1、第六讲第六讲免疫荧光组化技术免疫荧光组化技术主要内容主要内容一、荧光的特征一、荧光的特征二、荧光素二、荧光素三、荧光素标记抗体的方法三、荧光素标记抗体的方法四、荧光抗体的质量鉴定四、荧光抗体的质量鉴定五、免疫荧光组化染色方法五、免疫荧光组化染色方法六、荧光显微镜六、荧光显微镜七、非特异性荧光的消除方法七、非特异性荧光的消除方法 八、激光扫描共聚焦显微镜八、激光扫描共聚焦显微镜思考题：思考题：1.1.什么叫荧光？什么叫荧光？2.2.常用荧光素有哪些特征？常用荧光素有哪些特征？3.3.标记荧光抗体有哪二种主要的制备标记荧光抗体有哪二种主要的制备方法？方法？4.4.免疫荧光组化直接法、间接法的免疫荧
2、光组化直接法、间接法的 原理和主要操作流程？原理和主要操作流程？5.5.观察荧光组化片时应注意哪些问题？观察荧光组化片时应注意哪些问题？6.6.非特异性荧光的消除方法有哪几种？非特异性荧光的消除方法有哪几种？一、荧光的特征一、荧光的特征 分子都含有电子，电子在不停地运分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运动着的电子可以动着。根据量子理论，运动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则，要以从一个能级向另一能守一定的规则，要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释
3、放。能量的吸收或释放。激发激发 当电子吸收能量跃迁到较高能级，当电子吸收能量跃迁到较高能级，这个过程叫激发。这个过程叫激发。发射发射 以辐身方式跃迁时，能量转化成相以辐身方式跃迁时，能量转化成相 应波长的光，这个过程叫发射。应波长的光，这个过程叫发射。荧光荧光 跃迁到激发态的电子，大多处于单跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐身方式跃迁到基态，由于单重激发态很辐身方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。很短，这种发射光，叫荧光。二、荧光素
4、二、荧光素 能够产生荧光并能作为染料的化合物能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。光能并发射荧光。1 1、具备用于标记抗体的荧光素条件、具备用于标记抗体的荧光素条件(1)(1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未结合的色学基团，结合后不易离解，而未结合的色素及其降解产物易排除。素及其降解产物易排除。(2)(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光荧光效率高，与蛋白质结合后荧光 素质量下降不多。素质量下降不多。(3)(3)标记后对抗体的免疫学性质和生化标记后对抗体的
5、免疫学性质和生化 性质无影响。性质无影响。(4)(4)结合方法简便而快速，并且较稳定。结合方法简便而快速，并且较稳定。(5)5)荧光素容易溶解，溶解后不会和其荧光素容易溶解，溶解后不会和其 他物质发生化学反应。他物质发生化学反应。(6)(6)荧光颜色与背景组织的自发荧光颜荧光颜色与背景组织的自发荧光颜 色对比鲜明，能清晰判断结果。色对比鲜明，能清晰判断结果。2.荧光素的种类荧光素的种类(1)(1)异硫氰酸荧光黄（异硫氰酸荧光黄（FITCFITC）：）：分子量分子量390390D D，最大吸收光谱为最大吸收光谱为490490495495nmnm，最最大发射光谱为大发射光谱为52052053053
6、0nmnm。呈现明亮的呈现明亮的黄绿色荧光，分子量黄绿色荧光，分子量389.4389.4。(2)(2)四甲基异硫氰酸罗达明（四甲基异硫氰酸罗达明（TRITCTRITC）是是罗达明的衍生物，易溶于水，最大吸收罗达明的衍生物，易溶于水，最大吸收光谱为光谱为550550nmnm，最大发射光谱为最大发射光谱为620620nmnm，呈橙红色荧光。呈橙红色荧光。(3)(3)四乙基罗达明四乙基罗达明(RB200)RB200)呈褐红色粉呈褐红色粉末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光谱长期保存。最大吸收光谱570570nmnm，最大最大发射光谱发射光谱5965
