1、激光拉曼光谱法Laser Raman spectroscopy一、一、激光拉曼法光谱概述激光拉曼法光谱概述二、激光拉曼光谱原理二、激光拉曼光谱原理三、激光拉曼光谱仪三、激光拉曼光谱仪四、激光拉曼光谱分析法的应用四、激光拉曼光谱分析法的应用0:18:46一、激光拉曼光谱法概述Rayleigh散射：弹性碰撞：无能量交换，仅改变方向。Raman散射：非弹性碰撞：方向改变且有能量交换。Rayleigh散射Raman散射 h E0E1=1=0h 0h 0h 0h 0+E1+h 0E0+h 0h(0-)激发虚态 E0基态，E1振动激发态；E0+h0，E1+h0 激发虚态。0:18:46The Nobel
2、Prize in Physics 1930 “for his work on the scattering of light and for the discovery of the effect named after him”Sir Chandrasekhara Venkata Raman (1888 1970)Calcutta University Calcutta,India 1928年印度物理学家年印度物理学家Raman 发现，发现，1930年获诺贝尔奖，年获诺贝尔奖，1960年快速发展年快速发展0:18:46拉曼（拉曼（C.V.Raman）于）于1928年首次发现的。年首次发现的。
3、19281940年，受到广泛的重视，曾是研究分子结构的年，受到广泛的重视，曾是研究分子结构的主要手段。这是因为可见光分光技术和照相感光技术已主要手段。这是因为可见光分光技术和照相感光技术已经发展起来的缘故；经发展起来的缘故；19401960年，拉曼光谱的地位一落千丈。主要是因为年，拉曼光谱的地位一落千丈。主要是因为拉曼效应太弱（约为入射光强的拉曼效应太弱（约为入射光强的10-6），并要求被测样），并要求被测样品的体积必须足够大、无色、无尘埃、无荧光等等。所品的体积必须足够大、无色、无尘埃、无荧光等等。所以到以到40年代中期后，红外技术的进步和商品化更使拉曼年代中期后，红外技术的进步和商品化更使
4、拉曼光谱的应用一度衰落；光谱的应用一度衰落；拉曼散射效应的进展：拉曼散射效应的进展：0:18:461960年以后，激光技术的发展使拉曼技术得以复年以后，激光技术的发展使拉曼技术得以复兴。这是由于激光器输出的激光具有很好的兴。这是由于激光器输出的激光具有很好的单色单色性、方向性，且强度很大性、方向性，且强度很大，因而它们成为获得拉，因而它们成为获得拉曼光谱的近乎理想的光源，特别是连续波曼光谱的近乎理想的光源，特别是连续波氩离子氩离子激光器激光器。于是拉曼光谱学的研究又变得非常活跃。于是拉曼光谱学的研究又变得非常活跃了，其研究范围也有了很大的扩展。随探测技术了，其研究范围也有了很大的扩展。随探测技
5、术的改进和对被测样品要求的降低，目前在物理、的改进和对被测样品要求的降低，目前在物理、化学、医药、工业等各个领域拉曼光谱得到了广化学、医药、工业等各个领域拉曼光谱得到了广泛的应用，越来越受研究者的重视。除扩大了所泛的应用，越来越受研究者的重视。除扩大了所研究的物质的品种以外，在研究燃烧过程、探测研究的物质的品种以外，在研究燃烧过程、探测环境污染、分析各种材料等方面拉曼光谱技术也环境污染、分析各种材料等方面拉曼光谱技术也已成为很有用的工具。已成为很有用的工具。0:18:46拉曼光谱技术的优点拉曼光谱技术的优点 提供快速、简单、可重复、且更重要的是无损伤的定提供快速、简单、可重复、且更重要的是无损
6、伤的定性定量分析，它无需样品准备，样品可直接通过光纤性定量分析，它无需样品准备，样品可直接通过光纤探头或者通过玻璃、石英、和光纤测量。此外探头或者通过玻璃、石英、和光纤测量。此外 1、由于水的拉曼散射很微弱，拉曼光谱是研究水溶、由于水的拉曼散射很微弱，拉曼光谱是研究水溶液中的生物样品和化学化合物的理想工具。液中的生物样品和化学化合物的理想工具。2、拉曼一次可以同时覆盖、拉曼一次可以同时覆盖50-4000波数的区间，可对波数的区间，可对有机物及无机物进行分析。相反，若让红外光谱覆盖有机物及无机物进行分析。相反，若让红外光谱覆盖相同的区间则必须改变光栅、光束分离器、滤波器和相同的区间则必须改变光栅
