1、生物化学第一章绪论生物化学的研究内容：在分子水平上探讨构成生物体的基本物质（糖、脂、蛋白质、核酸、酶、维生素、激素等）的结构结构、物理物理化学性质化学性质和功能功能，以及这些物质在生物体内的代谢规代谢规律律（化学变化规律和能量变化规律）,揭示某些复杂的生命现象（如生长、发育、衰老、疾病等）的分子机分子机理理。生物化学既是各门生物学理论学科（细胞生物学、分子生物学、遗传学、微生物学、免疫学、临床医学、诊断医学等等）的基础，同时也是制药工程学、食品和营养学等多门应用学科的基础。第二章蛋白质化学蛋白质是由20种-氨基酸通过肽键相互连接而成的一类具有特定的空间构象和生物学活性的高分子有机化合物。蛋白质
2、对生命的意义：催化功能 调节和调控功能 运动、支持和结构功能 转运功能 贮存功能 保护功能蛋白质的组成和分类：蛋白质的组成和分类：元素组成上的特点：元素组成上的特点：含N量较高，且恒定为16%左右 蛋白质含量(%)=含氮量/16%=含氮量6.25 (凯氏定氮法测蛋白质含量的基础)蛋白质的分类蛋白质的分类蛋白质的组成单位：氨基酸蛋白质的组成单位：氨基酸 共同特点：1.除脯氨酸外，在-C上皆有一个氨基；2.均为L-氨基酸；3.除甘氨酸外，均有手性碳。氨基酸分子上碳原子的编号氨基酸分子上碳原子的编号氨基酸分子手性碳的参考标准氨基酸分子手性碳的参考标准氨基酸的分类氨基酸的分类按照氨基酸分子中所含的氨基
3、和羧基的数目不同：按照氨基酸分子中侧链R基的性质不同：.按照氨基酸分子中侧链R基的极性不同：非极性氨基酸（10种）在生理pH条件下有极性但不带电荷的氨基酸（5种）在生理pH条件下带电荷的氨基酸（5种）非极性氨基酸：非极性氨基酸：Ala(A,丙氨酸）丙氨酸）Val(V,缬氨酸缬氨酸)Leu(L,亮氨酸亮氨酸)Ile(I,异亮氨酸）异亮氨酸）Met（M,甲硫氨酸）甲硫氨酸）Phe（F,苯丙氨酸苯丙氨酸)Trp(W,色氨酸色氨酸)Pro(P,脯氨酸）脯氨酸）Tyr(T,酪氨酸酪氨酸)Gly(G,甘氨酸）甘氨酸）极性但不带电荷的氨基酸：极性但不带电荷的氨基酸：Ser(S,丝氨酸）丝氨酸）Thr(T,苏
4、氨酸）苏氨酸）Asn(N,天冬酰胺天冬酰胺)Gln(Q,谷氨酰胺谷氨酰胺)Cys(C,半胱氨酸半胱氨酸)极性带电荷氨基酸：极性带电荷氨基酸：酸性氨基酸：酸性氨基酸：Asp(D,天冬氨酸天冬氨酸)Glu(E,谷氨酸谷氨酸)碱性氨基酸：碱性氨基酸：His(H,组氨酸组氨酸)Lys(K,赖氨酸赖氨酸)Arg(R,精氨酸精氨酸)修饰氨基酸修饰氨基酸氨基酸的一般性质：能结晶，晶形多种多样；熔点高(200)；味道各异；除甘氨酸外，均有旋光性，蛋白质中的氨 基酸均为L型，细菌中有D型氨基酸；在近紫外光区(220nm-300nm)，只有Tyr、Phe和Trp三种氨基酸有光吸收能力，最大 吸收值在280nm左右
5、；酪氨酸和色氨酸酪氨酸和色氨酸的紫外吸收的紫外吸收氨基酸的两性性质和等电点氨基酸的两性性质和等电点全质子化的甘氨全质子化的甘氨酸的滴定曲线酸的滴定曲线 Handerson-HasselbalchHanderson-Hasselbalch公式：公式：proton accetors pH=pK+lg proton donorspI=（pK1+pK2)/2 氨基酸的甲醛滴定氨基酸的甲醛滴定 由于甲醛能与氨基酸中的-NH2 作用形成-NHCH2OH、-N(CH2OH)2 等羟甲基衍生物，使氨基酸向解离出H 的方向移动，表现为酸性增强，碱性减弱（约23个pH单位）。氨基酸的甲氨基酸的甲醛滴定曲线醛滴定曲
