1、细胞化学染色检验细胞化学染色检验 申家辉申家辉1 一、概述一、概述 二、细胞化学染色的基本方法二、细胞化学染色的基本方法 三、临床应用三、临床应用 2 1 1、概念：、概念：细胞化学染色是细胞学和化学相结合而成的一门科学，以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学物质（包括酶类、脂类、蛋白质、糖类、铁、核酸等）作定性、定位、半定量分析的方法。3一、概一、概 述述 2.2.细胞化学染色的目的细胞化学染色的目的 （1）辅助判断急性白血病的类型 （2）辅助血液系统等疾病的诊断与鉴别诊断 3.3.细胞化学染色的基本步骤：细胞化学染色的基本步骤：包括固定、显色反应、复染。（1）固定：
2、为了保持细胞结构及化学成分的稳定性而选用的方法。根据染色的目的，最常用的固定剂有甲醛、甲醇、乙醇等。5 （2 2）显色：）显色：通过不同的化学反应，最终形成稳定的有色沉淀，使被监测的化学物质显示出来。包括 偶氮偶联法：如NAP、ACP及各种脂酶染色 普鲁氏蓝反应：如铁染色 雪夫（shiff）反应：如PAS染色 联苯胺法：如POX染色 （3 3）复染：）复染：使各种目的细胞能显示出来更便于观察 6过氧化物酶染色过氧化物酶染色特异性酯酶染色特异性酯酶染色7二、细胞化学染色的基本方法二、细胞化学染色的基本方法 1、原理：原理：pox pox H H2 2O O2 2 O O 联苯胺联苯胺 联苯胺蓝联
3、苯胺蓝 +亚硝基铁氰化钠亚硝基铁氰化钠8蓝黑色颗粒蓝黑色颗粒（一（一)过氧化物酶过氧化物酶(POX)(POX)染色染色 2.2.试剂试剂 (1)联苯胺酒精溶液：取0.3g联苯胺加亚硝基铁氰化钠饱合液（36%）1ml,再加95%乙醇至100ml，存在于棕色瓶中，可存一年。(2)稀过氧化氢（新鲜配制）：取50ml蒸馏水加30%H2O21滴。（3）瑞吉氏复染液 9 3 3、染色方法、染色方法 1、新鲜干燥涂片加联苯胺酒精溶液10滴，覆盖整个髓膜，固定1-2min。2、再加等量的稀H2O2，混匀后染色45min,勿倒去染液直接流水冲洗。3、瑞氏染液复染。10 4 4、注意事项、注意事项 （1）H2O2
4、要新鲜配制，注意有效性（2）标本要新鲜，最长不超过一周，时间长了酶活性减弱。（3）POX染色后，一定要冲洗干净，否则染料堆积或浮于表面，影响瑞氏染色结果观察。11 5 5、结果判定：、结果判定：中性粒细胞杆状及分叶核呈强阳性是染色成功的标志(设对照片）。在细胞的胞浆中出现蓝绿色或蓝棕色颗粒为阳性反应。121.1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.2.晚幼红细胞，呈晚幼红细胞，呈阴性；阴性；3.3.单核细胞，呈弱阳性；单核细胞，呈弱阳性；4.4.浆细胞，呈阴性浆细胞，呈阴性 14急性粒细胞白血病（急性粒细胞白血病（M M2a2a)的的POXPOX染色染色原始粒细胞均呈阳性