7、、光束分离器、滤波器和检测器检测器0:18:46 3、拉曼光谱谱峰清晰尖锐，更适合定量研究、数据库拉曼光谱谱峰清晰尖锐，更适合定量研究、数据库搜索、以及运用差异分析进行定性研究。在化学结构分搜索、以及运用差异分析进行定性研究。在化学结构分析中，独立的拉曼区间的强度可以和功能集团的数量相析中，独立的拉曼区间的强度可以和功能集团的数量相关。关。4、因为激光束的直径在它的聚焦部位通常只有、因为激光束的直径在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫毫米，常规拉曼光谱只需要少量的样品就可以得到。这是米，常规拉曼光谱只需要少量的样品就可以得到。这是拉曼光谱相对常规红外光谱一个很大的优势。而且，拉拉曼光谱相对常规红
8、外光谱一个很大的优势。而且，拉曼显微镜物镜可将激光束进一步聚焦至曼显微镜物镜可将激光束进一步聚焦至20微米甚至更小，微米甚至更小，可分析更小面积的样品。可分析更小面积的样品。5、共振拉曼效应可以用来有选择性地增强大生物分子、共振拉曼效应可以用来有选择性地增强大生物分子特个发色基团的振动，这些发色基团的拉曼光强能被选特个发色基团的振动，这些发色基团的拉曼光强能被选择性地增强择性地增强1000到到10000倍。倍。0:18:461 瑞利散射与拉曼散射光线通过试样，透射仍为主体波长远小于粒径，小部分散射散射：仅改变方向，波长不变。弹性碰撞无能量交换瑞利散射不变垂直方向观测,原波长两侧还有散射光非弹性
9、碰撞，有能量交换，波长有变化拉曼散射变二、拉曼光谱原理（一）Raman散射与Raman位移0:18:461 1.Raman散射散射Raman散射的两种跃迁能量差：E=h(0-)产生stokes线；强；基态分子多。E=h(0+)产生反stokes线；弱。Raman位移：Raman散射光与入射光频率差。Raman散射与Raman位移0:18:462.Raman位移 (1)对不同物质：不同。(2)对同一物质：与入射光频率无关；表征分子振-转能级的特征物理量；定性与结构分析的依据；分子振-转光谱；与红外光谱互补。(3)Raman散射的产生：光电场E中，分子产生诱导偶极矩，即 =E 分子极化率，分子电子
10、云分布改变的难易程度。0:18:46=|0 s|,即散射光频率与激发光频之差。v取决于分子振动能级的改变，所以他是特征的。适用于分子结构分析与入射光波长无关0:18:463.3.红外活性和拉曼活性振动红外活性和拉曼活性振动红外活性振动红外活性振动 .永久偶极矩；极性基团。.瞬间偶极矩；非对称分子。红外活性振动-伴有偶极矩变化的振动可以产生红外吸收谱带。拉曼活性振动拉曼活性振动 诱导偶极矩 =E 非极性基团，对称分子。拉曼活性振动-伴随有极化率变化的振动。对称分子：对称振动拉曼活性。不对称振动红外活性 Eeer0:18:46(二)Raman光谱CCl4的的Ramam光谱图光谱图 0:18:461
11、.Raman光谱特点(1)(1)拉曼光谱记录的是拉曼光谱记录的是stoke stoke 线。线。(2)测量相对单色激发光频率的位移。测量相对单色激发光频率的位移。把入射光频率位置作为零，频率位移(拉曼位移)的数值正好对应于分子振动或转动能级跃迁的频率。(3)激发光是可见光，在可见光区测分子振动光谱。激发光是可见光，在可见光区测分子振动光谱。(4)拉曼光谱中的基团振动频率和红外光谱相同。拉曼光谱中的基团振动频率和红外光谱相同。酮羰基的伸缩振动在红外光谱中位于1710cm-1附近，而拉曼光谱中总在（1710土3）cm-1。0:18:462 拉曼光谱的谱图特征由拉曼光谱可以获得有机化合物的各种结构信
