1、微生物学两大经典染色：?革兰氏染色法?抗酸染色法革兰染色法革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家汉斯克里斯蒂安革兰（HansChristain Gran）创立的。）创立的。实验目的和要求?1.掌握革兰氏染色方法的操作步骤及注意事项。?2.了解革兰氏染色的临床意义。?一、实验原理一、实验原理?二、实验器材二、实验器材?三、操作步骤三、操作步骤?四、注意事项四、注意事项?五、革兰染色的临床意义五、革兰染色的临床意义（一）基本步骤：1、初染：草酸胺结晶紫染色2、媒染：碘液媒染3、脱色：乙醇脱色4、复染：石炭酸复红复染一、实验原理?细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。?
2、初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。?碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。（二）原理：（二）原理：?当用脱色剂处理时，G+菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫 碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。?G-菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫 碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为G+菌；
3、细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上 复染剂的颜色复染剂的颜色（红色）的细菌为G-菌。G-G+二、实验器材大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，革兰氏染色液，生理盐水，载玻片，接兰氏染色液，生理盐水，载玻片，接种环，显微镜等。三、操作步骤三、操作步骤1 1、涂片：将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别涂片、干燥、固定。2 2、染色：（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分钟，水洗（3）脱色：将水甩净，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约2030秒，立即用水冲净乙醇（4）复染：用番红液染1-2分钟，水洗3 3、镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准，革兰
4、氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色红色。四、注意事项四、注意事项1、注意涂片不宜过于浓厚。2、火焰固定温度要适宜。3、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。4、染色过程中应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。5、选择幼龄的细菌。G+菌培养12-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使G+菌转呈阴性反应。五、革兰染色的临床意义?1.对细菌的鉴别有重要意义?2.指导临床选择用药?3.研究细菌与致病性
5、的关系思考题：思考题：当你对一株未知菌进行革兰染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？抗酸染色法抗酸染色法?【原理】【原理】?结核杆菌对苯胺染料不易着色，若加温或延长染色时间使其着色后，再用延长染色时间使其着色后，再用3%盐酸酒盐酸酒精处理也不易脱色，再经美兰复染，结核杆菌及其它分枝杆菌仍呈红色，而非抗酸杆菌及其它分枝杆菌仍呈红色，而非抗酸菌和细胞杂质等呈蓝色。?【材料】【材料】?结核病人的咳痰液：采取清晨第一口粘痰，或浓缩集落菌法处理过的痰标本。痰，或浓缩集落菌法处理过的痰标本。?石炭酸复红染色液，3%盐酸酒精，碱性盐酸酒精，碱性美蓝染液?生理盐水?
6、载物玻片，滤纸片、接种环、玻片夹、载物玻片，滤纸片、接种环、玻片夹、酒精灯、蜡笔等?【方法】?1涂膜痰的涂片：用灭菌的接种环采取痰中干酪坏死的小块或带血的痰液，在载玻片上涂成薄而均匀的膜（在烧接种环时为防止痰中的细菌溅出，可先将接种环在内焰烧干，然后再于外焰中灭菌）。?2染色?（1）在已固定好的涂片上放置滤纸片（滤纸的作用是滤去染液中的沉渣，使标本清晰），滴加石炭酸变红染色液于滤纸片上（应滴满滤纸片）。?（2）将加有染液的涂片加温，在火焰上保持一定的高度，直到出现蒸汽（不得沸腾）如此反复23次（约5分钟）。在加温过程中防止将染液烘干（应及时添加染液）。?（3）去掉滤纸片，使涂片冷却，水洗。?（
7、4）用3%盐酸酒精脱色，直到流下的脱色剂无色为止，水洗。?（5）用碱性美蓝染液复染30秒，水洗、干燥、镜检。?【结果观察】【结果观察】?1.结核杆菌染成红色，细长，直的或为微结核杆菌染成红色，细长，直的或为微弯曲，有的可表现出分枝特征，偶而有着色不匀，成颗粒状者。亦可以见到有纵行条索状排列。标本的其余部分及非抗酸性细菌染成蓝色。必须逐一观察各个视野，直待全部涂片找不到结核杆菌时，才可报告阴性。?2.涂片染色能查到结核杆菌者，一般需要每ml痰液内含菌量至少应有500个以上，甚至需达到5万以上。故材料多进行浓缩集菌处理，以提高检出阳性率，也造成在染色标本片观察中，不一定每个视野都能看到结核杆菌。?3.结核杆菌易发生变异，在陈旧培养基或临床治疗后标本材料中，结核杆菌往往菌体断裂，或形成非抗酸性革兰氏阳性的短杆状、球状颗粒，亦称Much颗粒。?4.标本经高压灭菌处理，不影响染色结果，也保证操作者的安全。