5、急性淋巴细胞白血病的急性淋巴细胞白血病的POXPOX染色染色1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；其他原始淋巴细胞均呈阴性 急性早幼粒细胞白血病的急性早幼粒细胞白血病的POXPOX染色染色.原始红细胞，呈阴性；其他早幼粒细胞均呈强阳性 急性单核细胞白血病的急性单核细胞白血病的POXPOX染色染色1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.原始单核细胞，呈阳性；3.原始单核细胞，呈弱阳性；其他原幼单核细胞呈阴性 6、临床意义（1）正常分布 粒系:早期原粒阴性，晚期原粒及以下各阶段呈不同程度阳性。单核系:早期原单阴性，其它阶段皆呈弱阳性。淋巴、红系、浆细胞、巨核均呈阴性。19 （2）急性白血病的鉴别诊断 幼稚细胞P
6、OX阳性率3%：急非淋（AML)幼稚细胞POX阳性率3%：急淋（ALL)20 （二）中性粒细胞碱性磷酸酶染色（二）中性粒细胞碱性磷酸酶染色 （偶氮偶联法）（偶氮偶联法）1.1.原理原理磷酸奈酚钠 磷酸+萘酚 偶联萘酚+重氮盐 不溶性有色沉淀物定位于胞浆 (坚固蓝RR盐)21NAPNAPPH9.2PH9.29.89.822试剂试剂 （1）固定剂：10甲醛甲醇溶液 （2）Tris-Hcl缓冲液的配制：Tris粉三胺基甲烷4.85克溶于200ml蒸馏水中,加浓HCL1-2滴，PH调至9.2，4保存！（3）作用(基质液):磷酸萘酚钠 5mg N-N二甲基酰胺 1ml Tris-Hcl液 4ml 坚固蓝
7、RR盐 5mg （4）复染液：1%中性红 3.3.操作步骤操作步骤 1、新鲜、干燥的外周血或骨髓涂片外周血或骨髓涂片（标本片及对照片）加固定剂作用30秒（染缸），水洗待干；2、滴加作用液，室温染色15min，水洗待干；3、1%中性红复染1min23 4.4.注意事项注意事项 (1)重氮盐以坚固蓝RR盐为最佳；(2)坚固蓝RR盐应适量：过多易造成染色失败，过少使反应减弱；(3)每次都要做阳性对照；(4)作用液新鲜配制，配好后要立即使用24 5.5.结果观察结果观察:(对照片成熟中性粒细胞中出现棕黑色颗粒为阳性细胞，说明染色成功)正常人除成熟中性粒细胞NAP可见阳性外，其它血细胞均为阴性。且正常阳
8、性率40%，积分值30130分。256.NAP6.NAP阳性结果及积分判断标准阳性结果及积分判断标准“”0分，胞浆中无阳性颗粒“+”1分，胞浆中含有少量颗粒“2+”2分，胞浆中含有中等量颗粒“3+”3分，胞浆中含有丰富的颗粒，但胞核清楚“4+”4分，胞浆中含有丰富粗大的颗粒，但胞核不清楚中性粒细胞碱性磷酸酶染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色1.中性成熟粒细胞（+）；2.中性成熟粒细胞（+）；3.中性成熟粒细胞（+）；4.中性成熟粒细胞（+）；5.淋巴细胞（-）2829 NAP NAP分级分级 7.7.临床意义临床意义 增高：增高：细菌感染、类白、细菌感染、类白、AAAA、急淋、急淋、慢粒急变、骨髓增
9、殖性疾病，恶性淋巴瘤。慢粒急变、骨髓增殖性疾病，恶性淋巴瘤。降低：降低：慢粒、急粒、慢粒、急粒、PNHPNH、MDSMDS、恶组、恶组30 8.8.鉴别诊断鉴别诊断 慢粒与类白：慢粒与类白：前前；后；后。PNH PNH与与AAAA：前：前；后；后。急粒与急淋急粒与急淋：前：前；后；后。MDS MDS与慢性再障：前与慢性再障：前；后；后。病毒感染与细菌感染：前者无明显变化，后者病毒感染与细菌感染：前者无明显变化，后者。恶组与反应性组织细胞增多：前恶组与反应性组织细胞增多：前；后；后。31（三）酯酶染色（三）酯酶染色概述概述特异性酯酶染色特异性酯酶染色非特异性酯酶染色非特异性酯酶染色 概概 述述