7、96600600nmnm，呈明亮橙红色荧呈明亮橙红色荧光，分子量光，分子量580580，RB200RB200不能直接和蛋白不能直接和蛋白质结合，要先经五氯化磷反应，转化成质结合，要先经五氯化磷反应，转化成硫酰氯，再与蛋白质的氨基结合。硫酰氯，再与蛋白质的氨基结合。(4)1-4)1-二甲基氨基二甲基氨基-5-5-硫酰氯硫酰氯(5)4-(5)4-乙酰胺乙酰胺-4-4-异硫氰酸异硫氰酸-2-2-硫酸芪（硫酸芪（SITSSITS）(6)(6)得克萨斯红（得克萨斯红（Texas redTexas red）(7)(7)藻红蛋白（藻红蛋白（PEPE）(8)(8)花青（花青（Cyanine,Cy2,Cy3,C
8、y5Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）三、荧光素标记抗体的方法三、荧光素标记抗体的方法(一一)FITC标记抗体的方法标记抗体的方法 1.1.MarsshallMarsshall法法(1)(1)原理：当原理：当FITCFITC在碱性溶液中与抗体反应在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸时，主要是抗体分子上的赖氨酸-氨基与氨基与FITCFITC上硫碳胺键结合，一个上硫碳胺键结合，一个IgGIgG分子中有分子中有8686个赖氨酸残基，一般最多能结合个赖氨酸残基，一般最多能结合15152020个。个。荧光素荧光素FITC-NC N-蛋白质蛋白质 S H H FITC-N C N-蛋白
9、质蛋白质 H S H(2)(2)操作流程操作流程 抗体与荧光素比例为抗体与荧光素比例为50-100:150-100:1抗体的准备：抗体的准备：2020mg/mlmg/ml，碳酸盐缓冲液为总碳酸盐缓冲液为总 量的量的1/101/10。荧光素的准备：用分析天平准确称取荧光素的准备：用分析天平准确称取 0.01 0.01mgFITCmgFITC/1mg/1mg抗体。抗体。结合：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体结合：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体 溶液中。溶液中。透析透析 过柱过柱 SephadeSephadeG50G50或或 G25G25 保存保存 4-40 4-40等量甘油分装保存。等量甘油分装保存
10、。2.2.ChadwickChadwick法法3.3.改良法改良法4.4.透析标记法透析标记法（二）四乙基罗达明标记抗体方法（二）四乙基罗达明标记抗体方法（三）藻红蛋白标记抗体方法（三）藻红蛋白标记抗体方法四、荧光抗体的质量控制四、荧光抗体的质量控制主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。1.1.特异性染色效价测定特异性染色效价测定2.2.非特异性染色测定非特异性染色测定3.3.吸收试验吸收试验4.4.F/PF/P比值的测定方法比值的测定方法五、免疫荧光组织化学染色方法五、免疫荧光组织化学染色方法 1.1.直接法直接法 简便、快速，用已知特异性标简便、快速，
11、用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。操作流程：操作流程：(1)(1)冰冻切片经固定，凉干冰冻切片经固定，凉干PBSPBS洗；石蜡切片脱蜡至水，消化洗；石蜡切片脱蜡至水，消化3030minmin，PBSPBS洗。洗。(2)(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内湿盒内3737温育温育1 1h h，PBSPBS洗洗3 33 3minmin。(3)0.01%(3)0.01%伊文氏蓝衬染伊文氏蓝衬染1 13 3minmin，PBSPBS洗洗3 33 3minmin，蒸馏水洗蒸馏水洗2 2次，除去次，除去NaclNac
12、l结晶。结晶。(4)(4)pH9.0pH9.0缓冲甘油封片。缓冲甘油封片。(5)(5)镜检镜检2.2.间接法间接法 是直接的重要改进，先用标记是直接的重要改进，先用标记的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结合，的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结合，随后用间接荧光标记二抗与一抗特异性结随后用间接荧光标记二抗与一抗特异性结合。合。操作流程操作流程 (1)(1)冰冻切片经固定，凉干后冰冻切片经固定，凉干后PBSPBS洗；石洗；石蜡切片脱蜡至水，蜡切片脱蜡至水，PBSPBS洗，酶消化，洗，酶消化，PBSPBS洗洗3 33 3minmin。(2)(2)适当稀释特异性一抗，适当稀释特异性一抗，3737孵育孵育
