1、骨髓细胞微核实验v 微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。物的快速检测方法。v 微核微核(Micronucleus,MCN)是指细胞中主核之外的颗粒，染是指细胞中主核之外的颗粒，染色与细胞核一致，相当于细胞直径的色与细胞核一致，相当于细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或，呈圆形或杏仁状。是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有杏仁状。是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂时滞留在细胞核外的遗传物质。丝分裂时滞留在细胞核外的遗传物质。实验原理实验原理机理：机理：1 1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着
2、丝点的染色体有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中2 2 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动，断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动，从而遗留在细胞质中从而遗留在细胞质中结论：结论：微核试验能检测化学或其他物质因素诱导产生的染色体微核试验能检测化学或其他物质因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点实验原理实验原理无核细胞无核细胞红细胞红细胞有核细胞中有核细胞中微核难与正常核分叶微核难与正常核分叶及核突出物区别及核突出物区别微微
3、核核实实验验红细胞的分化成熟过程红细胞的分化成熟过程小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成在体外无抗肿瘤活性，进入体内经转化、分解，生成酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。MCN多数为圆形，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色如PCE/NCE0.冲洗：蒸馏水冲洗，晾干固定：甲醇固定10min,需要晾干；具有显著的遗传、生殖毒性：停经或精子缺乏，妊娠初期时给予可致畸胎。正常PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中正常PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.副作用明显，有恶心、食欲减退、脱发、
4、白细胞减少、中毒性膀胱炎、肝功能损伤等。如PCE/NCE0.本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示.NCE的核糖体已消失，被染成淡桔红色。正常PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.NCE的核糖体已消失，被染成淡桔红色。是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂时滞留在细胞核外的遗传物质。本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示.示小鼠骨髓嗜多染红细胞中多个微核染毒方法（30h两次给药法）：两次给受试物间隔24h，第二次给药后6h取材2 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动，从而遗留在细胞质中8环磷酰胺（环磷酰胺（CTXCTX）v 最常用的烷化剂类抗肿瘤药。最常用
5、的烷化剂类抗肿瘤药。v 在体外无抗肿瘤活性，进入体内经转化、分解，生成酰在体外无抗肿瘤活性，进入体内经转化、分解，生成酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。v 副作用明显，有恶心、食欲减退、脱发、白细胞减少、副作用明显，有恶心、食欲减退、脱发、白细胞减少、中毒性膀胱炎、肝功能损伤等。中毒性膀胱炎、肝功能损伤等。v 具有显著的遗传、生殖毒性：停经或精子缺乏，妊娠初具有显著的遗传、生殖毒性：停经或精子缺乏，妊娠初期时给予可致畸胎。期时给予可致畸胎。v 用药后用药后24-3024-30小时，骨髓中微核形成达峰。小时，骨髓中微核形成达峰。9结果结果示小鼠骨髓嗜多染示小鼠骨髓嗜多
6、染红细胞中一个微核红细胞中一个微核示小鼠骨髓正常示小鼠骨髓正常嗜多染红细胞嗜多染红细胞10示小鼠骨髓嗜多染红细胞中两个微核示小鼠骨髓嗜多染红细胞中两个微核11示小鼠骨髓嗜多染红细胞中多个微核示小鼠骨髓嗜多染红细胞中多个微核GiemsaGiemsa染色染色v PCEPCE胞质内含胞质内含有核糖体，染有核糖体，染色呈灰蓝色；色呈灰蓝色；MCNMCN多数为圆多数为圆形，嗜色性与形，嗜色性与核质一致，呈核质一致，呈紫红色或蓝紫紫红色或蓝紫色色v NCENCE的核糖体的核糖体已消失，被染已消失，被染成淡桔红色。成淡桔红色。NCE PCE&MCN实验目的实验目的v 用化疗药（环磷酰胺）制备突变模型用化疗药
7、（环磷酰胺）制备突变模型v 观察小鼠骨髓嗜多染红细胞（观察小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微）微核核v【Animal】小鼠是微核试验的常规动物，通常用小鼠是微核试验的常规动物，通常用7 71212周龄，周龄，体重体重181820g20g的小鼠。的小鼠。v【Reagents】小牛血清小牛血清 Giemsa染液染液 环磷酰胺环磷酰胺实验动物及试剂实验动物及试剂实验分组和染毒方法实验分组和染毒方法环磷酰胺环磷酰胺40mg/kg 模型组模型组等体积溶剂等体积溶剂对照组对照组染毒方法（染毒方法（30h两次给药法）：两次给受两次给药法）：两次给受试物间隔试物间隔24h，第二次给药后，第二次给药后6h取材取材
8、处死：小鼠颈椎脱臼处死；处死：小鼠颈椎脱臼处死；取股骨：防止出血；取股骨：防止出血；取骨髓：小牛血清取骨髓：小牛血清1滴滴推片：推片：30度角；度角；晾干：一定要干；晾干：一定要干；固定：甲醇固定固定：甲醇固定10min,需要晾干；需要晾干；染色：染色：Gimesa染液染色（染液染色（1015min）冲洗：蒸馏水冲洗，晾干冲洗：蒸馏水冲洗，晾干阅片阅片:观察微核。观察微核。推推 片片 方方 法法观察与计数：低倍镜下选择分布均匀，染色较好的区域观察与计数：低倍镜下选择分布均匀，染色较好的区域 油镜下观察计数油镜下观察计数F 多染红细胞（多染红细胞（PCEPCE）呈灰蓝色，正染红细胞（）呈灰蓝色，
9、正染红细胞（NCENCE）呈）呈橘黄色。典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐橘黄色。典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色 。F 计数计数10001000个个PCEPCE中含微核的中含微核的PCEPCE数，并且计数数，并且计数200200个细个细胞中胞中PCEPCE与与NCENCE的比值。的比值。微核率（微核率（）=含微核含微核PCEPCE细胞数细胞数PCEPCE细胞总数细胞总数1000实验方法和步骤实验方法和步骤实验结果实验结果组别组别动物数动物数受检受检PCE总数总数含微核含微核PCE数数微核率微核率阴性对照组阴性对
10、照组模型组模型组结果分析与评价v本试验中只计数本试验中只计数PCEPCE中微核，微核率以千分率表示中微核，微核率以千分率表示.vPCE/NCEPCE/NCE为评价细胞毒性的指标：为评价细胞毒性的指标：F正常正常PCE/NCEPCE/NCE比值约为比值约为l(l(正常范围为正常范围为0.60.61.2)1.2)；F如如PCE/NCEPCE/NCE0.10.1，则表示，则表示PCEPCE形成受到严重抑形成受到严重抑制；制；F如如PCE/NCEPCE/NCE0.050.05，则表示受试化学毒物的剂，则表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。量过大，试验结果不可靠。L o g o环磷酰胺是细胞内染