10、根据各类细胞所含酯酶特异性高低分为特异性酯酶(SE)和非特异性酯酶(NSE)；特异性酯酶是指氯乙酸氯乙酸AS-DAS-D萘酚酯酶（萘酚酯酶（NAS-DCECE）；非特异性酯酶根据水解基质液的PH不同，又分为中性NSENSE（-醋酸萘酚酯酶醋酸萘酚酯酶 ），酸性NSENSE（酸性酸性-醋酸萘酚酯醋酸萘酚酯酶），碱性酶），碱性NSENSE（-丁酸萘酚酯酶）。丁酸萘酚酯酶）。目前常用的是目前常用的是氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色NAS-DCECE和-醋酸萘酚酯酶（醋酸萘酚酯酶（-NAE-NAE）+NaFNaF抑制试验抑制试验。1.原理（偶氮偶联法）氯乙酸ASD萘酚 ASD萘酚 +重氮盐(坚固蓝B盐)34
11、NAS-DNAS-DCECE不溶性有色沉淀物定位于胞浆内酶所在位特异性酯酶特异性酯酶(CE)(CE)染色染色 2.2.试剂：试剂：（1）固定液：10甲醛甲醇溶液 （2）作用液（基质液）氯乙酸ASD萘酚 5mg 丙酮 5-8ml 磷酸盐缓冲液 19ml 坚固蓝坚固蓝B B盐盐 10mg （3）复染液：1%中性红 35 3.3.染色方法染色方法（1）固定：10%甲醛甲醇液固定30秒，水洗晾干（2）滴加作用液37孵育30min，水洗（3）1%中性红复染1min，水洗晾干镜检。36 4.4.注意事项：注意事项：1.氯乙酸AS-D萘酚溶液应避光，4冰箱 保存，变黄或混浊即失效。2.染色温度37效果最好3
12、7 5.5.结果判断结果判断 中性分叶核粒细胞胞浆中见细小，弥漫分布的蓝色颗粒为染色成功的标志。6.6.临床意义临床意义 粒系除早期原粒外，其余阶段细胞均为阳性，其它各系均为阴性。CE染色对粒细胞白血病有特异性的诊断价值。3839CECE 非特异性酯酶染色（非特异性酯酶染色（-NAENAE）1.1.原理：原理：-醋酸萘酚醋酸萘酚 -萘酚萘酚 重氮盐重氮盐40-NAE-NAE形成不溶性有色沉淀定位于胞浆内酶所在位置7.47.6(坚固盐B)2.2.试剂试剂 （1 1）固定液：甲醛固定液：甲醛 （2 2）作用液）作用液:-醋酸萘酚醋酸萘酚 5mg 5mg 丙酮丙酮 5-8ml 5-8ml 磷酸盐缓冲
13、液磷酸盐缓冲液 10ml 10ml 固蓝固蓝B B盐盐 10mg 10mg （3 3）复染液：）复染液：10g/L10g/L甲基绿甲基绿水溶液水溶液4142371h15mg同样染色后 A A图：急性单核细胞白血病图：急性单核细胞白血病-NAE-NAE染色染色 原始、幼稚单核细胞多呈强阳性 B B图：急性单核细胞白血病图：急性单核细胞白血病 -NAE氟化钠抑制染色原始、幼稚单核细胞阳性反应被氟化钠抑制（与A图为同一标本）A A B B 4.4.结果判断：结果判断：胞浆内有棕色或棕黑色沉淀物为阳性 染色成功指标：染色成功指标：正常部分原始、幼稚及成熟单核细胞呈阳性；部分粒细胞为弱阳性反应；部分成熟
