1、凝胶过滤层析凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。定义应用原理带网孔的带网孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小分子进入小分子进入葡聚糖珠内葡聚糖珠内大分子不大分子不能进入珠能进入珠内，经珠内，经珠之间缝隙之间缝隙流出流出固定相（凝胶）固定相（凝胶）n三维空间网状结构三维空间网状结构固固定定相相流流动动相相小分子小分子被延滯被延滯小分子小分子大分子大分子较较快流出快流出基本概念分配
2、系数（Kd）(2)Ve=Vo+Vi(2)Ve=Vo+Vi，Kd=1Kd=1n分子完全不被排阻分子完全不被排阻n完全向凝胶颗粒内部扩散完全向凝胶颗粒内部扩散n在两相分配的比值为在两相分配的比值为1,1,最后流出最后流出(1)Ve=Vo(1)Ve=Vo，Kd=0Kd=0n分子完全被排阻于凝胶颗粒之外分子完全被排阻于凝胶颗粒之外n全部分布于流动相里全部分布于流动相里n最先流出最先流出(3)0 Kd 1(3)0 Kd 1，Ve=Vo+ViKdVe=Vo+ViKdn为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散散n每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数每个溶质分子在流动相和
3、固定相之间有一个特定的分配系数特点：特点：与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关 小分子量小分子量大分子量大分子量典型的凝胶类型n交联葡聚糖凝胶：交联葡聚糖凝胶：SephadexSephadexn丙烯葡聚糖凝胶：丙烯葡聚糖凝胶：Sephacryl Sephacryl n琼脂糖凝胶：琼脂糖凝胶：SepharoseSepharose和和Bio-GelBio-Geln其它：有机凝胶其它：有机凝胶SepharonSepharon，交联聚醚，交联聚醚ToyopealToyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等，纤维素凝胶，改性刚性填料等凝胶过滤层析实验技术1 1、凝胶的选择、凝胶的选择2 2、凝
4、胶的预处理、凝胶的预处理3 3、装柱、装柱4 4、样品的准备、样品的准备5 5、上样、上样6 6、洗脱和收集、洗脱和收集7 7、凝胶的再生及保存、凝胶的再生及保存凝胶过滤层析实验技术1 1、凝胶的选择、凝胶的选择n选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的凝胶的分离范围分离范围（渗入限与排阻限）、（渗入限与排阻限）、理化稳定性、强度、理化稳定性、强度、非特异吸附性质非特异吸附性质等。等。n对生物样品来说，经常遇到的是两种分离
5、形式。一种是只将对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作，如蛋白质与盐类，称作类类分离或组分离分离或组分离。另一类则是要将。另一类则是要将分子量相差不很大的物质分子量相差不很大的物质加加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离分级分离。后。后者对实验条件和操作要求都比较高。者对实验条件和操作要求都比较高。类分离n目的是分开样品中分子量悬殊的目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组较大分子组”和和“较小分子组较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相近的组分两
6、类物质，并不要求分离分子量相近的组分n选择凝胶时，应使样品中选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限大分子组的分子量大于其排阻限，而，而小小分子组的分子量小于渗入限分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数。也就是说大分子的分配系数Kd=0Kd=0，小分子的小分子的KdKd1 1。这样能取得最好的分离效果。这样能取得最好的分离效果。例题：从某蛋白质溶液（例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下）中除去无机盐，应选择下列哪种凝胶最合适？列哪种凝胶最合适？B.Sephadex G-25（分级范围，（分级范围，1000-5000 D）A.Sephadex G-
7、15（分级范围，（分级范围，1,500 D）C.Sephadex G-150（分级范围，（分级范围，5,000-400,000 D）凝胶粒度的影响n凝胶粒度的大小凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒细粒凝胶柱凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析精制分离或分析等。等。粗粒粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐粗制分离，脱盐等。等。n在一般柱层析中，使用干颗粒直径在在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70m70m左右较合适。对于在
