1、一、抗药性标记及其插入失活选择法一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和和Ampr。Tetr上有插入位点上有插入位点BamH I;Ampr上有插入位点上有插入位点Pst I。1.原理：原理：（1）四环素：）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：）氨苄青霉素抗性基因：产生产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不
2、杀死停止生长的细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：）环丝氨酸：转化处转化处理受体理受体菌菌Amp AmpTcBamH I在在Tc抗性基因上抗性基因上负选择负选择如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，导致四，导致四环素抗性基因失活，可用环素抗性基因失活，可用四环素加环四环素加环丝氨酸丝氨酸培养液选择重组克隆。培养液选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。反而被环丝氨酸杀死。（1）四
3、环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基无环丝氨酸培养基如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导致氨苄，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素青霉素指示液选择。指示液选择。-半乳糖苷酶半乳糖苷酶乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝+深蓝色深蓝色1.原理：原理：载体载体上有一段上有一段Xgal分解成兰色产物。分解成兰色产物。利用插入的外源基因的利用插入的外源基因的表达产物表达产物特性进行直特性进行直接选择。（只在特定条件下）。接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受转化进来的外源基因产物
4、能够弥补受体菌株的突变型缺陷。体菌株的突变型缺陷。一、原理：一、原理：1.弥补缺陷弥补缺陷his-his+受体菌：受体菌：外源基因：外源基因：在不含组氨酸的在不含组氨酸的培养基中生长培养基中生长二氢叶酸还原酶（二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。嘧啶有抗性。DHFR载体载体连接连接转化受转化受体菌体菌三甲氧苄二氨嘧三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板啶培养基平板含含DHFR的克隆才能生长的克隆才能生长例：例：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。利用有插入片段的重组载体的分子量比利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。野
5、生型载体分子量大。一、直接电泳检测法一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、中分离质粒，电泳、比较其分子量。比较其分子量。分子量分子量Marker载体载体重组克重组克隆隆1.原理：原理：根据已知的外源根据已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。否符合预计的结果。1.原
6、理原理PCR能在模板序列上扩增出预期能在模板序列上扩增出预期DNA片断。片断。2.过程过程（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。）。（2）用外源）用外源DNA插入片断引物作插入片断引物作PCR。（3）电泳）电泳PCR产物。产物。（4）检查是否有）检查是否有PCR产物。产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。产物的长度是否与外源基因一致。1.核酸核酸杂交杂交一、原一、原理：理：重组克隆与探针杂交。重组克隆与探针杂交。3.识别标记识别标记32P 或或 125I。（1）放射性同位素）放射性同位素2.检测用的探针检测用的探针与外源与外源DNA插入片断互补的序列。插入
7、片断互补的序列。（2）非放射性标记）非放射性标记荧光素荧光素用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测DNA样品。样品。1.Southern blotting从宿主细胞中提取从宿主细胞中提取DNA（或质粒（或质粒载体），再用探针杂交。载体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。与探针杂交，在底片上曝光显示。特点：特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。可以直接找出阳性菌落。DNA-RNA杂交。杂交。1）原理：）原理：2）选择过程）选择过程在在70%甲酰胺中，把甲酰胺中，把DNA双链
8、变性，复双链变性，复性的时候，性的时候，DNA-RNA杂交分子比杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种双链更稳定。电镜下可见一种R-环环形结构。形结构。用外源基因的用外源基因的mRNA与重组载体杂交。与重组载体杂交。缺点：需要电镜！缺点：需要电镜！用用DNA（或（或RNA）探针检测探针检测RNA样样品。品。主要检测插入片主要检测插入片断是否被转录。断是否被转录。从宿主细胞中提从宿主细胞中提取取RNA，再用探，再用探针杂交。针杂交。利用抗体作为利用抗体作为“探针探针”来检测转入受体菌来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。并且表达出相应的蛋白质的外源基因。对表达产物的检测。
