1、1“”荧光与荧光分析荧光与荧光分析概述概述基本原理基本原理荧光分析荧光分析仪器与技术仪器与技术应用与示例应用与示例目目录录3光学光谱区光学光谱区远紫外远紫外近紫外近紫外 可见光可见光 近红外近红外中红外中红外 远红外远红外（真空紫外）（真空紫外）10nm200nm200nm 380nm380nm 780nm780 nm 2.5 m2.5 m 50 m50 m 300 m一、概述一、概述4荧光的发现及发展荧光的发现及发展l 1575年，西班牙医生年，西班牙医生N.MonardesN.Monardes首先发现荧光首先发现荧光l 1852年，年，StokesStokes发现荧光波长比照射光波长发现荧
2、光波长比照射光波长 要长，认定荧光是发射光。要长，认定荧光是发射光。l 1867年，首次用于分析测定。年，首次用于分析测定。l 1952年，商品荧光分光光度计出现。年，商品荧光分光光度计出现。l 2008年，年，日本村修、美国马丁日本村修、美国马丁沙尔菲、美籍沙尔菲、美籍 华裔钱永健因从水母中发现并发展了绿色荧光蛋华裔钱永健因从水母中发现并发展了绿色荧光蛋 白质技术而获诺贝尔化学奖。白质技术而获诺贝尔化学奖。5 什么是荧光什么是荧光？当当紫外或可见光紫外或可见光照射到照射到某些某些物质上时，这物质上时，这些物质就会些物质就会发射发射出波长和强度各不相同的出波长和强度各不相同的光线，停止照射光照
3、射时，这种光线光线，停止照射光照射时，这种光线马上马上或逐渐或逐渐消失，这就是荧光消失，这就是荧光。二、基本原理二、基本原理6分子发光的类型分子发光的类型分子发光的类型可以按两种不同的办法加以分类,其中一种以激发的模式加以分类,另一种是按分子激发态的类型来分类.按分子激发态分子激发态的类型：荧光:由第一电子激发单重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象.磷光:由最低的电子激发三重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象.按激发模式激发模式分类:光致发光:分子因吸收外来辐射的光子能量被激发所产生的发光.化学发光:分子的激发能量是由反应的化学能提供.生物发光:分子的激发能量是由生物体释放出来的能量提供.热致
4、发光:由热活化的离子复合激发模式所引起的发光现象.场致发光:由电荷注入激发模式所产生的发光.摩擦发光:由摩擦激发模式所产生的发光.荧光产生的基本原理内转换（Internal Conversion，IC）:对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。系间跨跃（Intersystem Conversion，ISC）:系间跨跃是发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如从S1到T1，该跃迁是禁阻的。然而，当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发
5、生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁，该过程称为系间跨跃。荧光:分子电子从单重激发态的最低振动能级在很短时间（10-9-10-6s）跃迁到基态各振动能层时所产生的光子辐射称为荧光。磷光:分子电子从三重态最低振动能层，跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。单重态和三重态单重态和三重态 电子激发态的多重度电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(0或或1)；单重态：单重态：全部轨道里的电子都是自旋配对的，全部轨道里的电子都是自旋配对的，S=0,M=1；三重态：三重态：分子具有自旋不配对的电子，分子具有自旋不配对的电子，S=1,M=3.平行自旋比成
6、对自旋稳定平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则洪特规则)，三重态能级比相应单重，三重态能级比相应单重态能级低；态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态处于单重态；处于单线态和三线态下的分子的电子受激发激发单重(线)态：分子吸收能量，电子自旋仍然配对，为单重(线)态，称为激发单重态，以S1，S2表示激发三重(线)态：分子吸收能量，电子自旋不再配对为三重，称为激发三重态，以T1，T2.表示。基态：电子自旋配对多重度=2s+1=1，为单重(线)态，以S0表示。电子跃迁电子跃迁 处于激发态的电子，通常以处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式辐射跃迁方式或或无辐无辐射跃迁方式射跃迁方式再