6、线氨基酸的化学反应：氨基酸的化学反应：茚三酮反应：除脯氨酸之外的-氨基酸生成的蓝紫色物质在570nm有最大吸收，脯氨酸反应生成的黄色物质在440nm有最大吸收，所以该反应可用于柱层析和纸层析中氨基酸的定量和定性分析。氨基酸侧链的反应：氨基酸侧链的反应：米伦反应：Tyr 福林反应：Tyr坂口反应：ArgPauly反应：His,Tyr乙醛酸反应：Trp氨基酸的离子交换层析：氨基酸的离子交换层析：以人工合成的高分子化合物(如苯乙烯苯二乙烯树脂)做支持物，其上交联着可交换的阳离子或阴离子。阳离子交换树脂(含酸性基团），如：-SO3H (强酸型)可解离出H+，溶液中的阳离 -COOH (弱酸型)子与其交
7、换而结合在树脂上 阴离子交换树脂(含碱性基团），如：-N(CH3)3OH(强碱性)可解离出OH,溶液中的阴离子 -NH3OH (弱碱性)能与其交换而结合在树脂上分离氨基酸混合物常用强酸型阳离子交换树脂：分离氨基酸混合物常用强酸型阳离子交换树脂：用碱处理交换柱，树脂变成Na+型，调氨基酸混合物至pH2-3，使氨基酸变成阳离子，与Na+交换而挂在树脂上。氨基酸与树脂结合的牢固程度取决于：静电引力 (主要)疏水相互作用 (次要)pH3时，静电引力大小：碱性AA(R2+)中性AA(R+)酸性AA(R0)氨基酸自动分析仪原理示意图氨基酸自动分析仪原理示意图水解方法操作优点缺点碱法加6mol/LNaoH，
8、密封于小试管，置110水解若干小时能完全水解或不完全 水解,Trp不被破坏,水解液较清亮.水解作用强烈,大部分氨基酸被破坏,发生外消旋作用酸法加5Mol/LHCl,密封于小试管,置110水解若干小时能完全水解,大部分氨基酸不被破 坏,不发生外消旋.Trp被破坏,Asn.Gln脱去酰胺氨基,水解液呈黑色.酶法 用蛋白酶 酶解样品氨基酸不被破坏,不发生外消旋,水解条件温和.水解不完全,不宜用来制备分离氨基酸。蛋白质的水解蛋白质的结构蛋白质的结构 一级结构 氨基酸的排列顺序 二级结构 三级结构 空间结构 (高级结构）四级结构蛋蛋 白白 质质 的的 结结 构构 层层 次次 及及 相相 互互 关关 系系
9、蛋白质的一级结构：蛋白质的一级结构：肽链中氨基酸的排列顺序和连接方式，是蛋白质分子结构的基础。肽键：一个氨基酸的-氨基和另一个氨基酸的-羧基之间脱去一分子水所形成的共价键。肽键的方向和表示方式肽键的方向和表示方式肽单位的结构肽单位的结构肽键的性质：肽键的性质：1.肽键具有部分双键的性质，所以不能自由旋转；2.组成肽键的4个原子和2个相邻的C在一个平面上（称为酰胺平面或肽平面）；3.除脯氨酸的-NH2参与形成的肽键外，其余的肽平面上，两个C都是处于更稳定的反式构象。肽和蛋白质特有的颜色反应：双缩脲反应肽和蛋白质特有的颜色反应：双缩脲反应（紫色和蓝紫色的复合物）蛋白质样品(纯度 97）蛋白质中多肽
