1、第第9 9章章 色谱分析法概论色谱分析法概论p 色谱法分类色谱法分类p 色谱常用术语色谱常用术语p 色谱分离的基本理论色谱分离的基本理论p 色谱定性和定量的方法色谱定性和定量的方法 色谱分析法（色谱分析法（chromatography，由英文单词，由英文单词chroma“色色彩彩”和和graphy“图谱图谱”复合而成），它利用试样中共存组分之复合而成），它利用试样中共存组分之间的吸附、分配、交换、迁移速率以及其它性能上的差异，间的吸附、分配、交换、迁移速率以及其它性能上的差异，先将它们分离，而后通过检测器按一定顺序进行分析测定。先将它们分离，而后通过检测器按一定顺序进行分析测定。主要包括色谱分
2、析法（气相色谱、液相色谱、纸色谱、薄层主要包括色谱分析法（气相色谱、液相色谱、纸色谱、薄层色谱、超临界流体色谱等）、高效毛细管电泳法及色谱色谱、超临界流体色谱等）、高效毛细管电泳法及色谱-质谱质谱联用法和色谱联用法和色谱-光谱、波谱联用法等。光谱、波谱联用法等。具有高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快及应用范围具有高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快及应用范围广等优点。广等优点。俄国植物学家俄国植物学家Tswett茨维特在茨维特在1906年使用的装置：年使用的装置：色谱原型装置如图。色谱法是一种分离技术。色谱原型装置如图。色谱法是一种分离技术。1)用石油醚浸取叶片中的色素，然后将浸取液倒入
3、用石油醚浸取叶片中的色素，然后将浸取液倒入一根填充一根填充CaCO3的直立玻璃管的顶端；的直立玻璃管的顶端；2)再加入纯石油醚进行淋洗；再加入纯石油醚进行淋洗；3)淋洗的结果使玻璃管内植物色素被分离成具有不淋洗的结果使玻璃管内植物色素被分离成具有不同颜色的谱带。同颜色的谱带。4)淋洗时间足够长时，被分离的组分就会随石油醚淋洗时间足够长时，被分离的组分就会随石油醚先后流出柱外。先后流出柱外。玻璃管称为色谱柱，管内填充物玻璃管称为色谱柱，管内填充物(CaCO3)是固定不动的，称为是固定不动的，称为固定相，淋洗剂（石油醚）是携带混合物流过固定相的流体，固定相，淋洗剂（石油醚）是携带混合物流过固定相的
4、流体，称为流动相。称为流动相。9.1 9.1 色谱法分类色谱法分类按两相状态流动相是气体的色谱法称为气相色谱(GC)流动相是液体的色谱法称为液相色谱(LC)常用的气相色谱流动相有N2，H2，He等气体常用的液相色谱流动相有H2O，CH3OH等使用超临界流体作为色谱流动相的，这一类色谱称为超临界流体色谱(SFC)常用的超临界流体有CO2、NH3、CH3 CH2OH、CH3OH等。按操操作作形形式式固定相装在柱管内的色谱法称为柱色谱(column chromatography,CC)固定相填充于玻璃或金属管内叫填充柱(packed column)色谱固定相附着或键合在管的内壁上，中心是空的，叫毛细
5、管柱(capillary column)色谱平面色谱（planar chromatography）固定相为滤纸的色谱法称为纸色谱(paper chromatography,PC)固定相压成或涂成薄层的色谱法，称为薄层色谱(thin layer chromatography,TLC)按分离原理1.吸附色谱(adsorption chromatography)利用固体吸附剂（固定相）表面对各组分吸附能力强弱的不同进进行分离2.分配色谱(partition chromatography)利用固定液对各组分的溶解能力（分配系数）不同进行分离3.离子交换色谱(ion exchange chromatog