7、回到基态。再回到基态。辐射跃迁辐射跃迁主要涉及到主要涉及到荧光、延迟荧光荧光、延迟荧光或或磷光磷光的辐射；的辐射；无辐射跃迁无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振振动弛豫（动弛豫（VRVR）、内转移（内转移（IRIR）、外转移（外转移（ECEC）及及系间窜越系间窜越（ISCISC）等。）等。各种跃迁方式发生的可能性及程度，与各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本荧光物质本身的结构身的结构及及激发时的物理和化学环境等因素激发时的物理和化学环境等因素有关。有关。基态单重态基态单重态激发单重态激发单重态激发三重态激发三重态区别：电子自旋方向不同
8、，激发三重态的能级稍低一些。区别：电子自旋方向不同，激发三重态的能级稍低一些。电子跃迁类型电子跃迁类型允许跃迁允许跃迁禁阻跃迁禁阻跃迁S0S1,S2,S3 T1,T2,T3 在单重激发态中，两个电子平行自旋，在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态单重态分子分子具有具有抗磁性抗磁性，其激发态的，其激发态的平均寿命平均寿命大约为大约为1010-8-8s s，而，而三重态三重态分分子具有子具有顺磁性顺磁性，其激发态的平均寿命为，其激发态的平均寿命为1010-4-4 1s 1s以上（通常以上（通常用用S S和和T T分别表示单重态和三重态）。分别表示单重态和三重态）。电子跃迁类型电子跃迁类型激发态与
9、基态中的电子自旋方向相反，称为激发单重态激发态与基态中的电子自旋方向相反，称为激发单重态 （S）抗磁性）抗磁性激发态与基态中的电子自旋方向相同，称为激发三重态激发态与基态中的电子自旋方向相同，称为激发三重态 （T）顺磁性）顺磁性区别：电子自旋方向不同，区别：电子自旋方向不同，激发三重态的能级稍低一些。激发三重态的能级稍低一些。分子的去激发分子的去激发无辐射跃迁无辐射跃迁辐射跃迁辐射跃迁荧光（荧光（F）磷光（磷光（P）振动弛豫振动弛豫内转移内转移外转移外转移体系间跨越体系间跨越分子的去激发分子的去激发辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光：受光激发的分子从：受光激发的分子从第一激发单重态第一激发单重态的最低振
10、的最低振动能级回到基态所发出的辐射。寿命为动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 10-11s。由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数速率常数kf为为106109s-1。磷光磷光：从从第一激发三重态第一激发三重态的最低振动能级回到基态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为10-4 10s。在光照停止后，仍可持续一段时间在光照停止后，仍可持续一段时间。无辐射跃迁无辐射跃迁振动弛豫振动弛豫它
11、是指它是指在同一电子能级在同一电子能级中，中，电子由高振动能级转至低振电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出动能级，而将多余的能量以热的形式发出。发生振动弛。发生振动弛豫的时间为豫的时间为1010-12-12s s数量级数量级。内转换内转换 当当两个电子能级两个电子能级非常靠近以至其振动能级有非常靠近以至其振动能级有重叠重叠时，时，常发生电子由高能级以常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式无辐射跃迁方式转移至低能级。转移至低能级。外转移外转移 指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一
