1、实验一实验一 蛋白质的性质实验蛋白质的性质实验 蛋白质及氨基酸的呈色反应蛋白质及氨基酸的呈色反应蛋白质的沉淀反应蛋白质的沉淀反应精11.1.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。原理。2.2.加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。【目的和要求目的和要求】精2（一）（一）蛋白质及氨基酸的呈色反应蛋白质及氨基酸的呈色反应 双缩脲在碱性条件下可与双缩脲在碱性条件下可与CuCu2+2+结合生成复杂的结合生成复杂的紫红色
2、紫红色化合物。化合物。此反应称为双缩脲反应。此反应称为双缩脲反应。蛋白质或二肽以上蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应，可用此法鉴定蛋白质的定相似的肽键，因此也有双缩脲反应，可用此法鉴定蛋白质的定性和定量。性和定量。1.1.双缩脲反应双缩脲反应 【实验原理实验原理】精3水合茚三酮水合茚三酮还原茚三酮还原茚三酮紫色物质紫色物质注意：注意：脯氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸与茚三羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色酮反应生成黄色物质。物质。此反应用于此反应用于定性、定量定性、定量鉴定氨基酸。鉴定氨基酸。2.2.茚三酮反应茚三酮反应 精4(
3、二二)蛋白质的沉淀反应蛋白质的沉淀反应 蛋白质分子由于形成蛋白质分子由于形成水化层水化层和和双电层双电层而成为稳定而成为稳定的胶体颗粒。的胶体颗粒。在一定的物理化学因素影响在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷、脱水，下，蛋白质颗粒失去电荷、脱水，甚至变性而丧失稳定因素，即以甚至变性而丧失稳定因素，即以固态形式从溶液中析出，这种作固态形式从溶液中析出，这种作用称为用称为蛋白质的沉淀反应蛋白质的沉淀反应。蛋白质蛋白质H2OH2OH2OH2O+(pH pI)精51.1.可逆沉淀反应可逆沉淀反应 在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但其分子内部结构并
4、未发生显著变化，基本上保持原其分子内部结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质。沉淀因素除去后，蛋白质沉淀可再溶于有的性质。沉淀因素除去后，蛋白质沉淀可再溶于原来的溶剂中。这种沉淀反应称为原来的溶剂中。这种沉淀反应称为可逆沉淀反应可逆沉淀反应。盐析作用盐析作用脱去水化层脱去水化层电荷被中和电荷被中和低温下乙醇或丙酮对蛋白质的短时间作用低温下乙醇或丙酮对蛋白质的短时间作用等电点沉淀等电点沉淀用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。精6 在发生沉淀反应时，蛋白质的分子内部结构，空在发生沉淀反应时，蛋白质的分子内部结构，空间构象遭到破坏，失去其天然蛋白质的性
5、质，这时蛋间构象遭到破坏，失去其天然蛋白质的性质，这时蛋白质已发生变性。变性后的蛋白质沉淀不能再溶解于白质已发生变性。变性后的蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶液中，这种沉淀反应称为不可逆沉淀反应。原来的溶液中，这种沉淀反应称为不可逆沉淀反应。2.2.不可逆的沉淀反应不可逆的沉淀反应重金属盐重金属盐有机溶剂有机溶剂生物碱试剂生物碱试剂过酸、过碱过酸、过碱加热、震荡、超生波加热、震荡、超生波精7【实验方法实验方法】1.1.双缩脲反应双缩脲反应:取少量取少量尿素尿素结晶，加入干燥试管中。用微火加结晶，加入干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化
6、时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后加入尿素放出氨，形成双缩脲。冷后加入1010滴滴双缩脲试双缩脲试剂剂，混匀，混匀,观察颜色变化。观察颜色变化。另取另取1 1支试管，加入支试管，加入卵清蛋白卵清蛋白溶液溶液 1ml 1ml 再加再加入入5 5滴双缩脲试剂，混匀，观察颜色变化。滴双缩脲试剂，混匀，观察颜色变化。精82.2.茚三酮反应茚三酮反应 取取 2 2 支试管，分别加入支试管，分别加入卵清蛋白卵清蛋白溶液和溶液和0.5%0.5%甘甘氨酸氨酸溶液溶液4 4滴滴 ，再加入，再加入2 2滴滴0.1%0.1%茚三酮乙醇溶液茚三酮乙醇溶液，混匀，在沸水浴中加热混匀，在沸水浴中加热 1-2 1-
7、2 分钟，放置冷却，观分钟，放置冷却，观察颜色变化，并比较蛋白质和氨基酸呈色深浅。察颜色变化，并比较蛋白质和氨基酸呈色深浅。精93.3.蛋白质的盐析作用蛋白质的盐析作用 取取 1 1 支试管，加入支试管，加入 3ml 3ml 蛋白质蛋白质-NaCl-NaCl 溶液溶液和和 3ml 3ml 饱和饱和硫酸铵硫酸铵溶液，混匀，静置溶液，混匀，静置 10 10 分钟，分钟，球蛋白则沉淀析出。过滤后向滤液中加入硫酸铵粉球蛋白则沉淀析出。过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，至粉末不再溶解，析出末，边加边用玻璃棒搅拌，至粉末不再溶解，析出的沉淀为清蛋白。静置，弃上部清液，取部分清蛋的沉淀为清蛋
8、白。静置，弃上部清液，取部分清蛋白沉淀加水稀释，观察它是否溶解。白沉淀加水稀释，观察它是否溶解。精104.4.重金属沉淀蛋白质重金属沉淀蛋白质 取取 1 1支试管，加入约支试管，加入约 1ml 1ml 卵清蛋白质卵清蛋白质液，加入液，加入2%2%硝硝酸银酸银溶液溶液1 1 滴，观察沉淀的生成。滴，观察沉淀的生成。5.5.有机酸沉淀蛋白质有机酸沉淀蛋白质 取取 1 1 支试管，加入支试管，加入卵清蛋白质卵清蛋白质液约液约 0.5ml0.5ml，然后滴加然后滴加10%10%三氯乙酸三氯乙酸溶液数滴，观察沉淀的生成。溶液数滴，观察沉淀的生成。精111.1.酒精灯加热试管时，试管口勿对人。酒精灯加热试
9、管时，试管口勿对人。2.2.浓硝酸滴加时小心，勿伤人及桌面。浓硝酸滴加时小心，勿伤人及桌面。3.3.试剂用完及时盖上盖，防止挥发。试剂用完及时盖上盖，防止挥发。4.4.观察现象时，随加随摇，及时记录。观察现象时，随加随摇，及时记录。5.5.药品放回原处，清点自己物品。药品放回原处，清点自己物品。【注意事项注意事项】精121.1.如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果，此作何结论呈阴性结果，此作何结论?2.2.茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调?若不是，为什么若不是，为什么?3.3.蛋白质分子中的哪些基团可以与蛋白质分子中的哪些基团可以与 (1)(1)重金属离子作用而使蛋白质沉淀重金属离子作用而使蛋白质沉淀?(2)(2)有机酸、无机酸作用而使蛋白质沉淀有机酸、无机酸作用而使蛋白质沉淀?【思考题思考题】精13