10、链的数目 1 1非共价结合变性剂共价结合氧化剂还原剂断开多肽链内的二硫键1水解后分析氨基酸的组成确定N-末端和C-末端氨基酸种类用多种方法裂解多肽链成小片段并测定其氨基酸序列用重叠法重建完整多肽的氨基酸顺序，确定二硫键位置断裂二硫键的方式水解后氨基酸组成的分析水解后氨基酸组成的分析确定N-末端的方法：.2,4-二硝基氟苯法（DNFB法）和丹磺酰氯法（DNS法）.Edman降解法（苯异硫氰酸酯法）确定确定C-末端的方法：末端的方法：.肼解法苯甲醛苯甲醛（二亚苄衍生物，不溶于水）苯甲醛苯甲醛溶于水羧肽酶法羧肽酶A：能释放除Pro、Arg、Lys之外的所用C-末端氨基酸；羧肽酶B：只能释放Lys和A
11、rg形成的C-末端；裂解多肽链成小片断的方法：裂解多肽链成小片断的方法：溴化氰（CNBr）裂解法：R1=Met2.羟氨裂解法3.R1=Asn,R2=Gly 3 3酶裂解法酶裂解法胰 蛋 白 酶：R1 =Lys、Arg,R2 Pro 糜 蛋 白 酶：R1=Phe、Tyr、Trp,R2 Pro （胰凝乳蛋白酶）胃 蛋 白 酶：R1和R2Phe、Leu、Trp、Met 葡萄球菌蛋白酶：R1 Glu,Asp 羧状芽孢杆菌蛋白酶：R1=Arg二硫键位置的确定：对角线电泳二硫键位置的确定：对角线电泳胃蛋白酶水解第一相对角线电泳肽段pH6.5暴露在过甲酸蒸汽中第二相电泳取下偏离对角线的肽段测序推断出二硫键的
12、位置 蛋白质样品（相同条件下旋转90）借助重叠肽确定肽段在原多肽链中的次序借助重叠肽确定肽段在原多肽链中的次序N-末端残基：HC-末端残基：S第一套肽段：OUS PS EOVE RLA HOWT第二套肽段：SEO WTOU VERL APS HO蛋白质的二级结构蛋白质主链折叠产生的由氢键维系的有规则的空间构象，称为二级结构。即多肽链的主链骨架中若干肽单位，各自沿一定的轴盘旋或折叠，形成的规则的氢键结构的构象。由于肽键是一个刚性平面，所以羰基碳原子与氮原子之间的CN键是不能自由旋转的。但围绕碳原子的C C键以及C N键是可以自由旋转的。这两个键所形成的相对角度确定了蛋白质主链的特定构象。当当、均
13、为均为180时完全伸展的主链构象时完全伸展的主链构象二级结构的主要类型：-螺旋(-helix)-折叠(-pleated sheet)-转角(-turn)0.54nm1.-螺旋(-helix)螺旋的方向为右手螺旋，每3.6个氨基酸旋转一周，螺距为0.54nm，每个氨基酸残基的高度为0.15nm，肽键平面与螺旋长轴平行；氢键是-螺旋稳定的次级键，相邻的螺旋间形 成链内氢键，即从N端开始，每个氨基酸残基上的 C=O与它后面第四个残基的N-H上的H形成氢键；-螺旋中，氨基酸残基的侧链分布在螺旋的外侧，它的形状、大小及电荷均影响螺旋的形成和稳定。-螺旋也叫3.613螺旋，13表示氢键封闭的环内 含有13
14、个原子。影响-螺旋稳定的因素：Gly 和Pro;相邻的带相同电荷的氨基酸；相邻的带较大侧链的氨基酸，如Val,Leu等-折叠结构折叠结构 折叠折叠结构结构的特征：的特征：肽链主链上的-NH-和相邻肽链上的-CO-之间 形成有规律的氢键,所有的氢键都参与了链间氢键的形成，氢键与肽链的长轴近于垂直；肽链有平行和反平行两种排列方式，反平行 式中形成氢键的各原子呈直线排列，所以更 稳定；反平行式中,两个氨基酸之间的距离为0.35nm；肽链上的R基交替分布在折叠片的两侧，正反交错，而肽平面几乎在同一平面上。-转角结构转角结构-转角结构的特点：转角结构的特点：多肽链出现180的回折，氢键是在第一个氨基酸的
