉眼可见不
10、溶物。2022-12-2415 本品在体内主要分布于肾脏、肝脏、脾脏和肺。肾脏是主要的代谢器官,肾组织细胞的组织蛋白酶D分解本品,在肾脏、血清中消除半衰期分别为13分和85分钟左右。2022-12-2416【功效主治】用于治疗成人转移性肾细胞癌(RCC)及黑色素瘤等恶性肿瘤,也适用于癌性胸腹水的控制。【化学成分】主要成份:重组人白细胞介素-2、人血白蛋白。2022-12-2417【药理作用】本品是一种淋巴因子,可使细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞和淋巴因子活化的杀伤细胞增殖,并使其杀伤活性增强,还可以促进淋巴细胞分泌抗体和干扰素,具有抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫功能等作用。在对动物的长期毒性试验中
11、证明,无论血象、血尿生化检验、循环系统检查、病理组织学检查,均无异常所见。2022-12-24181、用于肾细胞癌、黑色素瘤。乳腺癌、膀胱癌 肝癌、直肠癌、淋巴癌、肺癌等恶性肿瘤的治疗,用于癌性胸腹水的控制,也可以用于淋巴因子激活的杀伤细胞的培养。2、用于手术、放疗及化疗后的肿瘤患者的治疗,可增强机体免疫功能。3、用于先天或后天免疫缺陷症的治疗,提高病人细胞免疫功能和抗感染能力。4、各种自身免疫病的治疗:如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征等 5、对某些病毒性、杆菌性疾病、胞内寄生菌感染性疾病:如乙型肝炎、麻风病、肺结核、白色念珠菌感染等具有一定的治疗作用。2022-12-2419本品
12、应在临床医师指导下使用。1.静脉滴注:一次用本品10万一80万国际单位(IU)加入到50ml氯化钠注射液中,静脉滴注23小时,一日1次,46周为一疗程。2.皮下注射:一次用本品50万100万国际单位(IU)用2ml氯化钠注射液溶解,皮下注射,一周23次,6周为一疗程。3.胸腹腔注射:一次用本品30万l00万国际单位(IU)用20ml氯化钠注射液溶解,胸腔或腹腔注射,尽量抽出腔内积液后注入,一周12次,24周(或积液消失)为一疗程。4.介入动脉灌注:一次用本品40万l00万国际单位(IU),用100ml-250l氯化钠注射液溶解,二周1次,6周为一疗程。5.肿瘤灶局部给药:根据瘤体大小决定用药剂
13、量。一般剂量为一次20万国际单位(IU),一周连用4次,2-4周为一疗程。2022-12-2420【不良反应】1 各种不良反应中最常见的是发热、寒战,而且与用药剂量有关,一般 是一过性发热(38左右),亦可有寒战高热,停药后34小时体温 多可自行恢复到正常。个别患者可出现恶心、呕吐、类感冒症状。2 皮下注射者局部可出现红肿、硬结、疼痛,所有副反应停药后均可自 行恢复。3 使用较大剂量时,本品可能会引起毛细血管渗漏综合征,表现为低 血压、末梢水肿、暂时性肾功能不全等。使用本品应严格掌握安全量,出现上述反应可对症治疗。2022-12-2421【禁忌症】1 对本品成份有过敏史的病人。2 高热、严重心
14、脏病、低血压者,严重心肾功能不全者,肺功能异常或进行过器官移植者。3 重组人白细胞介素-2即往用药史中出现过与之相关的毒性反应:(1)持续性室性心动过速;(2)未控制的心率失常;(3)胸痛并伴有心电图改变、心绞痛或心肌梗塞;(4)心压塞;(5)肾功能衰竭需透析72小时;(6)昏迷或中毒性精神病48小时;(7)顽固性或难治性癫痫;(8)肠局部缺血或穿孔;(9)消化道出血需外科手术;(10)孕妇慎用。2022-12-24221.徐月美 中国医药工业杂志 19922.李伟 生物技术 19973.新型重组人白细胞介素2的制备方法及其表达载体和工程菌 中华人民共和国国家知识产权局 19994.重组人白细胞介素制备工艺 中华人民共和国国家知识产权局 19935.重组人白细胞介素制备工艺 中华人民共和国国家知识产权局 19946.重组白细胞介素-2(In te r le u k in-2)在临床的应用和展望 广州医学院学报 19987.白介素-2 研究进展 海峡药学 20068.白细胞介素一2 工程菌高效表达影响因素的初探 中国医药工业杂 志 19969.基因工程白介素2 的纯化研究 中国免疫学杂志 19902022-12-24232022-12-2424谢谢谢谢!