13、1 1h h，或室温或室温4 4h h，或或44过夜，过夜，PBSPBS洗洗3 33 3minmin。(3)3)荧光标记二抗适当稀释荧光标记二抗适当稀释37 3037 30minmin，PBSPBS洗洗3 33 3minmin。(4)0.01%(4)0.01%伊文氏蓝衬染伊文氏蓝衬染1 13 3minmin，PBSPBS洗洗3 33 3minmin。(5)(5)封片，镜检。封片，镜检。六、荧光显微镜检查方法六、荧光显微镜检查方法 1.1.荧光显微镜荧光显微镜 荧光显微镜是免疫荧荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具。它是由超高压光光组织化学的基本工具。它是由超高压光源，滤片系统源，滤片系统(包
14、括激发和压制滤板包括激发和压制滤板)，光，光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。用一定波长的光激发标本发射荧光。(1)(1)光源光源 光源的亮度应根据荧光素的类型光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激励一般荧光染选择。小功率汞灯可满足激励一般荧光染料的要求。对于免疫荧光染色需用大功率料的要求。对于免疫荧光染色需用大功率超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，引起球内水银蒸发，经过引起球内水银蒸发，经过5 51515minmin，球内球内气压升至气压升至50507070标准大气压
15、，此时达到最标准大气压，此时达到最高亮度，成为稳定工作状态。高亮度，成为稳定工作状态。(2)2)滤片系统滤片系统 是荧光显微镜的重要组成部是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像和发挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片和发挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件。前提和必要条件。滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜和其他一些中性滤片。滤片，分光镜和其他一些中性滤片。荧光显微镜的滤片系统荧光显微镜的滤片系统激励法激励法分
16、光镜分光镜激发滤光片激发滤光片截止滤光片截止滤光片用途用途UDM400BP330-385BP360-370BA420自动荧光观察法，自动荧光观察法，DAPI(联脒基吲哚联脒基吲哚)：DNA Hoechest 33358,33342染色体染色体VDM455BP400-410BA455儿茶酚胺观察儿茶酚胺观察BVDM455BP400-440BA475芥子喹吖因；染色体芥子喹吖因；染色体BP420-440硫磺素硫磺素S：淋巴细胞淋巴细胞吖淀黄吖淀黄素：核酸素：核酸BDM500BP450-480BA515异硫异硫氰酸荧光素：荧光抗体观察氰酸荧光素：荧光抗体观察BP470-490吖啶吖啶橙：橙：DNA，
17、RNABP420-480金胺金胺结核杆菌结核杆菌IBDM505PB460-490BA515IFBP470-490GDM570BP510-550BA590罗丹明罗丹明BP530-550四四甲基罗丹明异硫氰酸盐：荧光抗体观察甲基罗丹明异硫氰酸盐：荧光抗体观察BP480-550碘化丙碘化丙啶：啶：DNAIGDM565BP520-550BA580IFDM600BP545-580BA610IF德克萨斯德克萨斯红：荧光抗体观察红：荧光抗体观察2.2.标本制作要求标本制作要求(1)(1)载玻片厚度应在载玻片厚度应在0.60.61.21.2mmmm之间之间(2)(2)盖玻片应光洁，厚度在盖玻片应光洁，厚度在0
18、.170.17mmmm左右左右(3)(3)标本不能太厚，如太厚激发光大部分消标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激分。不能充分激分。(4)(4)封片剂封片剂 常用甘油，必须无自发荧光，常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在无色透明，荧光的亮度在pH8.5pH8.59.59.5时较时较亮，不易很快褪去。甘油和亮，不易很快褪去。甘油和0.50.5mol/L mol/L pH9.0pH9.09.59.5的碳酸盐缓冲液等量混合作封的碳酸盐缓冲液等量混合作封片剂。片剂。荧光信号增强封片剂荧光信号增强封片剂 mowio
