1、医学免疫学与免疫学技术实验医学免疫学与免疫学技术实验贵阳医学院免疫学教研室贵阳医学院免疫学教研室人血清人血清IgG的提取及鉴定的提取及鉴定2014-04-22人血清人血清IgG的提取及鉴定的提取及鉴定离子交换层析法提取人离子交换层析法提取人IgG血清血清IgG鉴定鉴定人血清人血清IgG的提取及鉴定的提取及鉴定离子交换层析法提取人离子交换层析法提取人IgG流程：流程：u DEAE-纤维素预处理、采集样品（血清）纤维素预处理、采集样品（血清）u 装柱、平衡装柱、平衡u 上样和洗脱上样和洗脱u DEAE-纤维素再生纤维素再生人血清人血清IgG鉴定鉴定：u 洗脱液抗原性鉴定洗脱液抗原性鉴定琼脂双扩散琼
2、脂双扩散u 纯度鉴定纯度鉴定免疫电泳免疫电泳u 回收率的测定回收率的测定分光光度法分光光度法u IgG回收量的测定回收量的测定-直接直接ELISA离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理 离子交换层析（离子交换层析（Ion Exchange Chromatography,IEC）是以离子交换剂为固定）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的离子化合物与离子交换剂的结合力不同结合力不同进行分离进行分离纯化的层析方式。纯化的层析方式。离子交换层析的基本过程离子交换层析的基本过程 带电荷量少，亲和力小的先被洗
3、脱下来，带电荷量多，带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。亲和力大的后被洗脱下来。离子交换剂离子交换剂 在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂离子交换剂。纤维素纤维素OCH2COO-Na 基质基质 电荷基团电荷基团 反离子反离子阴离子交换剂阴离子交换剂二乙氨乙基纤维素，弱碱性二乙氨乙基纤维素，弱碱性DEAE-纤维素（纤维素（阴离子交换纤维素阴离子交换纤维素）在）在 pH8.6以下分离中性或酸性物质。以下分离中性或酸性物质。人人IgG的主要理化性质及的主要理化性质及DEAE-纤维素提取原理纤维素提取原理人人IgG特性特
4、性:血清含量：血清含量：9.5-12.5 mg/ml；血清中的；血清中的IgG属属于中性蛋白（于中性蛋白（pI:6.85-7.5），其余均属酸性蛋白），其余均属酸性蛋白（pI:4-5）。）。DEAE-纤维素提取纤维素提取IgG原理：原理：在在pH7.27.4的环境中，酸性蛋白被的环境中，酸性蛋白被DEAE-纤维素吸附，纤维素吸附，IgG不被吸附而最早从柱中流出，不被吸附而最早从柱中流出，而得以纯化。而得以纯化。实验步骤1、DEAE-纤维素预处理：纤维素预处理：强碱处理强碱处理 0.5N NaOH 抽滤、洗涤、抽滤（抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0）强酸处理强酸处理 0.5N HCl 抽滤、洗涤、抽
5、滤（抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0）强碱处理强碱处理 0.5N NaOH 抽滤、洗涤、抽滤（抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0）PH7.4 0.01M PB液浸泡液浸泡抽滤、浸泡抽滤、浸泡2、装柱、平衡固定层析柱、装柱、平衡固定层析柱 装装 柱：柱高度、无分层、无气泡柱：柱高度、无分层、无气泡3、样本（人血清）准备、样本（人血清）准备 抽静脉血抽静脉血分离血清分离血清透析（透析（PH7.4 0.01M PB液液 4度过夜）度过夜）4、研磨蔗糖备用（纯化、研磨蔗糖备用（纯化IgG浓缩用）浓缩用）实验步骤5、上样、洗脱、收集洗脱液、上样、洗脱、收集洗脱液 上样上样 流速流速3ml/10min（记录上样总体
6、积，保留部分血清）（记录上样总体积，保留部分血清）洗脱洗脱 流速流速30-40ml/cm2/h 收集收集 5ml/管管（20%三氯醋酸滴定、分光光度法检测）三氯醋酸滴定、分光光度法检测）6、DEAE-纤维素再生纤维素再生 2M NaCl 洗脱其他血清蛋白洗脱其他血清蛋白 拆柱、拆柱、浸泡浸泡 PH7.4 0.01M PB液液洗脱液抗原性鉴定洗脱液抗原性鉴定双向琼脂扩散实验原理：双向琼脂扩散实验原理：可溶性可溶性Ag和和Ab分别在琼脂凝胶内扩散。分别在琼脂凝胶内扩散。相应的相应的Ag和和Ab相遇后，在比例合适时可形成相遇后，在比例合适时可形成白色沉淀线。白色沉淀线。7、洗脱液抗原性鉴定（双扩散法