8、水中左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150m150m左右。凝胶颗粒大小左右。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好要均匀，这样流速稳定，效果较好同一流速下不同粒度的同一流速下不同粒度的Sephadex G-25Sephadex G-25柱的洗脱效果柱的洗脱效果2、凝胶的预处理n溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上或将干胶加入水里，边加边搅，然后放到沸水浴中加热接近100，保持数个小时。根据干凝胶的填充体积计算所需的干凝胶量n平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同（使凝胶溶胀状态稳定）3、装柱
9、层析柱层析柱（a a）自制简易层祈柱（）自制简易层祈柱（1 1玻璃玻璃管；管；2.2.橡皮塞；橡皮塞；3 3尼龙网）；尼龙网）；（b b）普通商品柱；）普通商品柱；（c c）双底板层析柱（）双底板层析柱（1.1.洗脱液进洗脱液进出口；出口；2.2.多孔底板；多孔底板；3 3柱床；柱床；4 4恒温水进口；恒温水进口；5 5恒温水出口；恒温水出口；6 6可调节的塞子）可调节的塞子）4、样品的准备p样品的样品的粘度粘度：粘度大产生介质吸：粘度大产生介质吸附，一般要求样品粘度附，一般要求样品粘度小于小于0.01Pa0.01Pas sp样品的样品的浓度浓度：样品浓度以：样品浓度以不大于不大于4 4为宜，
10、样品浓度过大往往导致为宜，样品浓度过大往往导致粘度增大。如果样品浑浊，应先粘度增大。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱过滤或离心除去颗粒后上柱p样品的样品的体积体积：分析用量一般应：分析用量一般应低低于总柱体积的于总柱体积的5%5%，制备用量一般，制备用量一般为为15%15%或更多（或更多（20-30%20-30%）。样品黏度对洗脱曲线的影响（1 1）加葡萄糖）加葡萄糖2 0002 000，使终浓度为，使终浓度为5%5%，相对粘度，相对粘度11.8;11.8;（2 2）加葡萄糖）加葡萄糖2 0002 000，使终浓度为，使终浓度为2.5%2.5%，相对，相对粘度粘度4.2;4.2;（3
11、 3）加葡萄糖）加葡萄糖2 0002 000，使终浓度为，使终浓度为1%.1%.5、上样p打开层析柱下端出口，使缓冲液流出至刚好达到凝胶胶面p具体步骤为：p沿柱壁缓慢加入样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁p加样时应尽量减少凝胶床面的搅动。加样的方法可以是直接将样品加到层析床表面，或可用微量泵控制6、洗脱和收集n打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。n用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。p洗脱时应注意的问题洗脱时应注意的问题：流速不宜过快且要稳定流速不宜过快且要稳定洗
12、脱液的成分也不应改变洗脱液的成分也不应改变（凝胶溶胀程度）（凝胶溶胀程度）整个洗脱过程中始终保持一定的操作压整个洗脱过程中始终保持一定的操作压可以用水或缓冲液作洗脱液可以用水或缓冲液作洗脱液 流速对洗脱曲线的影响流速对洗脱曲线的影响 流速较低，分辨率较高流速较低，分辨率较高7、凝胶的再生及保存p再生p 用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能，或参照凝胶产品说明书p凝胶的保存方法p 0.02%叠氮钠或0.002%双氯苯双胍己烷应用：测定相对分子质量p标准曲线法标准曲线法 对于对于特定的测定系统特定的测定系统，先以，先以3 3个以上（越多越好）的已知分子量的标准蛋白个以
13、上（越多越好）的已知分子量的标准蛋白（目前已有配套标准蛋白系列产品出售）过柱，测取各自的（目前已有配套标准蛋白系列产品出售）过柱，测取各自的VeVe值。以值。以VeVe作作纵坐标，纵坐标，LogMLogM作横坐标制做标准曲线。作横坐标制做标准曲线。在在同一测定系统同一测定系统中测出未知物质的中测出未知物质的VeVe值便可由标准曲线求得分子量。分子值便可由标准曲线求得分子量。分子量在量在10 00010 000150 000150 000之间的球形蛋白用此法测出的分子量误差在之间的球形蛋白用此法测出的分子量误差在1010左右左右Velog M标准曲线标准曲线凝胶过滤层析的特点p优点：p操作条件温和，样品回收率可接近100，并且重复性高。p作为脱盐手段，与透析法相比速度快、精度高；与超滤法相比，蛋白活性收率高；p分离机理简单，操作参数少，容易规模放大p缺点：p分辨率不高，对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离p料液处理量小，并且样品粘度不宜太高p分离操作较慢，由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，流速过快会降低分辨率