12、现及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为象称为“熄灭熄灭”或或“猝灭猝灭”。荧光与磷光的根本区别荧光与磷光的根本区别：荧光荧光是由激发是由激发单重态单重态最低振动能层至基态各振动能最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的；层间跃迁产生的；磷光磷光是由是由激发三重态激发三重态的最低振动能层至基态各振动的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。能层间跃迁产生的。系间窜越系间窜越 指指不同多重态间不同多重态间的的无辐射跃迁无辐射跃迁，例如例如S S1 1TT1 1就是一种体系间跨跃。就是一种体系间跨跃。通常，发生体系间跨跃时，电子通常，发生体系间跨跃时，电子由由S S1 1的较低振
13、动能级转移至的较低振动能级转移至T T1 1的的较高振动能级处。有时，通过热较高振动能级处。有时，通过热激发，有可能发生激发，有可能发生T T1 1SS1 1，然后，然后由由S S1 1发生荧光。这是产生发生荧光。这是产生延迟荧光的机理延迟荧光的机理。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。轨道耦合进行。hvAhvFS1T1S0hvP19S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越系间跨越内转换内转换振动弛豫振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换内转换振动弛豫20荧光的类型荧光的类型发射机制发射机制考虑：
14、瞬时荧光和迟滞荧光（1）瞬时荧光瞬时荧光:通常在吸收激发光后大约10-8s 内发射的,是由激发过程中最初生成的S1电子态所产生的辐射.瞬时荧光可能由处于S1电子态的分子电子态的分子或S1激发态分子与基态分子所形成的激发激发态分子与基态分子所形成的激发态二聚体态二聚体产生的。低浓度(10-6M)芘溶液,荧光是紫色的,荧光光谱有结构特征高浓度(10-3M)芘溶液,荧光是蓝色的,荧光光谱没有结构特征(2)迟滞荧光迟滞荧光 物质分子在刚性或粘稠介质中,除了磷光谱外,还可能观察到另一种长寿命的发射谱带,但这个发射谱带波长比磷光谱带波长要短.往往把这种长寿命发射的谱带长寿命发射的谱带称为迟滞荧光.迟滞荧光
15、分为E-型迟滞荧光,P-型迟滞荧光和复合荧光三种类型.E-型迟滞荧光型迟滞荧光:处于T1电子态的分子,经热活化提高能量后而处于S1电子能态,然后自S1电子态辐射跃迁产生荧光.P-型迟滞荧光型迟滞荧光:这类荧光,其S1电子激发分子的布居,是由两个处于T1电子态的分子相互作用时所引起的,此过程称为“三重态-三重态粒子湮没”,结果产生一个激发单重态分子.复合荧光复合荧光其第一电子激发单重态分子的布居，是由自由基离子和电子复合或具有相反电荷的两个自由基离子复合引起的。比较荧光和激发光的波长荧光和激发光的波长考虑：斯托克斯（stokes)荧光反斯托克斯荧光（antistokes)共振荧光斯托克斯（斯托克
16、斯（stokes)荧光荧光 在溶液中观察到的荧光,其发射的荧光比激发光的波长要长。激发光荧光分子碰撞引起的能量损失S0S1反斯托克斯荧光（反斯托克斯荧光（antistokes)如果在吸收光子的过程又附加热能给予激发态分子,则发射的荧光波长比激发光的波长短.这种荧光可在高温的稀薄气体中观察到.激发光荧光吸收热能S0S1共振荧光共振荧光 与激发光具有相同波长的荧光,这类荧光在气体和结晶才有可能发生.激发光荧光S0S126荧光的检测荧光的检测单色器单色器光源光源检测器检测器狭缝狭缝单色器单色器吸吸收收池池狭缝狭缝exemI0It三、荧光测量三、荧光测量27 光谱特征光谱特征 任何荧（磷）光都具有两种
17、特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧（磷）光定性分析的基础。1）激发光谱激发光谱 改变激发波长，测量在最强荧（磷）光发射波长处的强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激发过程。激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适宜的激发波长。2）发射光谱发射光谱发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波长辐照荧光物质，产生不同波长的强度的荧光，以荧光强度对其波长作图可得荧光发射光谱。由于不同物质具不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。291）波长比较波长比较 与激发（或