6、raphy，IEC)利用离子交换剂（固定相）对各组分的亲和力不同进行分离4.空间排阻色谱(size exclusion chromatography，SEC)利用某些凝胶（固定相）对分子大小、形状不同的组分所产生的 阻滞作用不同而进行分离9.2 9.2 色谱常用术语色谱常用术语1.色谱过程：色谱过程：色谱过程是物质分子在相色谱过程是物质分子在相对运动的两相间分配对运动的两相间分配“平平衡衡”的过程。的过程。混合物中，若各个组分被混合物中，若各个组分被流动相携带移动的速率不流动相携带移动的速率不相等，则形成差速迁移而相等，则形成差速迁移而被分离。被分离。2.色谱图：色谱图：色谱分析时，混合物中各
7、组分色谱分析时，混合物中各组分经色谱柱分离后，随流动相依经色谱柱分离后，随流动相依次流出色谱柱，经检测器把各次流出色谱柱，经检测器把各组分的浓度信号转变成电信号组分的浓度信号转变成电信号，然后用记录仪将组分的信号，然后用记录仪将组分的信号记录下来。记录下来。色谱图色谱图(chromatogram)就是组分在检测器上产生的信号强度就是组分在检测器上产生的信号强度对时间对时间t所作的图，由于它记录了各组分流出色谱柱的情况所所作的图，由于它记录了各组分流出色谱柱的情况所以又叫色谱流出曲线。以又叫色谱流出曲线。1）基线）基线在一定色谱条件下，仅有流动相通过检测器在一定色谱条件下，仅有流动相通过检测器系
8、统时所产生的信号的曲线，称为基线系统时所产生的信号的曲线，称为基线(base line)。基线反映仪器（主要是检测器）的噪。基线反映仪器（主要是检测器）的噪声随时间的变化。声随时间的变化。2）峰高）峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离为峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离为峰高（peak height），以），以h表示。其大小可以用纸表示。其大小可以用纸的高度的高度(mm)，电信号的大小，电信号的大小(mV或或mA)表示。表示。3）峰宽）峰宽色谱峰的宽度直接和分离效率有关。描述色谱峰峰宽的方法有三种方法。色谱峰的宽度直接和分离效率有关。描述色谱峰峰宽的方法有三种方法。（1）标准偏差）标准偏差()：
9、为峰高：为峰高0.607倍处的色谱峰宽度的一半。倍处的色谱峰宽度的一半。值的大小值的大小表示组分流出的分散程度。表示组分流出的分散程度。（2）峰底宽）峰底宽(peak width，W)：通过色谱峰两侧的拐点作切线，在基线：通过色谱峰两侧的拐点作切线，在基线上的截距称为峰宽，或称基线宽度，以上的截距称为峰宽，或称基线宽度，以W或或Y表示。表示。（3）半峰宽）半峰宽(peak width at half height，W1/2或或Y1/2)：峰高一半处的峰：峰高一半处的峰宽称为半峰宽。宽称为半峰宽。3.色谱保留值：色谱保留值：色谱保留值是色谱定性分析的依据，它体现了各待测组分在色谱柱（色谱保留值是
10、色谱定性分析的依据，它体现了各待测组分在色谱柱（或板）上的滞留情况。或板）上的滞留情况。在固定相中溶解性能越好，或与固定相的吸附性越强的组分，在柱中在固定相中溶解性能越好，或与固定相的吸附性越强的组分，在柱中的滞留时间越长，或者说将组分带出色谱柱所需的流动相体积越大。所以的滞留时间越长，或者说将组分带出色谱柱所需的流动相体积越大。所以保留值可以用保留值可以用保留时间保留时间或相应的或相应的保留体积保留体积来描述。来描述。1)死时间死时间(dead time,to)2)保留时间保留时间(retention time,tR)3)调整保留时间调整保留时间(adjusted retention tim