12、息：2）红外光谱中，由CN，CS，SH伸缩振动的谱带较弱或强度可变，而拉曼光谱中则是强谱带。3）强极性基团在拉曼中是弱谱带如极性基因CO在红外中是强谱带，而在Raman中是弱谱带。1）同种原子非极性键SS，CC，NN，CC,强拉曼谱带，随单键双键三键谱带强度增加。0:18:464）环状化合物的对称呼吸振动常常是最强的拉曼谱带。形成环状骨架的键同时振动。5）在拉曼光谱中，XYZ，CNC，OCO这类键的对称伸缩振动是强谱带，反之，非对称伸缩振动是弱谱带。红外光谱与此相反。6）CC伸缩振动谱带在拉曼光谱中强，红外光谱中弱。0:18:467）醇和烷烃的拉曼光谱是相似的。I.CO键与CC键的力常数或键的
13、强度没有很大差别。II.羟基和甲基的质量仅相差2单位。III.与CH和NH谱带比较，OH拉曼谱带较弱。0:18:463.3.红外与拉曼谱图对比红外与拉曼谱图对比红外光谱：基团；拉曼光谱：分子骨架测定。0:18:46红外与拉曼谱图对比红外与拉曼谱图对比0:18:464 拉曼光谱与红外光谱的关系同同属分子振(转)动光谱异：红外分子对红外光的吸收强度由分子偶极距决定异：拉曼分子对激光的散射强度由分子极化率决定红外：适用于研究不同原子的极性键振动 OH,CO，CX拉曼：适用于研究同原子的非极性键振动 NN,CC互补0:18:46拉曼光谱与红外光谱的关系O=C=O对称伸缩O=C=O反对称伸缩偶极距不变无
14、红外活性极化率变有拉曼活性极化率不变无拉曼活性偶极距变有红外活性0:18:46拉曼光谱与红外光谱的关系互排法则：有对称中心的分子其分子振动 对红外和拉曼之一有活性，则另一非活性互允法则：无对称中心的分子其分子振动 对红外和拉曼都是活性的。结构分析：H4C4N4拉曼C=C 1623 cm-1 强红外C=C 1621 cm-1 强CCCNCNN H2N H20:18:47(三)拉曼光谱选律 对称中心分子CO2，CS2等，选律不相容。无对称中心分子（例如SO2等），三种振动既是红外活性振动，又是拉曼活性振动。SCSSCSSCS 1 2 3 4拉曼活性红外活性红外活性拉曼光谱拉曼光谱源于极化率变化源于
15、极化率变化红外光谱红外光谱源于偶极矩变化源于偶极矩变化0:18:47三、激光拉曼光谱仪（结构流程）（一）结构流程（一）结构流程激光光源激光光源、试样池试样池、单色器、检测器。单色器、检测器。0:18:47激光器最常用Ar激光器 488.0/514.5nm频率高，拉曼光强大He-Ne激光器，波长632.8 nm。试样室发射透镜 使激光聚焦在样品上收集透镜 使拉曼光聚焦在双单色仪的入射狭缝（二）主要部件0:18:47双单色仪仪器心脏2个光栅，4个狭缝减少杂散收光检测器 光电倍增管，光子计数器0:18:47（三）傅里叶变换-拉曼光谱仪光源：Nd-YAG钇铝石榴石激光器（1.064 m）。检测器：高灵
16、敏度的铟镓砷探头。0:18:47傅里叶变换傅里叶变换-拉曼光谱仪特点拉曼光谱仪特点特点：特点：（1）避免了荧光干扰；）避免了荧光干扰；（2）精度高；）精度高；（3）消除了瑞利谱线；）消除了瑞利谱线；（4）测量速度快。）测量速度快。0:18:47 当激发光的频率接近或等于试样的电子吸收谱当激发光的频率接近或等于试样的电子吸收谱带的频率时，发生共振拉曼效应。带的频率时，发生共振拉曼效应。当激发光的频率接近电子吸收谱带的频率时，当激发光的频率接近电子吸收谱带的频率时，称为准共振拉曼效应。称为准共振拉曼效应。当激发光的频率等于电子吸收谱带的频率时，当激发光的频率等于电子吸收谱带的频率时，称为严格的共振
17、拉曼效应。称为严格的共振拉曼效应。1 共振拉曼光谱RRS（四）发展 拉曼强度增万至百万倍，高灵敏度，宜定量 共振，高选择性 可调染料激光器0:18:471.多谱线输出的激光器（或可调谐的激光器）。多谱线输出的激光器（或可调谐的激光器）。2.试试样的浓度必须很低样的浓度必须很低 避免产生热分解作用，通常在10-8 molL-1左右。共振拉曼散射的强度较普通拉曼谱带的强度增加104106倍，需要的试样浓度很低，故在研究具有发色基团的样品和低浓度的生物样品有很大应用。测量测量共振拉曼效应时的注意点：共振拉曼效应时的注意点：0:18:472 表面增强拉曼光谱SERS 试样吸附在金属表面上，增10310
