1、纯培养和显微技术纯培养和显微技术南京工业大学生物与制药工程学院南京工业大学生物与制药工程学院蔡恒蔡恒微生物的基本特点：微生物的基本特点：小！t 在绝大多数情况下都是利用在绝大多数情况下都是利用微生物的群体微生物的群体来研究其属性；来研究其属性；t 微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存；微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存；培养技术培养技术在微生物学中具有重要意义！在微生物学中具有重要意义！参见参见P13P13在研究中所使用的微生物培养群体：在研究中所使用的微生物培养群体：培养物：培养物：在一定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体在一定的条件下培养、繁殖得到的微
2、生物群体混合培养物：混合培养物：含有多种微生物的培养物；含有多种微生物的培养物；纯培养物：纯培养物：只有一种微生物的培养物；只有一种微生物的培养物；通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果纯培养技术是进行微生物学研究的基础！纯培养技术是进行微生物学研究的基础！参见参见P13P13 微生物个体微小的特点也决定了微生物个体微小的特点也决定了显微技术显微技术是进行微生物研究是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。通过显微镜才
3、能进行观察和研究。（P12P12第一段第一段）微生物的基本特点：微生物的基本特点：小！参见参见P13P13第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养无菌概念、纯培养概念、纯培养物的获得方法无菌概念、纯培养概念、纯培养物的获得方法第二节第二节 显微镜和显微技术显微镜和显微技术各种显微镜的基本原理及其样品制备方法各种显微镜的基本原理及其样品制备方法第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 从混杂的群体中分离特定的某一种微生物，从混杂的群体中分离特定的某一种微生物，是研究和利用微生物的第一步。是研究和利用微生物的第一步。一、无菌技术一、无菌技术t 用于分离、培养微生物的器具
4、事先不含任何微生物；用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；t 在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，其自身其自身也不污染环境；也不污染环境；（P14P14第第1 1段）段）（参见（参见P13P13、1414）一、无菌技术一、无菌技术参见参见P14P14一、无菌技术一、无菌技术参见参见P14P141 1、微生物培养的常用器具及其灭菌、微生物培养的常用器具及其灭菌常用的器具：常用的器具：试管、瓶子、培养皿等试管、瓶子、培养皿等18871887年，年，R J Petri R J Petri 发明发明 Petri dish参见参见P14P14装有培
5、养基后称为装有培养基后称为“培养平板培养平板”Or“平板平板”(plate)(具体灭菌方法第具体灭菌方法第6章介绍章介绍)高温干热灭菌高温干热灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌试管、瓶子、培养皿等试管、瓶子、培养皿等常用的灭菌方法：常用的灭菌方法：1 1、微生物培养的常用器具及其灭菌、微生物培养的常用器具及其灭菌常用的器具：常用的器具：参见P142 2、接种操作、接种操作无菌操作：无菌操作：火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行参见参见P15P15二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养培养基：培养基：液体培养基；液体培养基；固体培养基；固体培养基；半固体培养基；半
6、固体培养基；参见参见P15P15二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养培养基：培养基：液体培养基；液体培养基；固体培养基；固体培养基；半固体培养基；半固体培养基；固化剂固化剂柯赫（柯赫（Robert KochRobert Koch）的助手的助手W W HeeseHeese和和他他的夫人的夫人Fran Fran HeeseHeese参见参见P15琼脂琼脂二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养菌落（菌落（colonycolony）：）：单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度
7、可以形成肉眼可见的、内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的有一定形态结构的子细胞生长群体。子细胞生长群体。（P15P15，倒数第倒数第2 2段）段）众多菌落连成一片众多菌落连成一片菌苔（菌苔（lawnlawn）不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据（见见P15P15，倒数第二段；图倒数第二段；图2-32-3）。）。斜面培养基上细菌菌苔特征 液体培养基中细菌生长特征 二