11、e,tR)4.死体积死体积(dead volume,Vo)5.保留体积保留体积(retention volume,VR)6.调整保留体积调整保留体积(adjusted retention volume,VR)9.3 9.3 色谱分离的基本理论色谱分离的基本理论色谱分离中，决定相邻组分分离好坏的因素有两个：色谱分离中，决定相邻组分分离好坏的因素有两个：一是两组分的保留值之差一是两组分的保留值之差即组分在色谱柱内迁移速率的差异，它决定于两组分与固定即组分在色谱柱内迁移速率的差异，它决定于两组分与固定相、流动相之间相互作用的差异；相、流动相之间相互作用的差异；二是两组分的峰宽二是两组分的峰宽它反映了
12、组分区带在移动过程中的扩张程度，很大程度上取它反映了组分区带在移动过程中的扩张程度，很大程度上取决于色谱的分离条件。决于色谱的分离条件。组分的色谱保留特性是由组分在色谱系统中的热力学性质所决定的组分的色谱保留特性是由组分在色谱系统中的热力学性质所决定的。对于分配色谱而言，该热力学性质即为分配系数和容量因子。对于分配色谱而言，该热力学性质即为分配系数和容量因子。1.分配系数（分配系数（partition coefficient,K）在分配色谱中，固定相与流动相中的溶质分子处于动态平衡时，组分在在分配色谱中，固定相与流动相中的溶质分子处于动态平衡时，组分在两相间达到分配平衡，该组分在固定相两相间达
13、到分配平衡，该组分在固定相(S)中的浓度与在流动相中的浓度与在流动相(m)中的浓中的浓度之比为一个常数，称为分配系数，常表示为度之比为一个常数，称为分配系数，常表示为K，即，即9.3.1决定组分保留值的因素决定组分保留值的因素smCKC2.容量因子容量因子(capacity factor，常写作，常写作k)又称为分配比，即在平衡状态下，又称为分配比，即在平衡状态下，组分在固定相与流动相中的物质的量之比。若用组分在固定相与流动相中的物质的量之比。若用Vs和和Vm分别表示色谱柱分别表示色谱柱中固定相和流动相的体积，则有中固定相和流动相的体积，则有()sssmmmmssmc VVVKKcVVVnkn
14、3.相对保留值相对保留值(relative retention value，r)又称为选择性因子（又称为选择性因子（selectivity factor,），在相同操作条件下，后出），在相同操作条件下，后出峰的组分峰的组分2与先出峰的组分与先出峰的组分1的调整保留值之比：的调整保留值之比：称为两相的相比。不能被固定相保留的组分，如称为两相的相比。不能被固定相保留的组分，如GC中的空气、甲烷等，中的空气、甲烷等，ns=0，所以所以k=0，它们实际测得的保留时间即为柱子的死时间，它们实际测得的保留时间即为柱子的死时间to。k值相当于组分被值相当于组分被固定相滞留的时间和流动相通过系统所需时间的比值
15、，即固定相滞留的时间和流动相通过系统所需时间的比值，即 00000000(1)(1)RRRsRmRttVVtVkkVkKVttVVttt或(2)(2)22(1)(1)11RRRRtVkKrtVkK【例例9-1】一个气相色谱柱，已知固定相的保留体积一个气相色谱柱，已知固定相的保留体积Vs=14.1mL，载气流，载气流速为速为43.75mL/min。分离一个含有。分离一个含有ABC三组分的样品，测得组分的保留时三组分的样品，测得组分的保留时间分别为间分别为A=1.41min，B=2.67min，C=4.18min，空气为，空气为0.24min。试计算。试计算：（：（1）死体积（假定检测器及柱接头等
16、体积忽略不计）；（）死体积（假定检测器及柱接头等体积忽略不计）；（2）各组分的）各组分的调整保留时间和分配系数；（调整保留时间和分配系数；（3）相邻两组分的相对保留值）相邻两组分的相对保留值r。解解 （1）已知）已知Fo=43.75mL/min，在忽略检测器及柱接头等体积的情况，在忽略检测器及柱接头等体积的情况下下,则死体积则死体积Vo=toFo=0.2443.75=10.5mL。(2)由可分别计算出三组分的调整保留时间：由可分别计算出三组分的调整保留时间：1.410.241.17minARt 2.670.242.43minBRt 4.180.243.94minCRt，smVkVKmmRsos