18、吸收）波长相比，荧光发射波长更长，即产生所谓Stokes位移。（振动弛豫失活所致）2）形状比较形状比较 荧光光谱形状与激发波长无关。尽管分子受激后可到达不同能层的激发态，但由于去活化（内转换和振动弛豫）到第一电子激发态的速率或几率很大，好像是分子受激只到达第一激发态一样。换句话说，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系3）镜像对称）镜像对称 通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系温州大学化材
19、学院微纳结构材料&物理化学研究所31荧光寿命和荧光量子产率荧光寿命和荧光量子产率33 F1和F2分别表示待测物质和参比物质的荧光量子产率；F1和F2分别表示待测物质和参比物质的积分荧光强度；A1和A2分别表示待测物质和参比物质在激发波长下的吸光度。(硫酸喹啉在0.05mol/L硫酸中的荧光量子产率为0.55,是测量荧光量子产率时经常使用的一种参照物.)荧光量子产率的测量方法荧光量子产率的测量方法34分子结构与荧光的关系分子结构与荧光的关系 产生并可观察到荧光的条件：产生并可观察到荧光的条件：i i）分子具有与辐射频率相应的荧光结构）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；（内因）；iiii）
20、吸收特征频率的光后，应可产生具一定）吸收特征频率的光后，应可产生具一定量子效率的荧光。量子效率的荧光。即量子效率即量子效率 F F足够大：足够大：吸吸收收的的光光量量子子数数发发射射的的荧荧光光量量子子数数 F=kf/(kf+K)35分子结构与荧光分子结构与荧光1 1）跃迁类型：）跃迁类型：通常，具有通常，具有 *及及 n*跃迁结构的分跃迁结构的分子才会产生荧光。而且具子才会产生荧光。而且具 *跃迁的荧光效跃迁的荧光效率比率比 n*跃迁的要大得多。跃迁的要大得多。2 2）共轭效应：）共轭效应：共轭度越大，荧光越强。共轭度越大，荧光越强。共轭结构与荧光的关系共轭结构与荧光的关系lex=205nm
21、lex=286nmlex=356nmlem=278nmlem=321nmlem=404nmF=0.11F=0.29F=0.36提高共轭度有利于提高共轭度有利于增加荧光效率增加荧光效率并产生并产生红移红移。3 3）刚性结构和共平面性）刚性结构和共平面性：分子分子刚性刚性（Rigidity）越强越强，分子分子振动少振动少，与其它分子，与其它分子碰撞失活的机率下降，碰撞失活的机率下降，荧荧光量子效率提高光量子效率提高。如荧光素（如荧光素（大）与酚酞大）与酚酞（=0=0）；）；刚性结构和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系OHNNOMg1/28 羟基喹啉羟基喹啉8 羟基喹啉镁羟基喹啉镁形
22、成络合物后形成络合物后,形成刚性平面形成刚性平面空间位阻与荧光的关系空间位阻与荧光的关系CCHHCCHH反式结构，发光反式结构，发光顺式结构，不发光顺式结构，不发光1，2二苯乙烯二苯乙烯4 4）取代基：）取代基：给电子取代基增强荧光（给电子取代基增强荧光（p-共轭），如共轭），如 -OH、-OR、-NH2、-NR2等；等；吸电子基降低荧光，如吸电子基降低荧光，如 -COOH、-C=O、-NO2、-NO、-X等；等；重原子降低荧光但增强磷光重原子降低荧光但增强磷光 如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱到消失，该现象也称重原子效应。渐减弱到消失，该现象
23、也称重原子效应。取代基的影响取代基的影响OHNHH 给电子取代基增强荧光给电子取代基增强荧光NH2,NHR,NR2,OH,OR,等等l lEM285-365 nm270-310 nm310-405 nm相对荧光强度相对荧光强度 1.8 1.0 2.0 吸电子取代基吸电子取代基N+OOCOCOOOOn 电子不与电子不与 电子共轭电子共轭羰基类羰基类 1）n*跃迁禁阻跃迁禁阻，小，小，10-22）最低单重态为最低单重态为 n,*型型，易于易于ISC。荧光弱，磷光荧光弱，磷光强强非荧光非荧光强荧光强荧光OHOH 取代基的位置取代基的位置COOHOHCOHOHOCOOHCOOHOHHO1 1）有利于）