19、l mowiol 40-88 4.8g40-88 4.8g 甘油甘油 12 12mlml 蒸馏水蒸馏水 12 12mlml 0.2mol/L 0.2mol/L TrisTris(pH8.5)24ml(pH8.5)24ml 上述混合（加热溶解），上述混合（加热溶解），50005000g g离心，离心，1515minmin，最后加入最后加入1.4-1.4-diazobicydodiazobicydo-2,2,2-octane(2,2,2-octane(DABcosDABcos)，终浓度终浓度2.5%(2.5%(约约1.251.25g)g)，溶解后，分装存于溶解后，分装存于-2020中。中。(5)(
20、5)镜油镜油3.3.使用荧光显微镜注意事项使用荧光显微镜注意事项(1)(1)严格按说明书操作，不要随意改变程序。严格按说明书操作，不要随意改变程序。(2)(2)应在暗室中进行检查。应在暗室中进行检查。(3)(3)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。时应戴上防护眼镜。(4)(4)检查时间每次以检查时间每次以1 12 2h h为宜，超过为宜，超过9090minmin，超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱。超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱。(5)5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。光源关中检查
21、，以节省时间，保护光源。光源关闭后必须在闭后必须在3030minmin后才能再启动光源，一后才能再启动光源，一天中应避免数次点燃光源。天中应避免数次点燃光源。(6)(6)标本染色后应立即观察。标本染色后应立即观察。(7)(7)荧光高度的判断标准，分四级荧光高度的判断标准，分四级“”为阴性，为阴性，“”为仅能见明确可见的荧光；为仅能见明确可见的荧光；“”为可见有明亮的荧光；为可见有明亮的荧光；“”为可见耀眼的荧光。为可见耀眼的荧光。七、非特异性染色的消除方法七、非特异性染色的消除方法根据产生的原因采取适当的方法，常用方法：根据产生的原因采取适当的方法，常用方法：1.1.动物脏器粉末吸收法动物脏器
22、粉末吸收法 2.2.透析法透析法 3.3.Sephadex Sephadex G-50G-50柱层析法柱层析法 4.4.DEAEDEAE纤维素柱层析法纤维素柱层析法 5.5.荧光抗体稀释法荧光抗体稀释法 6.6.纯化抗原方法纯化抗原方法 7.7.纯化抗体方法纯化抗体方法 8.8.伊文氏蓝衬染方法：伊文氏蓝衬染方法：0.01%0.01%伊文氏蓝伊文氏蓝八、激光扫描共聚焦显微镜八、激光扫描共聚焦显微镜 激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜(laser laser scanning scanning confocal confocal microscope,LSCM)microscope,LSC
23、M)是是8080年代发展起来的一项具有划时代意年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品。义的高科技新产品。实现了对细胞内部非侵入式光学断层实现了对细胞内部非侵入式光学断层扫描成像，从而对被检物体样品从停留到扫描成像，从而对被检物体样品从停留到表面单层，静态平面的观察进行到立体，表面单层，静态平面的观察进行到立体，断层扫描、动态全面的观察，在生命科学断层扫描、动态全面的观察，在生命科学研究中得到迅速应用。研究中得到迅速应用。1.1.仪器构成仪器构成 (1)(1)计算机系统：控制着机械，光学、声计算机系统：控制着机械，光学、声学系统及各种外围设备。学系统及各种外围设备。(2)(2)激光照射系
24、统：氩离子激光器和声光激光照射系统：氩离子激光器和声光调节器。调节器。(3)显微镜系统，它主要由倒置显微镜和共显微镜系统，它主要由倒置显微镜和共聚焦系统组成。聚焦系统组成。(4)检测系统，由检测器，检测放大器等元检测系统，由检测器，检测放大器等元件组成。件组成。(5)XY平台平台 (6)Z-轴步进马达轴步进马达2.共聚焦成像原理共聚焦成像原理 激光器发出的激光束经过光的扩激光器发出的激光束经过光的扩束和整形，变成一束直径较大的平行束和整形，变成一束直径较大的平行光束，长通分色光镜使光束偏转光束，长通分色光镜使光束偏转90度，度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中