17、VVtKVtVk1.1710.53.630.2414.1ARmAostVKtV2.4310.57.540.2414.1BRmBostVKtV3.9410.512.20.2414.1CRmCostVKtV21KrK7.5412.22.08,1.623.637.54CBABBCABKKrrKK 组分谱带在色谱柱内移动时，不可避免地会逐步组分谱带在色谱柱内移动时，不可避免地会逐步扩张，对相邻组分的分离带来不利影响。组分谱带的扩张，对相邻组分的分离带来不利影响。组分谱带的宽度反映了色谱柱作为一个分离器件的效能，即柱效宽度反映了色谱柱作为一个分离器件的效能，即柱效（column efficiency）。
18、如何定量地描述柱效，柱效又）。如何定量地描述柱效，柱效又与哪些因素有关，需要从色谱理论上解释。与哪些因素有关，需要从色谱理论上解释。通过色谱实验证明，在两组分的分离过程中，分通过色谱实验证明，在两组分的分离过程中，分离效果和峰宽度及出峰时间相关。能够解释这一现象离效果和峰宽度及出峰时间相关。能够解释这一现象的理论首推塔板理论。的理论首推塔板理论。9.3.2谱带扩张与柱效谱带扩张与柱效1.塔板理论塔板理论基本假设：基本假设：（1）色谱柱是由一系列连续、等距的水平塔板组）色谱柱是由一系列连续、等距的水平塔板组成。在柱子的每层塔板内部，组分能够在流动相和成。在柱子的每层塔板内部，组分能够在流动相和固
19、定相两相中很快地达到平衡。固定相两相中很快地达到平衡。（2）流动相通过色谱柱时呈间歇式前进运动状态，）流动相通过色谱柱时呈间歇式前进运动状态，每次前进一个塔板体积。每次前进一个塔板体积。（3）样品和流动相同时加在第）样品和流动相同时加在第1个塔板上，且样品个塔板上，且样品垂直于前进方向的扩散（即纵向扩散）可以忽略。垂直于前进方向的扩散（即纵向扩散）可以忽略。（4）分配系数在各塔板上是常数。）分配系数在各塔板上是常数。这些假设实际上是把组分在两相间的连续转移过程，这些假设实际上是把组分在两相间的连续转移过程，分解为间歇地在单个塔板中的分配平衡过程。也就分解为间歇地在单个塔板中的分配平衡过程。也就
20、是用分离过程的分解动作来说明色谱过程。是用分离过程的分解动作来说明色谱过程。理论塔板数理论塔板数n与色谱峰峰宽的实验参数有以下关系：与色谱峰峰宽的实验参数有以下关系：塔板理论中，将每层塔板的高度称为理论塔板高度塔板理论中，将每层塔板的高度称为理论塔板高度(height equivalent to a theoretical plate)，用，用H表示。若设色谱柱的柱长表示。若设色谱柱的柱长为为L，理论塔板数（，理论塔板数（number of theoretical plates）为）为n，则：，则：HLn 在在tR一定时，色谱峰越窄，即一定时，色谱峰越窄，即W或或W l/2越小，则理论塔板数越
21、小，则理论塔板数n越大、理论塔板高度越大、理论塔板高度H越小，柱的分离效率也就越高。因此，越小，柱的分离效率也就越高。因此，一般把理论塔板数一般把理论塔板数n和理论塔板高度和理论塔板高度H称为柱效指标。称为柱效指标。2)(16WtnR21 25.54()RtnW若扣除死时间的影响，用若扣除死时间的影响，用tR代替代替tR计算出的理论塔板计算出的理论塔板数称为有效塔板数（数称为有效塔板数（n有效有效），所得的理论塔板高度），所得的理论塔板高度称为有效塔板高度（称为有效塔板高度（H有效有效）。）。221/25.54()16()RRbttnYWLHn有效有效有效例例9-2】已知气相色谱柱长已知气相色