9、对表达产物的检测。蛋白蛋白蛋白蛋白“杂交杂交”1.1.原理：原理：在蛋白质凝胶电泳以后，用在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫转膜和免疫的方的方法检测胶上的蛋白质泳带。法检测胶上的蛋白质泳带。（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质蛋白质维持线性状态维持线性状态，并与蛋白质，并与蛋白质结合，使蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷带上负电荷。SDS:（SDS-PAGE）：）：（Polyacrylamide gel electrophoresis）在电场的作用下线性在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中
10、向正极胺凝胶介质中向正极移动，移动，移动的速率主移动的速率主要取决于其分子量大要取决于其分子量大小（链的长短）小（链的长短），从，从而把不同分子量的肽而把不同分子量的肽链分开。链分开。电泳电泳buffer电泳电泳buffer点样点样电泳方向电泳方向已知分子量的蛋白质已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。白质提供分子量估计。商品化供应商品化供应Da道尔顿道尔顿(质量单位质量单位,等于等于一氧原子质量的十六分一氧原子质量的十六分之一。之一。一克约为一克约为6 610102323道尔顿道尔顿DaltonSDS PAGE考马斯亮蓝
11、：考马斯亮蓝：灵敏度底、只能检出灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可带，但可褪色回收。褪色回收。硝酸银：硝酸银：灵敏度高、可检出灵敏度高、可检出2-5ng/带。带。2）转到膜上进行染色。）转到膜上进行染色。1）直接染色）直接染色电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、膜、中性尼龙膜等）。中性尼龙膜等）。Western（转膜）（转膜）胶里的蛋白质带在电胶里的蛋白质带在电场的作用下场的作用下横向横向转移转移到正极一侧的膜上。到正极一侧的膜上。膜膜胶胶蛋白蛋白原理与原理与ELISA相同。相同。待测蛋白待测
12、蛋白硝酸纤硝酸纤维素膜维素膜一抗一抗 二抗二抗辣根过氧辣根过氧化物酶化物酶底物底物产物产物PAGE胶胶 待测蛋白待测蛋白显色显色辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶：HRPO1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（）用二抗与一抗结合（二抗上带有二抗上带有HRPO）。）。4）清洗掉未结合的二抗。）清洗掉未结合的二抗。5）用）用HRPO的底物浸泡膜。的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。）暗室里曝光，冲洗胶片。Immuno Blotting单抗单抗blotting结果结果
13、123 4一、无细胞翻译系统一、无细胞翻译系统能把外源的能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提翻译成蛋白质的细胞提取物。取物。如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。系统。借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。其产物是否符合预期。适用于适用于mRNA转录丰度高的外源基因。转录丰度高的外源基因。mRNA无细胞翻译系统无细胞翻译系统35S标记的标记的甲硫氨酸甲硫氨酸翻译翻译35S标记的肽链标记的肽链PAGE电泳电泳放射自显影放射
14、自显影比较放射性比较放射性带纹的位置带纹的位置载体载体+外源外源DNA转录转录与预期的产物与预期的产物分子量相符？分子量相符？mRNA一旦与一旦与DNA杂交成杂交成RNA-DNA双链双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。抑制）。单链单链mRNA核糖体核糖体小亚基小亚基核糖体核糖体大亚基大亚基能翻译能翻译mRNADNA核糖体核糖体小亚基小亚基核糖体核糖体大亚基大亚基不能翻译不能翻译1.原理原理1.原理：原理：在高甲酰胺溶液中载体上克隆的在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的放
15、出与它对应的mRNA，进行体外转录。，进行体外转录。研究其转录产物的性质是否是预期的基研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。因产物（如分子量、免疫源性等）。硝酸纤硝酸纤维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插入的入的cDNA总总mRNAcDNA基因的基因的mRNA杂交杂交洗脱洗脱cDNA基因的基因的mRNA体外翻译体外翻译cDNA编编码的蛋白码的蛋白电泳电泳凝胶放射自显影凝胶放射自显影cDNA编编码的蛋白码的蛋白硝酸纤硝酸纤维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插入的入的cDNA硝酸纤硝酸纤维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插入的入的cDNA收集收集35S标记的氨基酸标记的氨基酸专门设
16、计检测能同专门设计检测能同DNA特异结合的蛋特异结合的蛋白质因子。白质因子。待测蛋白质待测蛋白质硝硝酸酸纤纤维维素素滤滤膜膜能与蛋白质结能与蛋白质结合的合的DNA序列序列放射性标记放射性标记待测蛋白质待测蛋白质硝硝酸酸纤纤维维素素滤滤膜膜能与蛋白质结能与蛋白质结合的合的DNA序列序列放射性标记放射性标记真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。提供甲基。二氢叶酸二氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶（二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）1.胸苷激酶（胸苷激酶（thymidine kinase,tk）（1）TK选择原理选择原理