14、淋巴或个别中、晚幼红呈阳性。4445 5.5.临床意义：临床意义：鉴别急性白血病鉴别急性白血病 （1）急单时，原始至成熟单核大多为-NAE阳性，且易被NaF抑制，（2）急粒时，白血病细胞多呈阴性或弱阳性，M3呈阳性，但均不被NaF抑制。酯酶双染：酯酶双染：同一张血涂片上的细胞分别在两种不同的基质液中作用一定时间，复染镜检。主用于鉴别诊断AML-M4亚型。46骨髓涂片特异性酯酶（CE）和非特异性酯酶（NAE）的双酯酶染色显示，原始粒细胞胞浆呈蓝色CE阳性反应；而原始单核细胞胞浆呈棕色的NAE阳性反应。（四四）糖）糖 原原 染染 色色(PAS)(PAS)细胞内糖原中细胞内糖原中的的乙二醇基乙二醇基
15、48氧化氧化过碘酸过碘酸二醛基二醛基 1.1.原理原理（过碘酸（过碘酸-雪夫氏反应）雪夫氏反应）二醛基经过加成和缩合二醛基经过加成和缩合使使无色无色品红品红恢复品红的红色恢复品红的红色 2.2.试剂试剂 （1）10g/L的过碘酸氧化剂 雪夫氏试剂（schiff）：红色品红与偏重亚硫酸钠，变成了无色品红。20/L甲基绿复染液49 3.3.操作操作 （1）新鲜髓片放在95乙醇中固定10分钟；蒸馏水冲洗待干；（2）10g/L过碘酸氧化15分钟；蒸馏水冲洗；（3）置雪夫氏试剂浸泡45分钟，水洗后凉干；（4）甲基绿复染15分钟，水洗待干镜检。50 4.4.注意事项注意事项 （1）所用染色缸及器具应十分清
16、洁、干燥。（2）雪夫氏染液应避光密封保存，变红则失效。（3）放入雪夫氏溶液之前，用蒸馏水洗涂片，而且一定要完全干燥，若有水，试剂变色失效。51 （4）染色时间和温度应相对恒定，一般37效果最好。（5）染好的标本不能久放，8天后渐退色，因此应及时观察。52 5.5.结果观察结果观察 阳性：阳性：细胞浆内的红色阳性物呈弥散状、颗粒状或块状，胞核染绿色。阴性：胞浆无色或无红色颗粒。53 6.6.临床意义临床意义 正常血细胞的染色反应正常血细胞的染色反应 （1）粒系：原始细胞多为阴性，随着细胞成 熟，阳性逐渐增强。（2）淋系：正常人阳性率10-50%之间，多为 20%以下。（3）红系：PAS呈阴性反应
17、 （4）巨核：PAS呈阳性反应 （5）单核系:呈阴性或细颗粒状弱阳性。54正常血细胞正常血细胞PASPAS染色染色1.原始粒细胞（-）2.早幼粒细胞（+）3.中性中幼粒细胞（+）4.中性晚幼粒细胞（+）5.中性杆状核粒细胞（+）6.中性分叶核粒细胞（+）7.嗜碱性粒细胞（+）8.嗜酸性粒细胞（+）9.单核细胞（）10.淋巴细胞（+）疾病鉴别疾病鉴别 （1）红细胞系统疾病：M6、MDS呈阳性（均匀或块状红色）；巨幼贫、再障呈阴性。（2）白血病：急淋及慢淋：粗颗粒或块状阳性 急粒：阴性或弱阳性（弥散细颗粒）急单：阳性，多为细颗粒有时可见粗颗粒 急性巨核细胞白血病：阳性（块状）56PASAML-M6
18、幼红细胞呈阳性反应MA幼红细胞呈阴性反应急性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病PASPAS染色染色原始、幼稚淋巴细胞均阳性，呈粗颗粒状阳性 5960 1.1.原理原理(普鲁氏蓝反应普鲁氏蓝反应)4Fe 4Fe3+3+K +K4 4Fe(CN)Fe(CN)6 6 FeFe4 4Fe(CN)Fe(CN)6 6 3 3 +12K+12K+(亚铁氰化亚铁氰化钾钾)()(蓝蓝色亚铁氰化色亚铁氰化铁铁)61 稀盐酸稀盐酸细胞外铁：主要存在于骨髓小粒的巨噬细胞中细胞外铁：主要存在于骨髓小粒的巨噬细胞中细胞内铁：主要存在于有核红细胞中细胞内铁：主要存在于有核红细胞中 2.2.试剂试剂 （1）固定液：甲醇 （2）