24、有利于电子离域的，则荧光增强。因此，一般电子离域的，则荧光增强。因此，一般邻邻位、对位位、对位给电子基团导致荧光增强。给电子基团导致荧光增强。2 2）有利于形成环，导致分子刚性增大，荧光增强。）有利于形成环，导致分子刚性增大，荧光增强。荧光强度较弱荧光强度较弱荧光强度较强荧光强度较强43荧光定量分析荧光定量分析CLteTLCIITA303.20,lglg（Lambert Beer Law）LC.teTII30320111)1(303200LC.teIII)1()(303200LC.tFeIIII!nx!4x!3x!2x!1x1en432x )!4)bC30.2(!3)bC30.2(!2)bC3
25、0.2(bC30.2(II4320F 对于稀溶液，当对于稀溶液，当 Lc0.05磷光磷光 Lc0.01时时CLIkIFF030.2CLIkIPP030.2磷光强度磷光强度磷光磷光量子产率量子产率CKIF KCIP 1 1标准曲线法标准曲线法 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。2.2.比较法比较法 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。3.3.工作曲线法工作曲线法 用F C作图4.4.比较法比较法 FsF0 KCs FxF0 KCx荧光定量分析方法荧光定量分析方法s0s0 xCFFFF xCsx0 x0sCCFF
26、FF 46荧光分析的特点荧光分析的特点 灵敏度高灵敏度高：视不同物质，检测下限在视不同物质，检测下限在0.10.001 0.10.001 g/mL之间。可之间。可 见比见比 UV-Vis 的灵敏度高得多！的灵敏度高得多！选择性好选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。结构信息量多结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。荧光量子效率、荧光寿命等。应用不广泛应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、
27、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多干扰测量的因素较多47多组分混合物的荧光分析多组分混合物的荧光分析 各组分荧光峰相互不干扰，按单组分测定方法，分各组分荧光峰相互不干扰，按单组分测定方法，分 别在各自的荧光峰处测定；别在各自的荧光峰处测定；如果荧光峰互相干扰，激发光谱相差大，可选择在如果荧光峰互相干扰，激发光谱相差大，可选择在 不同的激发光进行测定，其它组分在此激发波长不不同的激发光进行测定，其它组分在此激发波长不 会产生荧光；会产生荧光；如果在同一激发波长下荧光光谱互相干扰，可以利如果在同一激发波长下荧光光谱互相干扰，可以利 用荧光强度的加和性，解联立方程求
28、出。用荧光强度的加和性，解联立方程求出。48影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素（一）溶剂效应：（一）溶剂效应：溶剂极性可增加或降低荧光强度（改变溶剂极性可增加或降低荧光强度（改变 *及及 n*跃迁的能量）；跃迁的能量）；与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度。或降低荧光强度。（二）温度：（二）温度：温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、粘度或增加、粘度或“刚性刚性”降低）。因此体系降低温降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。度可增加荧光分析灵敏度。（三）（三）pH 值：值：具酸或碱性基团的有机
29、物质，在不同具酸或碱性基团的有机物质，在不同pHpH值时，值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因对无机荧光物质，因 pH 值会影响其稳定性，因值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。而也可使其荧光强度发生改变。OH-H+NH4+H+OH-NH2NH-pH 13pH712（四）内滤光和自吸：（四）内滤光和自吸：体系内存在可以吸收荧光的物质，或体系内存在可以吸收荧光的物质，或荧光物质的荧光短波长与激发光长波长有荧光物质的荧光短波长与激发光长波长有重叠，均可使荧光强度下降，称为内滤光；重叠，均可使荧光强度下降，称为内滤