8、、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：稀释！稀释！参见参见P16P16二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养1 1、稀释倒平板法、稀释倒平板法2 2、涂布平板法、涂布平板法操作较麻烦，对操作较麻烦，对好氧菌、热敏感好氧菌、热敏感菌效果不好！菌效果不好！使用较多的常规使用较多的常规方法，但有时涂方法，但有时涂布不均匀！布不均匀！参见参见P16P16二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养3 3、平板划线法、平板划线法参见参见P16P16二、用固体培养基分离纯培
9、养二、用固体培养基分离纯培养3 3、平板划线法、平板划线法参见P163 3、平板划线法、平板划线法参见参见P16P16二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养4 4、厌氧微生物的分离、厌氧微生物的分离厌氧罐厌氧罐厌氧手套箱厌氧手套箱参见参见P17P17二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养4 4、厌氧微生物的分离、厌氧微生物的分离厌氧罐厌氧罐厌氧手套箱厌氧手套箱参见参见P17P17二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养4 4、厌氧微生物的分离、厌氧微生物的分离稀释摇管法稀释摇管法参见参见P16P16三、用液体培养基分离纯培养三、用液体培养基分离纯培养 稀
10、释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过平行试管中，大多数（一般应超过95%95%）表现为不生长。）表现为不生长。在有细菌生长的试管中得到纯培养的几率为在有细菌生长的试管中得到纯培养的几率为97.5%97.5%参见参见P17P17四、单细胞（孢子）分离四、单细胞（孢子）分离t 一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；t 操作难度与细胞或个体的大小成反比；操作难度与细胞或个体的大小成反比；参见参见P17P171818通过通过机械机械、空气空气或或油压油压传动装置来减小手的动作幅度，传动装置来减
11、小手的动作幅度，在显微镜下用在显微镜下用毛细管毛细管或显微或显微针针、钩钩、环环等挑取单个等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。微生物细胞或孢子以获得纯培养。利用刚才介绍的技术，我们是否有可能获得利用刚才介绍的技术，我们是否有可能获得某一个生态环境某一个生态环境（例如（例如1 1克土壤）克土壤）中所有种类细菌中所有种类细菌的纯培养？的纯培养？假设待分离的细菌均能利用某一相同的培养基生长假设待分离的细菌均能利用某一相同的培养基生长 同一生态环境中混杂存在着不同种类的细菌；同一生态环境中混杂存在着不同种类的细菌；不同细菌在数量存在差异；不同细菌在数量存在差异；微生物在自然条件下存在的特点：微生物
12、在自然条件下存在的特点：五、选择培养分离五、选择培养分离t 抑制大多数其它微生物的生长；抑制大多数其它微生物的生长；t 使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在群落中的数量上升，使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。方便用稀释法对其进行纯化。微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切微生物生长的要没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切微生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。（P18 P
13、18 第第2 2大段）大段）t 使待分离的微生物生长使待分离的微生物生长“突出突出”；直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。参见参见P18P18五、选择培养分离五、选择培养分离1.1.利用选择培养法进行直接分离利用选择培养法进行直接分离 待分离的微生物生长，待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制其它微生物的生长被抑制t 高温下培养：分离嗜热细菌；高温下培养：分离嗜热细菌；t 培养基中不含培养基中不含N N：分离固氮菌；分离固氮菌；t 培养基加抗生素培养基加抗生素：分离抗性菌；分离抗性菌；参见参见P18P18五、选择培养分离五、选择培养分离1.1.利