17、四氢叶酸的必要性四氢叶酸的必要性DHFR氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。物。能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、dCTP和和dTTP的合成：的合成：dUMPdATPTTPdCTP氨甲喋啉氨甲喋啉抑制抑制抑制抑制TK+细胞细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（用培养基中的胸苷（T）合成）合成TTP，存活。，存活。Ttk次黄嘌呤次黄嘌呤的补救作用的补救作用细胞可以利用次黄嘌呤合成细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和和dCTP。dUMPdATPTTPdCTP次黄嘌呤次黄嘌呤补救补救氨甲喋啉
18、氨甲喋啉抑制抑制抑制抑制 HAT培养基：培养基：Tk-细胞株。细胞株。TK基因。基因。宿主细胞宿主细胞 载体标记载体标记含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有转入只有转入TK基因的细胞才能生存。基因的细胞才能生存。20真核细胞核苷酸的合成需要真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸四氢叶酸提提供甲基。供甲基。（1）选择原理选择原理二氢叶酸还原酶的必要性二氢叶酸还原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸二氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原
19、酶二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。以能合成四氢叶酸。能在能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存的培养基中生存不需要补救！不需要补救！DHFR-细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。以不能合成四氢叶酸。需要补救！需要补救！不能在无不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。的培养基中生存。dUMPdATPTTPdATP次黄嘌呤次黄嘌呤补救补救胸苷胸苷补救补救无四氢叶酸提供甲基，无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻合成
20、受阻时，时，胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救:DHFR-细胞株（不能在细胞株（不能在无核苷酸无核苷酸的培的培养基中生长）。养基中生长）。宿主细胞宿主细胞透析除去血清中的内源性核苷酸，以透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。免补救。无核苷酸的培养基无核苷酸的培养基需要需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！补救！氨甲喋呤氨甲喋呤“加压加压”添加少量氨甲喋啉抑制添加少量氨甲喋啉抑制内源性内源性DHFR的的补救作用，可提高选择。补救作用，可提高选择。DHFR+基因。基因。载体标记载体标记只有转入只有转入DHFR+基因的细胞才能生存。基因的细胞才能生存。DHFR-DHFR-
21、DHFR+DHFR+livedie无核苷酸的培养基无核苷酸的培养基是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但但不影响真核生物不影响真核生物。（1）选择原理）选择原理 新霉素新霉素（neomycin）新霉素的类似物，是一种新霉素的类似物，是一种 氨基糖苷，氨基糖苷，对对真核细胞和原核细胞都有毒性真核细胞和原核细胞都有毒性。G418（geneticin）细菌的新霉素抗性基因（细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一种）编码一种磷酸转移酶（磷酸转移酶（APH），能使，能使G418失活。失活。G418真核细胞真核细胞
22、死亡死亡G418存活存活neor真核细胞真核细胞含含致死剂量致死剂量G418的完全培养基。的完全培养基。G418培养基培养基真核细胞株均可。真核细胞株均可。neor基因。基因。宿主细胞宿主细胞载体标记载体标记G418：（：（100-800 g/mL）CAT是由大肠杆菌转座子是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，催化编码的，催化氯霉素发生乙酰化氯霉素发生乙酰化失活。失活。氯霉素氯霉素cat含氯霉素的完全培养基。含氯霉素的完全培养基。真核细胞株均可。真核细胞株均可。cat基因。基因。乙酰氯霉素乙酰氯霉素（1）选择原理）选择原理（2）选择条件选择条件（3）宿主细胞宿主细胞（4）载体标记）载体标记chlor
23、amphenicol acetyl transferase在转化的细胞提取物中测定是否有在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉素。乙酰氯霉素。免疫学检查：免疫学检查：用抗用抗CAT的血清进行的血清进行Western blot或或ELISA，检查，检查CAT的表达。的表达。Anti-CAT Antiserum is available from Invitrogen.Other kits to assay for CAT proteinusing ELISA assay are available from Roche Molecular Biochemicals and Molecular P
24、robes.分析乙酰氯霉素分析乙酰氯霉素（1 1）大肠杆菌的大肠杆菌的-D-葡萄糖醛酸糖苷酶葡萄糖醛酸糖苷酶 （-D-glucuronidase，GUS）；）；（2 2）细菌和萤火虫的荧光素酶细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）；）；（3 3）水母绿色荧光蛋白（水母绿色荧光蛋白（GFP）基因）基因 （Green Fluorescent Protein）。）。1.报道基因（报道基因（reporter gene)（4 4）其它）其它4-甲甲-D-葡糖醛酸葡糖醛酸荧光产物荧光产物GUSGFP紫外光照紫外光照发绿色荧光发绿色荧光5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-葡糖醛酸葡糖醛酸蓝色水解产物蓝色水解产物GUS