30、光；当荧光物质浓度较大时，可吸收自身的荧当荧光物质浓度较大时，可吸收自身的荧光发射称为荧光自吸。光发射称为荧光自吸。51荧光猝灭荧光猝灭（1 1）碰撞熄灭）碰撞熄灭Hhvhvk*,k*1QMQMMMMM2 相对速率相对速率激发激发发射发射熄灭熄灭（2 2）能量转移熄灭能量转移熄灭*,*hvhvAADD )(A)D()A()(D)(A)D()A()(D1*0011*001SSSTSSSS*NCH3CH3NCH3CH3+_23*3231OMOM 1k*没有除氧，溶液中没有除氧，溶液中难以观察到磷光难以观察到磷光kT M2M)M(MM*3*3*3*hvhvDDDD 当荧光物质的浓度大于当荧光物质的浓
31、度大于1g/L1g/L时，常发生荧光的自熄灭时，常发生荧光的自熄灭(浓度熄灭浓度熄灭)由于由于 F F 1 1，使荧光，使荧光强度减弱或消失强度减弱或消失.D)(DDD11*由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄灭现象。灭现象。54单色器单色器单色器单色器光源光源。检测器检测器液液 槽槽放大和指示仪表放大和指示仪表荧光分光光度计的结构示意图荧光分光光度计的结构示意图I0I仪器结构示意图仪器结构示意图四、仪器与技术四、仪器与技术 荧光计的主要部件荧光计的主要部件1 1）光源：）光源：氙灯、高压汞灯、激光；氙灯、高压汞灯、激光；2
32、2）样品池：）样品池：石英（低荧光材料）；石英（低荧光材料）；3 3）两个单色器：）两个单色器：选择激发光单色器；分离荧光单色器；选择激发光单色器；分离荧光单色器；4 4）检测器：）检测器：光电倍增管。光电倍增管。56基本装置及主要构件基本装置及主要构件1 1、激发光源、激发光源 （1）条件:足够的强度；紫外，可见区域有连续的光谱；强度与波长无关；光强稳定（2）激发光源:氙灯（高压）:2501000 nm 光谱区呈连续光谱，使用寿命大约为2000h。汞灯（高压）:在紫外区激发，365 nm，使用寿命15003000小时。2 2、单色器、单色器 光栅单色器 有较高的灵敏度，较宽的波长范围，能扫描
33、光谱，主要缺点是杂散光较大，有不同级次的谱线干扰，可用前置滤光片加以消除。滤光片 滤光片便宜简便，在荧光计和荧光分光光度计中有广泛的应用。3 3、样品池、样品池 石英方形池，四面都透光。4 4、狭缝、狭缝 狭缝越小，单色性越好，但光强和灵敏度降低。5 5、检测器、检测器光电倍增管：灵敏度高，线路简单。光电摄像管：具有检测效率高，动态范围 宽，线性响应好，坚固耐用和寿命长特点。6 6、读出装置、读出装置 记录仪、阴极示波器和显示器。59五、荧光分析法的应用五、荧光分析法的应用1 1 无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约与有机试剂配合物后测量；可测量约6060多种元素
34、。多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定2 2 生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析 见表见表 3 3 食品检测方面的应用食品检测方面的应用（1 1）食品中矿物质及金属元素的分析食品中矿物质及金属元素的分析（
35、2 2）食品中氨基酸、维生素等的分析食品中氨基酸、维生素等的分析（3 3）食品霉变物质、菌类污染荧光分析食品霉变物质、菌类污染荧光分析（4 4）食品添加剂、防腐剂、食品包装有害物质分析食品添加剂、防腐剂、食品包装有害物质分析（5 5）食品农药残留、药物残留分析食品农药残留、药物残留分析荧光物质及其应用实例64常见用于标记抗体的荧光染料常见用于标记抗体的荧光染料1.荧光素类荧光素类包括异硫氰酸荧光素（FITC）、羟基荧光素（FAM）、四氯荧光素（TET）等及其类似物。是一类具有较多苯环的化合物。应用最广泛的FITC在488nm处激发，525nm处发射，能够结合各种抗体蛋白，并在碱性溶液中稳定呈现