11、色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂时滞留在细胞核外的遗传物质。正常PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.正常PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.具有显著的遗传、生殖毒性：停经或精子缺乏，妊娠初期时给予可致畸胎。如PCE/NCE0.染毒方法（30h两次给药法）：两次给受试物间隔24h，第二次给药后6h取材小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中2 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动，从而遗留在细胞质中固定：甲醇固定10min,需要晾干；2 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动，从而遗留
12、在细胞质中冲洗：蒸馏水冲洗，晾干MCN多数为圆形，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。副作用明显，有恶心、食欲减退、脱发、白细胞减少、中毒性膀胱炎、肝功能损伤等。如PCE/NCE0.正常PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。正常PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.正常PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.正常PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.在体外无抗肿瘤活性，进入体内经转化、分解，生成酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。正常PCE/N
13、CE比值约为l(正常范围为0.环磷酰胺40mg/kg固定：甲醇固定10min,需要晾干；如PCE/NCE0.如PCE/NCE0.染毒方法（30h两次给药法）：两次给受试物间隔24h，第二次给药后6h取材1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中环磷酰胺40mg/kg1，则表示PCE形成受到严重抑制；是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂时滞留在细胞核外的遗传物质。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成正常PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的
14、形成【Reagents】小牛血清Thank You!NCE的核糖体已消失，被染成淡桔红色。具有显著的遗传、生殖毒性：停经或精子缺乏，妊娠初期时给予可致畸胎。示小鼠骨髓嗜多染红细胞中两个微核副作用明显，有恶心、食欲减退、脱发、白细胞减少、中毒性膀胱炎、肝功能损伤等。是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂时滞留在细胞核外的遗传物质。如PCE/NCE0.正常PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.用药后24-30小时，骨髓中微核形成达峰。Thank You!典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。正常PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.示小鼠骨髓嗜多
15、染红细胞中两个微核示小鼠骨髓嗜多染红细胞中两个微核1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中环磷酰胺40mg/kg染毒方法（30h两次给药法）：两次给受试物间隔24h，第二次给药后6h取材如PCE/NCE0.在体外无抗肿瘤活性，进入体内经转化、分解，生成酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。如PCE/NCE0.2 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动，从而遗留在细胞质中副作用明显，有恶心、食欲减退、脱发、白细胞减少、中毒性膀胱炎、肝功能损伤等。固定：甲醇固定10min,需要晾干；如PCE/NCE0.小鼠是微核试验的常规动物，通常用712周龄，
16、体重1820g的小鼠。NCE的核糖体已消失，被染成淡桔红色。示小鼠骨髓嗜多染红细胞中两个微核1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中正常PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.正常PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中在体外无抗肿瘤活性，进入体内经转化、分解，生成酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。正常PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。如PCE/NCE0.油镜下观察计数
17、本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示.如PCE/NCE0.在体外无抗肿瘤活性，进入体内经转化、分解，生成酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。在体外无抗肿瘤活性，进入体内经转化、分解，生成酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。用药后24-30小时，骨髓中微核形成达峰。1，则表示PCE形成受到严重抑制；冲洗：蒸馏水冲洗，晾干在体外无抗肿瘤活性，进入体内经转化、分解，生成酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。MCN多数为圆形，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色观察与计数：低倍镜下选择分布均匀，染色较好的区域环磷酰胺40mg/kg在体外无抗肿瘤活性，进入体内经转化、分解，生成酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。
18、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。1，则表示PCE形成受到严重抑制；本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示.副作用明显，有恶心、食欲减退、脱发、白细胞减少、中毒性膀胱炎、肝功能损伤等。如PCE/NCE0.用药后24-30小时，骨髓中微核形成达峰。油镜下观察计数2 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动，从而遗留在细胞质中NCE的核糖体已消失，被染成淡桔红色。环磷酰胺1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中示小鼠骨髓嗜多染红细胞中两个微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂时滞留在细胞核外的遗传物质。固定：甲醇固定10min,需要晾干；微核(Micronucleus,MCN)是指细胞中主核之外的颗粒，染色与细胞核一致，相当于细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或杏仁状。谢谢观看！谢谢观看！