25、的荧光物质在激光的激发下发出沿中的荧光物质在激光的激发下发出沿各个方向的荧光，各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜，长通分色反射一部分荧光经过物镜，长通分色反射镜，聚焦透镜，会聚在聚焦透镜的焦镜，聚焦透镜，会聚在聚焦透镜的焦点外，经过焦点处的针孔，由检测器点外，经过焦点处的针孔，由检测器接收并转变成电信号。接收并转变成电信号。3.3.光信号接收和成像方式光信号接收和成像方式(1)(1)光信号接收光信号接收 生物样品发出的荧光通常生物样品发出的荧光通常有二种接收方式：由光电倍增管（有二种接收方式：由光电倍增管（PMTPMT）把光信号转变成电信号；利用电荷耦合把光信号转变成电信号；利用电荷耦合器（器
26、（CCDCCD）把光信号转变成电信号。把光信号转变成电信号。(2)2)成像方式成像方式 载物台运动成像：以直径载物台运动成像：以直径很小的激光束照射样品，照射点发出的荧很小的激光束照射样品，照射点发出的荧光信号经光信号经PMTPMT变成电信号，然后载物台移动变成电信号，然后载物台移动到下一点，记录该点的荧光强度。该方法到下一点，记录该点的荧光强度。该方法无轴向像差，成像时间长；无轴向像差，成像时间长；反射扫描成像方式，通过转动反射镜使反射扫描成像方式，通过转动反射镜使激光连续照射样品，由激光连续照射样品，由CCDCCD摄像机记录下摄像机记录下照射点所发射的荧光，成像速度快。照射点所发射的荧光，
27、成像速度快。4.4.参数的选择参数的选择 基本参数：基本参数：ConfocalConfocal,pinhole,detector,pinhole,detector,PMT,PMT,StepsizeStepsize,X points,Y Points,X points,Y Points,scanstrscanstr,speed,speed,LaserPwrLaserPwr,Auto zoom,Auto zoom,Display,BR Display,BR subvalsubval,Samples/pt,Samples/pt等等5.5.性能特点：性能特点：分辨率高，灵敏度高，扫描分辨率高，灵敏度高
28、，扫描速度快，扫描范围大，图像存取方便，可速度快，扫描范围大，图像存取方便，可进行光切片的观察，可进行定量荧光分析。进行光切片的观察，可进行定量荧光分析。6.6.应用应用(1)(1)组织光学切片组织光学切片 可对活的或固定的细可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列胞及组织进行无损伤的系列“光学切光学切片片”，得到其各层面的信息，得到其各层面的信息-“-“显微显微CT”CT”。(2)(2)三维图像重建三维图像重建(3)(3)细胞物理和生物化学测定细胞物理和生物化学测定(4)(4)荧光的定量、定位分析荧光的定量、定位分析(5)(5)CaCa2+2+、pHpH及其他细胞内离子的实时定及其他细胞内
29、离子的实时定 量测定量测定(6)(6)粘附细胞的分选粘附细胞的分选(7)(7)激光细胞显微外科及光陷阱技术激光细胞显微外科及光陷阱技术(8)(8)荧光光漂白恢复（荧光光漂白恢复（FRAPFRAP）技术技术(9)(9)胞间通讯的研究胞间通讯的研究(10)(10)细胞膜流动性测定细胞膜流动性测定(11)(11)光活化技术光活化技术实习实习1 1 免疫荧光组化免疫荧光组化-间接法间接法1.4 1.4 m m石蜡切，石蜡切，5858烤，烤，1818h h。2.2.常规脱蜡至水（二甲苯常规脱蜡至水（二甲苯、各各1010minmin，无水乙醇，无水乙醇，9595乙醇，乙醇，8585乙醇，乙醇，7575乙醇
30、各乙醇各2 2minmin）。）。3.PBS3.PBS洗（磷酸盐缓冲液洗（磷酸盐缓冲液0.010.01mol/L pH7.4mol/L pH7.4）3 33min3min。4.0.1%4.0.1%胰蛋白酶（胰蛋白酶（100100mlml蒸馏水中加入蒸馏水中加入100100mgmg胰蛋白酶，胰蛋白酶，100100mgmg氯化钙，用氯化钙，用0.10.1N N NaoHNaoH调调pHpH至至7.67.6），），3737，消化，消化3030minmin。5.0.01mol/L pH7.4 PBS5.0.01mol/L pH7.4 PBS洗洗3 33 3minmin。6.6.兔抗人兔抗人AFP1:50AFP1:50（用专用抗体稀释液稀释）用专用抗体稀释液稀释）3737，1 1h h或室温或室温4 4h h，或或44过夜。过夜。7.7.PBSPBS洗洗3 33 3minmin。8.8.羊抗兔羊抗兔IgGIgG-F-F，1:201:20稀释，稀释，3737，1 1h h，室室温温2 2h h。9.PBS9.PBS洗洗3 33 3minmin。10.10.蒸馏水洗蒸馏水洗3 3minmin。11.pH9.011.pH9.0缓冲甘油封片。缓冲甘油封片。12.12.镜检，阳性呈明亮绿色荧光。镜检，阳性呈明亮绿色荧光。