15、羧基与第四个氨基酸的氨基之间形成；Gly和Pro有利于形成-转角结构，该结构主要存在于球状蛋白质的表面。超二级结构和结构域：超二级结构和结构域：超二级结构：蛋白质分子中的多肽链在三维折叠中形成的有规则的二级结构的聚集体，如型，型，型等，它们通常以一个整体参与三维折叠。结构域：蛋白质多肽链在三维折叠中形成的紧密装配的、在空间上可明显区分并相对独立的区域性结构，通常也是功能域。蛋白质的三级结构：蛋白质的三级结构：多肽链中不同的结构域在三维空间上的折叠组合所形成的复杂的空间构像称为三级结构，它包括多肽链中一切原子的空间排列方式。维持蛋白质三级结构的主要次级键：维持蛋白质三级结构的主要次级键：氢键氢键
16、疏水相互作用疏水相互作用范德华力范德华力离子键离子键共价键等共价键等 球状蛋白质三维结构的特征：球状蛋白质三维结构的特征：（1）一种分子可含有多个二级结构元件；（2）具有明显而丰富的折叠层次；（3）紧密折叠成球状或椭圆状；（4）疏水侧链埋藏在分子内部而亲水基团暴 露在分子表面；（5）分子表面往往有一个罅缝（空穴）。具有单个跨膜肽段的膜蛋具有单个跨膜肽段的膜蛋白白具有个跨膜肽段的膜蛋具有个跨膜肽段的膜蛋白白蛋白质的四级结构：蛋白质的四级结构：由两条或两条以上的具有三级结构的多肽链聚由非共价相互作用形成的特定的聚合体结构称为蛋白质的四级结构。其中每一条肽链称为亚基，亚基只有聚合成完整的四级结构才具
17、有生物活性。亚基和亚基之间不能共价连接。血红蛋白的构象血红蛋白的构象肌红蛋白的构象肌红蛋白的构象 亚基缔合在结构和功能上的优越性亚基缔合在结构和功能上的优越性 1.增强结构的稳定性 2.提高遗传的经济性和效率 3.使酶的催化部位汇集在一起4.亚基之间的别构效应可以更好地调控蛋白的功能蛋白质的结构和功能的关系：蛋白质的结构和功能的关系：蛋白质的一级结构决定高级结构(自学)蛋白质的一级结构与功能的关系 (自学)蛋白质的三级结构与功能的关系：肌红蛋白的结构肌红蛋白的结构His 93(F8)His 64(E7)血红素血红素氧合肌红蛋白中血红素铁的配位情况氧合肌红蛋白中血红素铁的配位情况肌红蛋白去氧时的
18、肌红蛋白去氧时的T态至氧合时的态至氧合时的R态的变化态的变化（铁原子移近血红素平面）（铁原子移近血红素平面）肌红蛋白与血红蛋白肌红蛋白与血红蛋白亚基的结构对照亚基的结构对照去氧血红蛋白中去氧血红蛋白中各亚基间的盐桥各亚基间的盐桥去氧血红蛋白的结构去氧血红蛋白的结构血红蛋白由去氧时的血红蛋白由去氧时的T态到氧合时的态到氧合时的R态的变化态的变化血红蛋白（血红蛋白（Hb）与肌红蛋白（与肌红蛋白（Mb）的氧合曲线的氧合曲线BPG对血红蛋白氧结合力的影响：对血红蛋白氧结合力的影响：H+、CO2对血红蛋白结合氧的影响：对血红蛋白结合氧的影响：Bohr效应效应蛋白质的性质：蛋白质的性质：1.蛋白质的两性性