14、用选择平板进行直接分离利用选择平板进行直接分离 待分离的微生物待分离的微生物的生长特征明显不同的生长特征明显不同于其它微生物于其它微生物t 牛奶平板牛奶平板：分离蛋白酶产生菌；分离蛋白酶产生菌；参见参见P18P18五、选择培养分离五、选择培养分离2.2.富集培养富集培养从自然界中分离到所需的特定微生物从自然界中分离到所需的特定微生物特定的环境条件特定的环境条件仅适应于该条件的微生物旺盛生长仅适应于该条件的微生物旺盛生长待分离微生物在群落中的数量大大增加待分离微生物在群落中的数量大大增加参见参见P18P182.2.富集培养富集培养 富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎
15、无穷尽的富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。（P 19P 19，第二段），第二段）根据微生物的特殊要求，从自然界分离出特定已知微生物种类；根据微生物的特殊要求，从自然界分离出特定已知微生物种类；分离培养在特定环境中能生长的微生物；分离培养在特定环境中能生长的微生物；参见参见P18P18七、微生物的保藏技术七、微生物的保藏技术（移到第八章（移到第八章 微生物遗传）微生物遗传）微生物个体微小的特点也决定了微生物个体微小的特点也决定了显微技术显微技术是进行微生物研究是进
16、行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态个体形态及其及其内部结构内部结构只能只能通过显微镜才能进行观察和研究。通过显微镜才能进行观察和研究。（P12P12第一段第一段）微生物的基本特点：微生物的基本特点：小！参见参见P13P13第二节第二节 显微镜和显微技术显微镜和显微技术几个基本概念：几个基本概念：放大放大 分辨率分辨率 反差反差被观察物越小，放大倍数应越大，否则难以看清！被观察物越小，放大倍数应越大，否则难以看清！特定条件下能辨析的两点之间的最小距离特定条件下能辨析的两点之间的最小距离被观察物区别于背景的程度被观察物区别于背景的程度被
17、观察物区别于背景的程度与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显微技术。好的标本制作和观察技术，这就是显微技术。P21 P21 倒数第一段倒数第一段参见参见 P 21P 21100%200%800%一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理1.1.普通光学显微镜普通光学显微镜复复式式显显微微镜镜一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理1.1.普通光学显微镜普通光学显微镜光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什
18、么？如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？目镜：目镜：10 15；物镜：；物镜：100；总放大倍数；总放大倍数10001500；使用油镜，即在使用油镜，即在100100物镜和载玻片之间滴加香柏油；物镜和载玻片之间滴加香柏油；参见参见P 22P 22 0.5 l l最小可分辨距离最小可分辨距离(分辨率）分辨率）=n sin q q1.1.普通光学显微镜普通光学显微镜分辨率与所用波长成反比！分辨率与所用波长成反比！参见参见P 22P 220.61(/2)Dn Sinl分辨率 1.1.普通光学显微镜普通光学显微镜 0.5 l l分辨率（最
19、小可分辨距离）分辨率（最小可分辨距离）=n sin q qq q为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离低倍镜的分辨率低于高倍镜低倍镜的分辨率低于高倍镜参见参见P 22P 221.1.普通光学显微镜普通光学显微镜 0.5 l l分辨率（最小可分辨距离）分辨率（最小可分辨距离）=n sin q qN N：玻片与物镜间介质的折射率玻片与物镜间介质的折射率显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质空气（空气（n=1.0n=1.0）、）、水（水（n=1.33n=1.33）、）、香柏油（香柏油（n=1.52
20、n=1.52）参见参见P 22P 22用浸没油取代空气的作用：用浸没油取代空气的作用：介质折射率提高介质折射率提高分辨率得到提高分辨率得到提高参见参见P 22 P 22 第第2 2大段大段光线在穿过折射率不同的介质时发生折射光线在穿过折射率不同的介质时发生折射改变光折射角度改变光折射角度增加照明亮度增加照明亮度很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的光线可以进入物镜，使很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的光线可以进入物镜，使照明亮度提高照明亮度提高，改善观察效果改善观察效果。（P22 P22 第第2 2大段）大段）浸没油与玻璃的折射率相近浸没油与玻璃的折射率相近物物镜镜特特