19、酸性亚铁氰化钾溶液：200g/L亚铁氰化钾5份，浓盐酸1份。取200g/L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓慢加入浓盐酸，边滴边摇由开始的白色沉淀消失为至。（3）复染剂：0.5%沙黄 62 3.3.操作步骤操作步骤 （1）选片做标记，甲醇固定10min （2）37滴加酸性亚铁氰化钾溶液染色30min （3）蒸馏水冲洗2min后沙黄复染1min，待干镜检。63 4.4.注意事项注意事项 （1）所用的玻片及器具必须清洁，无铁污染。（2）应选有骨髓小粒的髓片做铁染色，以便观察细胞外铁。（3）作用液必须新鲜配制。（4）亚铁氰化钾暴露于空气中，易氧化变质，贮于棕色瓶中，避光密封保存。64 （5）复染前应充分冲
20、洗，否则铁粒状结晶过多，影响观察。（6）计数时要不停地旋转细螺旋器，因为铁粒在细胞内的高低度不一致，每看一个中、晚幼红细胞要旋转几次，直到看清为止。（7）观察内铁时，幼红及淋巴细胞要分清，幼红细胞核为鲜红色，淋巴细胞核为淡红色，（8）与污染铁的鉴别：污染铁不在髓小粒和细胞内，而是浮在上边，而且蓝中带黑。65 5.5.结果观察：结果观察：（1）正常幼红细胞核呈鲜红、浆淡黄、铁颗粒呈蓝绿色（2）低倍镜观察细胞外铁：涂片尾部和髓小粒附近 阴性：无蓝绿色铁粒。阳性：含有不同程度的铁粒、铁小珠、铁小块。根据阳性程度不同分四级。6667细胞外铁细胞外铁幼红细胞外的骨髓铁幼红细胞外的骨髓铁细胞外铁观察阳性为
21、蓝绿色沉淀细胞外铁观察阳性为蓝绿色沉淀（3）细胞内铁：油镜计数100个中晚幼红细胞；并记 录含有蓝色颗粒的铁粒幼红细胞百分率。型 胞浆内1-2个铁小粒 型 胞浆内3-5个铁小粒 型 胞浆内6-10个铁小粒或1-4粗大颗粒 型 含铁小粒10个以上或5个以上粗大颗粒 环形铁粒幼红细胞：含铁粒在6粒以上，其中2/3以上铁粒围绕核排列，超过1/2周。69骨髓细胞内铁染色骨髓细胞内铁染色1.环形铁粒幼红细胞；2.铁粒幼红细胞 71 5.5.正常参考值正常参考值 细胞外铁：+（2/3为+，1/3为+）细胞内铁：20%40%（正常人型多见，少数为型）72 7.7.临床意义：临床意义：(1)缺铁性贫血:外铁或
22、()，内铁 15%。此方法是诊断IDA及指导铁剂治疗的一种辅助方 法；经铁剂治疗后细胞内外铁迅速增多。(2)铁粒幼细胞性贫血：内铁阳性率高于40%，可达70%以上，铁粒数目增多，颗粒粗大，可见环铁；外铁多为+2，可达+3+4。（3）MDS-RAS：内铁阳性率，环铁15%。73 （4）感染性贫血：外铁，内铁（5）地中海贫血：内铁，外铁（6）巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、再障、白 血病：外铁、内铁正常或升高。74三、临床应用三、临床应用 对于贫血病例铁染色应作为常规染色对于贫血病例铁染色应作为常规染色 外铁外铁或或(-)(-)，内铁，内铁：在缺铁性贫血。在缺铁性贫血。内、外铁正常或增多：内、外铁正常