19、质 蛋白质也是两性电解质，溶液的pH可以改变蛋白质的带电情况。蛋白质的等电点（等离子点）受组成蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸数目的影响。在等电点时蛋白质的溶解度最低。在等电点时蛋白质的溶解度最低。2.2.蛋白质的大分子特性蛋白质的大分子特性 a a 渗透与渗透压渗透与渗透压b b 蛋白质的胶体性质及沉淀蛋白质的胶体性质及沉淀 分散相质点的半径介于1-100nm时形成的均匀分散的溶液，称为胶体溶液。蛋白质溶液作为胶体溶液，稳定的原因是蛋白质分子表面的水化层和双电层。沉淀蛋白质的方法 蛋白质的变性和复性（自学）蛋白质的变性和复性（自学）蛋白质的分离纯化方法：蛋白质的分离纯化方法：凝胶过滤层析(分子
20、排阻层析)分离蛋白质常用的凝胶的商品名：Sephadex离子交换纤维素层析羧甲基纤维素层析（CM-纤维素）：结合带正电荷的蛋白质分子二乙氨基乙基纤维素层析（DEAE-纤维素）：结合带负电荷的蛋白质分子凝凝 胶胶 过过 滤滤 层层 析析 原原 理理 示示 意意 图图 亲和层析亲和层析是利用生物亲和力，即蛋白质分子和其配基之间特有的识别能力而建立的一种纯化方法。蛋白质分子量的测定：蛋白质分子量的测定：凝胶过滤法测相对分子量 在一定的分子量范围内，蛋白质分子量M的对数和洗脱体积（Ve）成线性关系：logM=K1-K2Ve聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)SDS-PAGE测相对分子量浓缩胶样品 分离胶 在
21、PAGE中，除了一般的电荷效应外，还有凝胶对样品的分子筛效应和浓缩效应，三种效应共同起作用，使样品的分离效果大大提高。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在SDS和少量的巯基乙醇存在时，蛋白质分子解聚并处于完全展开的状态，SDS以其烃基链与蛋白质分子的侧链结合成复合物，每两个氨基酸残基相当于结合一个SDS分子，使得蛋白质分子在电场中的迁移率完全取决于相对分子量而同本身所带的电荷及形状无关。lgM=K1K2R双双 向向 电电 泳泳第一相：等电聚焦电泳第二相：SDS-PAGE蛋白质的含量测定方法n 凯氏定氮法 n 原理：天然有机物在浓硫酸消化时分解出氨，氨与硫酸生成硫酸铵。消化完毕后在凯氏
22、定氮仪中加入强碱使硫酸铵分解放出氨，用水蒸气蒸馏法将氨蒸入过量标准无机酸溶液中，然后用标准碱溶液进行滴定，求出样品的含氮量。n 双缩脲法 n原理：具有两个和两个以上肽键的化合物在碱性溶液中与Cu+形成紫红色络合物，颜色深浅与样品浓度成正比，可通过比色的方法测出蛋白质的浓度。n Folin-酚试剂法（Lowry法）n原理：蛋白质的肽键在碱性条件下与Folin-酚试剂甲中的酒石酸钾钠铜盐反应生成紫红色络合物，然后被试剂乙的磷钼酸、磷钨酸等还原成蓝色，在750nm波长下，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。紫外吸收法：原理：蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质具有吸收紫外线的能力，吸收高峰在280nm。在此波长范围内，蛋白质的光吸收值与其含量呈正比关系。n 染料结合法（考马斯亮蓝染色法）n 原理：考马斯亮蓝有红色和蓝色两种不同的颜色形式。它与蛋白质通过范德华键结合后，颜色由红色形式（最大光吸收为465nm）转化为蓝色形式（最大光吸收为595nm），结合形式与蛋白质含量成正比。通过测定595nm的光吸收的增加量可以求出蛋白质的含量。