21、性性搜索物镜低倍镜高倍镜油镜放放大大倍倍数数41040-4590-100数数值值孔孔径径值值0.100.250.55-0.651.25-1.4焦焦距距（f）40 mm16 mm4 mm1.8-2.0 mm工工作作距距离离17-20 mm4-8 mm0.5-0.7 mm0.1 mm450nm光光源源（蓝蓝光光）时时的的分分辨辨率率2.3 m0.9 m0.35 m0.18 m光学显微镜物镜的特性光学显微镜物镜的特性人眼的分辨能力在人眼的分辨能力在0.2 0.2 mmmm左右，因此光学显微镜的最大左右，因此光学显微镜的最大有效放大倍数（使用油镜）是有效放大倍数（使用油镜）是1,0001,000到到1
22、,5001,500。参见参见P 22P 22一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理2.2.暗视野显微镜暗视野显微镜普通光学显微镜又称普通光学显微镜又称明视野显微镜明视野显微镜 其照明光线直接进入视野，属其照明光线直接进入视野，属透射照明透射照明。（参见（参见P 23 P 23 第第1 1大段）大段）一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理2.2.暗视野显微镜暗视野显微镜参见参见P 23 P 23 第第1 1大段大段一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理3.相差显微镜相差显微镜相差显微镜用特殊的聚光器和物镜来强化生物不同结构的相差显微镜用特殊的聚光器和物镜来强化生物不同结构的折射
23、率差异。光通过具有不同折射率的物体会减速并发生折射率差异。光通过具有不同折射率的物体会减速并发生衍射不同介质中的差异会导致亮度的不同。衍射不同介质中的差异会导致亮度的不同。参见参见P 23 第第2大段大段许多染料会杀死微生物，因此大多数微生物活体无法进行染色观察。许多染料会杀死微生物，因此大多数微生物活体无法进行染色观察。一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理5.5.透射电子显微镜；透射电子显微镜；6.6.扫描电子显微镜扫描电子显微镜分辨率与所用分辨率与所用波长成反比！波长成反比！参见参见P 24P 24电子束电子束通过电磁场时会产生复杂的螺旋式运动，但最终的结果是正如光线通过通过电磁场
24、时会产生复杂的螺旋式运动，但最终的结果是正如光线通过玻璃透镜时一样，产生偏转、汇聚或发散，并同样可以玻璃透镜时一样，产生偏转、汇聚或发散，并同样可以聚集成像聚集成像。而一束电。而一束电子具有波长很短的电磁波的性质，其波长与运动速度成反比，速度越快，波长越子具有波长很短的电磁波的性质，其波长与运动速度成反比，速度越快，波长越短。在理论上，电子波的波长最短可达到短。在理论上，电子波的波长最短可达到0.005 nm0.005 nm，所以电子显微镜的，所以电子显微镜的分分辨能力辨能力要远要远高于光学显微镜高于光学显微镜。（P24P24第第2 2大段）大段）一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理5
25、.5.透射电子显微镜；透射电子显微镜；6.6.扫描电子显微镜扫描电子显微镜参见参见P25P25一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理5.5.透射电子显微镜；透射电子显微镜；6.6.扫描电子显微镜扫描电子显微镜参见参见P25P25类型特点现象用途明视野显微镜使用可见光，操作最简单，价格最便宜染色或透明标本处在明亮的背景下观察染过色的死菌体或具明显反差的带色活菌体暗视野显微镜借助可见光，并采用可以使光线以一定角度从标本反射的专门聚光器明亮的标本在黑暗的背景中观察未染色的活菌体或难以染色的微生物，可以观察其运动情况相差显微镜使用可见光加物镜中的相板，并通过特殊聚光器使部分光线照到标本后以不同相
26、彼此分开样本呈现出不同的亮度和暗度详细观察未染色的活体微生物内部结构透射电子显微镜使用电子束代替光束，电磁透镜代替光学透镜；图像被投射在荧光屏上；价格昂贵；准备工作耗时，并需经验高倍放大，细节清晰的图像；除采用投影法，均不是三维图通过观察细胞的薄切片来察看细胞内外部和病毒的细微结构，或使冰冻断裂法观察其表面扫描电子显微镜使用电子束和电磁透镜；价格昂贵；准备工作耗时且需要经验表面的三维视图观察细胞外表面或内表面二、显微观察样品的制备二、显微观察样品的制备略！第二章思考题第二章思考题1、为什么无菌技术和纯培养技术是微生物学建立与发展的、为什么无菌技术和纯培养技术是微生物学建立与发展的 基石？基石？
27、2、试分析比较各种获得微生物纯培养方法的特点、试分析比较各种获得微生物纯培养方法的特点3、试利用表格形式对各类显微镜在原理、样品制备和观察、试利用表格形式对各类显微镜在原理、样品制备和观察 方面的异、同进行概括、比较。方面的异、同进行概括、比较。4、你认为样品制备和显微观察中（、你认为样品制备和显微观察中（光镜和电镜光镜和电镜）应通过哪）应通过哪 些方法改变样品的反差以改善观察效果？些方法改变样品的反差以改善观察效果？5、试找到一篇使用微生物照片的科学文献试找到一篇使用微生物照片的科学文献（科研论文）（科研论文），分析该文为什么要使用微生物照片，采用的是何种显微分析该文为什么要使用微生物照片，采用的是何种显微 观察技术？依你之见，该文作者的这张照片还可以用哪观察技术？依你之见，该文作者的这张照片还可以用哪 些技术获得？些技术获得？