18、6 表面与共振联用检测限1091012 mol/L1.保证使用环境：具备暗室条件；无强震动源、无强电磁干扰；不可受阳光直射。2.光学器件表面有灰尘，不允许接触擦拭，可用气球小心吹掉。3.实验结束，首先取出样品，关断电源。4.注意激光器电源开、关机的顺序正好相反。表面增强拉曼使用中的注意事项0:18:47四、激光拉曼光谱法的应用（一）（一）拉曼光谱与红外光谱的比较拉曼光谱与红外光谱的比较0:18:47（二）无机体系 优于红外，基于MOrg键的振动 MO也具有Raman活性 Raman谱证实：V(IV)是VO2不是V(OH)22 硼酸离解是B(OH)4-不是H2(BO)3 Raman光谱可求H2S
19、O4等强酸的解离常数0:18:47（三）有机化合物 与红外互补，Raman适骨架，IR适端基 C=C1900-1500vs-mo-wN=N芳取代1440-1410mo 振动/cm-1 拉曼强度红外强度 O-H 3650-3000ws0:18:47（四）在生命科学领域额 1、生物分子的鉴定与结构表征 拉曼光谱技术在测量生物分子时,具有结构信息量大,测量速度快,操作方便等优点,尤其是在测量DNA 水溶液时,几乎不受水的干扰,故在DNA 的研究中非常直接和有效。通过对DNA 分子的拉曼光谱研究,可以从分子水平上了解遗传、代谢、分化及癌变等过程的生命本质。2、药物与生物分子的作用机理探讨 药物和生物大
20、分子的相互作用机理可通过其拉曼光谱图中新谱带的出现，谱带位移和谱带强度变化等加以研究。对药物和生物大分子相互作用的研究,有助于加深理解药物与生物大分子 的作用机理、探索新的有效的药物。实例：抗坏血酸主要是通过OH 的氢键和C2O 基团与DNA的磷酸盐、碱基及脱氧核酸供体原子发生相互作用。0:18:473、细胞、组织和器官的活体与体外检测 组织和细胞发生癌变总是从构成它们的分子开始，癌变过程中组织和细胞发生癌变总是从构成它们的分子开始，癌变过程中各种生物分子的构型、构象及各成分的构成比例发生变化。这各种生物分子的构型、构象及各成分的构成比例发生变化。这些早期变化不引起临床症状且常规的临床检测手段
21、往往难以发些早期变化不引起临床症状且常规的临床检测手段往往难以发现，而拉曼光谱可反映分子的精细结构、振转结构，能够从分现，而拉曼光谱可反映分子的精细结构、振转结构，能够从分子水平上检测出这些变化，已成为早期诊断癌症的潜在途径。子水平上检测出这些变化，已成为早期诊断癌症的潜在途径。组织细胞在发生癌变后氨基酸、脂类、碳水化合物都可能发生组织细胞在发生癌变后氨基酸、脂类、碳水化合物都可能发生变化，可能成为特征拉曼标志光谱。通过正常和癌变组织细胞变化，可能成为特征拉曼标志光谱。通过正常和癌变组织细胞的拉曼光谱对比分析可以得出癌变组织内生物分子结构及其含的拉曼光谱对比分析可以得出癌变组织内生物分子结构及
22、其含量的变化，在分子和细胞水平上来诊断疾病，为癌症的早期诊量的变化，在分子和细胞水平上来诊断疾病，为癌症的早期诊断及癌变机理的分析提供重要的理论基础。相对于其他方法，断及癌变机理的分析提供重要的理论基础。相对于其他方法，拉曼光谱用于医学诊断是一种具有拉曼光谱用于医学诊断是一种具有非破坏性非破坏性、灵敏度高灵敏度高和和高度高度自动化自动化等优点的崭新技术。等优点的崭新技术。0:18:47实例 胃癌组织与胃正常黏膜组织间存在明显差异，正常组织的酰胺振动分裂为1660cm-1、1640cm-1 两个峰，而癌变组织仍保留单峰特征，并略向高波数位移，这反映出胃黏膜组织发生癌变后蛋白质的种类发生了变化。更为重要的是，位于15251585cm-1 处的特征振动峰的相对强度在癌变组织中明显减弱，此峰应归属于脂类物质中非饱和脂肪酸的C=C伸缩振动，说明组织细胞癌变过程中耗能快，脂类物质难以在组织和细胞内聚集，因而含量降低。1445cm-1 与1655cm-1 的拉曼光谱强度比能很好的区别肺正常组织与癌组织。还有关于乳腺癌、皮肤癌、结肠癌、宫颈癌，颅内肿瘤的报道。0:18:47思考题 什么是Raman散射、Stockes线和反Stockes线？什么是Raman位移？Raman光谱法与红外谱法相比，在结构分析中的特点是什么？通过文献查阅，举出共振拉曼光谱和表面增强拉曼光谱的应用例子。