23、或增多：巨幼细胞性贫血、溶血性巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血。贫血、再生障碍性贫血。外铁增多，内铁减少：外铁增多，内铁减少：感染性贫血、肝病性贫血感染性贫血、肝病性贫血、肾病性贫血。、肾病性贫血。内、外铁均增多：内、外铁均增多：增生异常综合症（增生异常综合症（MDSMDS）、铁）、铁粒幼细胞性贫血。粒幼细胞性贫血。76 在巨幼细胞性贫血和红血病或红白血病在巨幼细胞性贫血和红血病或红白血病，作作PASPAS染色染色。阵发性睡眠性血红蛋白尿骨髓增生减低者阵发性睡眠性血红蛋白尿骨髓增生减低者与再生与再生 障碍性贫血，障碍性贫血，NAPNAP染色染色 77M6 PASM6 PAS染色阳性，
24、而巨幼贫幼红细胞阴性染色阳性，而巨幼贫幼红细胞阴性PNHPNH的的NAPNAP减低，而减低，而AAAA的的NAPNAP活性升高活性升高 首选化学染色为首选化学染色为POXPOX或苏丹黑或苏丹黑B B染色：染色：急淋病人急淋病人POXPOX阳性细胞阳性细胞3 3 急非淋急非淋POXPOX或或SBSB阳性细胞阳性细胞3 3 PASPAS反应进一步鉴别确认：反应进一步鉴别确认：原淋细胞阳性物多为粗大颗粒或团块原淋细胞阳性物多为粗大颗粒或团块状状 原粒细胞呈小颗粒或弥漫染色原粒细胞呈小颗粒或弥漫染色78u 急非淋病人：急非淋病人：M2M2、M3 POXM3 POX呈强阳性，呈强阳性，M1 M1、M4
25、M4、M5M5呈弱阳性。呈弱阳性。u 酯酶染色为急非淋的进一步分型提供了可靠酯酶染色为急非淋的进一步分型提供了可靠的客观指标：的客观指标：CECE为粒系标志酶，为粒系标志酶，ANAEANAE为单核系为单核系标志酶（标志酶（NaFNaF抑制实验）。抑制实验）。u慢性粒细胞性白血病和类白血病反应鉴别的有慢性粒细胞性白血病和类白血病反应鉴别的有效办法是效办法是NAPNAP：慢粒时减低，类白时显著增高：慢粒时减低，类白时显著增高。79 80 急性白血病急性白血病 PoxPAS+NAPCEANAE染色NAF 81PAS:PAS:阳性，颗阳性，颗 粒状粒状NAP:NAP:积分增高积分增高PAS:PAS:大
26、小不大小不 定块状阳性定块状阳性NAP:NAP:积分增高积分增高L1L1、L2L2、L3L3形态区分形态区分M7M7，可做免疫分型，可做免疫分型ANAE+NaFANAE+NaF抑制抑制M5M5：阳性强阳性，抑：阳性强阳性，抑制率制率5050M4:M4:阳性，抑制率阳性，抑制率5050 （形态、做酯酶双（形态、做酯酶双染）染）NAP:NAP:积分减低积分减低 涂片可见较多幼稚细胞涂片可见较多幼稚细胞POXPOX染色染色阴性（阳性率阴性（阳性率3%)3%)阳性，强阳性阳性，强阳性阴性或弱阳性阴性或弱阳性（部分阴性，部分阳性（部分阴性，部分阳性）PAS+NAPPAS+NAPM2M2、M3M3最强最强NAP:NAP:积分减低积分减低CECE基础理论：造血器官、造血干细胞、造血微环境、造血调控。基本方法：血细胞发育与成熟（规律）、正常血细胞形态学、骨髓细胞形态学检验、细胞化学染色。临床应用：血液病诊断中的应用、血液病治疗监测中的应用。83谢谢