36、蓝绿色荧光。2.罗丹明类罗丹明类包括红色罗丹明（RBITC）、四甲基罗丹明（TAMRA）、罗丹明B（TRITC）等。TRITC在550nm处激发，570nm处发射黄色荧光。3.Cy系列花氰类系列花氰类通常有两个杂环体系组成，包括Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7及其类似物。654.Alexa系列系列是由Molecular Probes 开发的系列荧光染料。其激发和发射光光谱覆盖大部分可见光和部分红外线光谱区域。以高亮度、稳定性、仪器兼容性、多种颜色、pH值不敏感及水溶性为主要特点。5.蛋白类蛋白类藻红蛋白（PE）、藻蓝蛋白（PC）、别藻蓝蛋白（APC）、多甲藻黄素-叶绿素蛋
37、白（preCP）等，他们大多在蓝藻中发现。这些荧光染料可与Cy系列菁染料偶联形成复合染料用于抗体标记。如市面上常用的有PE-Cy3/Cy5/Cy7、APC-Cy7等Cyanine dyeColourAbsorb(nm)Emit(nm)MM(g/mol)(cm1M1)QuantumYieldAlexa Fluor 350blue34644241019,000-405violet401421102835,000-430green43454170215,000-488cyan-green49551964373,0000.92 500green50252570071,000-514green51754
38、271480,000-532green53255472181,0000.61 546yellow5565731079112,0000.79 555yellow-green5555651250155,0000.1 568orange57860379288,0000.69 594orange-red59061782092,0000.66 610red6126281172144,000-633Far-red6326471200159,000-635Far-red633647-140,000-647Far-red6506651155.067270,0000.33 660Near-IR663690110
39、0132,0000.37 680Near-IR6797021150183,0000.36 700Near-IR7027231400205,0000.25 750Near-IR7497751300290,0000.12 790Near-IR782805-260,000-Alexa FluorDAPIFITC老鼠成纤维细胞老鼠成纤维细胞 绿色:肌动蛋白,FITC 红色:微管蛋白,Cy5 蓝色:细胞核,DAPI牛肺动脉内皮细胞牛肺动脉内皮细胞 线粒体：线粒体：红色，MitoTracker Red CMXRos 过氧过氧化化物酶体物酶体:绿色，Alexa Fluor 488 goat antirabb
40、it IgG 细胞核细胞核：蓝色，DAPI 70上转化纳米材料上转化纳米材料Illustration of conventional and upconversion luminescence.Principal UC process of Ln doped UCNP,a)excited state absorption(ESA),b)energy transfer upconversion(ETU),c)cooperative sensitization upconversion(CSU),d)cross relaxation(CR),and e)photon avalanche(PA)Sc
41、hematic illustration of energy migration mediated upconversion(EMU)mechanism.72量子点量子点Color of light depends on size of quantum dot73活体荧光成像活体荧光成像抗癌药物的临床前研究活体荧光对纳米材料用于肿瘤疗效的监测Nano lettersVolume 18,Article ID 8b0356875荧光素眼底血管造影成像荧光素眼底血管造影成像Journal of Diabetes ResearchVolume 2014,Article ID 745419AF为荧光素眼底血管造影结果，荧光素眼底血管造影显示与正常组(图A)比较，糖尿病小鼠组(图B)眼底布满散在的微小血管瘤(病理性新生血管瘤)，糖宁通络(图D，3.6g/kg剂量组;E，1.8g/kg剂量组;F，0.9g/kg剂量组)干预12周能显著减少微血管瘤的密度，二甲双胍组(C图)在这方面没有明细改善。