7、）、洗脱液抗原性鉴定（双扩散法）实验步骤实验步骤抗体抗体抗原抗原IgG回收率的测定回收率的测定分光光度法分光光度法 蛋白质分子中含有共轭双键的蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸酪氨酸、色氨色氨酸酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收波长处，且在此波长内吸收峰的峰的光密度值光密度值与其与其 浓度浓度成正比关系成正比关系，故可作为蛋，故可作为蛋白质定量测定的依据。白质定量测定的依据。实验步骤实验步骤9、合并含、合并含IgG的洗脱液，通过蔗糖包埋法进行浓缩。的洗脱液，通过蔗糖包埋法进行浓缩。10、
8、通过分光光度法对浓缩后的、通过分光光度法对浓缩后的IgG进行回收率的测定。进行回收率的测定。回收率回收率=提取提取 IgG（mg）12（mg/ml）上样血清体积）上样血清体积 OD280 1.43 回收体积回收体积12（mg/ml）上样血清体积）上样血清体积回收回收IgG纯度鉴定纯度鉴定免疫电泳原理：免疫电泳原理：（immune electrophoresis）先将先将抗原抗原加到琼脂板的小孔内进行电泳，加到琼脂板的小孔内进行电泳，将将样品中不同分子量和不同电荷的组分分离成若干样品中不同分子量和不同电荷的组分分离成若干区带；然后分离的各抗原成分与电泳方向平行槽区带；然后分离的各抗原成分与电泳方
9、向平行槽中含中含相应抗体相应抗体的免疫血清在琼脂中作双向免疫扩的免疫血清在琼脂中作双向免疫扩散。各区带蛋白在相应位置与抗体形成弧形沉淀散。各区带蛋白在相应位置与抗体形成弧形沉淀线。线。根据沉淀弧的位置、数量和形态，可分析样品中所含抗原成分及其性质。实验步骤实验步骤人血清提纯物兔抗人血清双扩散双扩散电泳电泳+-19酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）测定）测定IgGIgG20酶联免疫吸附试验原理酶联免疫吸附试验原理 利用标记技术将利用标记技术将酶酶标记到标记到抗体（抗原）抗体（抗原）上上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原
10、）发生特异性反应。在遇到相应的酶体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶分解底物，生成有颜色的产物。根底物时，酶分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深浅据颜色的深浅,可以判断待检物中有无特异的抗可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的多少。检测方法有直接法原（抗体）以及量的多少。检测方法有直接法、间接法、双抗体法和抗原竞争法。、间接法、双抗体法和抗原竞争法。21 直接直接ELISA 间接间接ELISA 双抗体夹心法双抗体夹心法包被包被(未知抗原）未知抗原）加入酶标抗体加入酶标抗体洗板洗板 加底物加底物加终止液加终止液包被包被(已知抗原）已知抗原）加入待检标本加入待检标本（未知
11、抗体）（未知抗体）加入酶标第二抗体加入酶标第二抗体抗抗体抗抗体洗板洗板加底物加底物加终止液加终止液包被包被(已知抗体）已知抗体）加入待检标本加入待检标本（未知抗原）（未知抗原）加入酶标抗体加入酶标抗体洗板洗板加底物加底物加终止液加终止液原理示意图原理示意图23人血清人血清IgG抗体的检测抗体的检测 直接直接ELISA法法测定原理：测定原理：将待检标本包被反应板，再加入酶标羊抗人将待检标本包被反应板，再加入酶标羊抗人IgG抗体。当标本中存在抗体。当标本中存在IgG时，该抗体与包被时，该抗体与包被IgG结合，最后形成结合，最后形成IgG-酶标羊抗人酶标羊抗人IgG抗体复合物，抗体复合物，加入底物产
12、生显色反应。加入底物产生显色反应。24包被：包被：用包被缓冲液将纯化抗体稀释至用包被缓冲液将纯化抗体稀释至0、2、4、6、8、10mg/L。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml稀释液，稀释液，4过夜。过夜。加酶标抗体：加酶标抗体：每孔加入稀释至工作浓度的酶每孔加入稀释至工作浓度的酶标抗体标抗体100l，37孵育孵育1h。洗涤：洗涤：用洗涤液洗涤用洗涤液洗涤3次，每次次，每次3min，甩净，拍干。，甩净，拍干。洗涤：洗涤：手工洗板，弃液拍干，重复手工洗板，弃液拍干，重复5次次加底物显色：加底物显色：每孔加底物液每孔加底物液50l，置，置37孵育孵育15min。终止反应：终止反应：每孔加入每孔加入50l的的2M H2SO4，混匀，混匀【步【步骤】骤】封闭：封闭：每孔加入封闭液每孔加入封闭液0.1ml，4孵育孵育1h。