22、谱柱长2.0m，固定相为白色硅藻土上涂渍的，固定相为白色硅藻土上涂渍的5%OV-17，柱温柱温125，载气（，载气（N2）流速为）流速为30mL/min，记录纸速为，记录纸速为2.0cm/min。测定。测定萘的保留时间为萘的保留时间为2.35min，半峰宽为，半峰宽为0.20cm，求理论塔板数和理论塔板高度。，求理论塔板数和理论塔板高度。若用甲烷测得死时间为若用甲烷测得死时间为0.20min，求有效塔板数和有效塔板高度。，求有效塔板数和有效塔板高度。解：解：利用公式，将半峰宽单位换算成时间利用公式，将半峰宽单位换算成时间min，得，得21 25.54()RtnW22.35minn=5.54()
23、=30590.20cm2.0cm/minL2000mmH=0.65(mm)n3059扣除死时间的影响，扣除死时间的影响，21 25.54()RtnW有效22Ro1 2t-t2.35min-0.20minn=5.54()=5.54()=25610.20cmW2.0cm/min有效L2000mmH=0.78(mm)n2561有效有效2.速率理论速率理论Martin最先指出，气相色谱过程中溶质分子的纵向扩散是引最先指出，气相色谱过程中溶质分子的纵向扩散是引起色谱区带扩张的主要因素。起色谱区带扩张的主要因素。1956年，荷兰学者年，荷兰学者Van Deemter等在塔板理论基础上，研究了影响塔板高度等
24、在塔板理论基础上，研究了影响塔板高度H的因素，通过色的因素，通过色谱实验证实，在低流速时增加流速，峰变锐，即柱效增加；谱实验证实，在低流速时增加流速，峰变锐，即柱效增加；当超过一定流速时峰变钝，柱效降低。用塔板高度当超过一定流速时峰变钝，柱效降低。用塔板高度H对载气流对载气流速速u作图为二次曲线，曲线最低点对应的塔板高度最小，柱效作图为二次曲线，曲线最低点对应的塔板高度最小，柱效最高，此时的流速称为最佳流速（最高，此时的流速称为最佳流速（u最佳），由此导出了速率最佳），由此导出了速率方程式（或称范第姆特方程）：方程式（或称范第姆特方程）：BHACuu式中：式中：H为塔板高度（为塔板高度（cm）
25、；）；A，B，C为与填充色谱柱有关为与填充色谱柱有关的实验参数。的实验参数。A、B/u和和Cu三项是对塔板高度的具体影响因三项是对塔板高度的具体影响因素，分别称为涡流扩散项、分子扩散项和传质阻力项，由公素，分别称为涡流扩散项、分子扩散项和传质阻力项，由公式可知，只有这三项较小的情况下，式可知，只有这三项较小的情况下，H才可能小，峰形才可才可能小，峰形才可能变窄，柱效才会提高；能变窄，柱效才会提高；u为载气线速度。为载气线速度。BHACuu1)涡流扩散涡流扩散(eddy diffusion)项项 A A=2dp dp：固定相的平均颗粒直径；：固定相的平均颗粒直径；：固定相的填充不均匀因子：固定相
26、的填充不均匀因子固定相颗粒越小固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，填充的越均匀，A，H，柱效，柱效n。表。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。2)分子扩散分子扩散(longitudinal diffusion)项项B/u B=2 D：弯曲因子，填充柱色谱，弯曲因子，填充柱色谱，1。D：试样组分分子在气相中的扩散系数（：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1）。由于柱中存在着浓度）。由于柱中存在着浓度差，产生纵向扩散：差，产生纵向扩散：a.扩散导致色谱峰变宽，扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差。，分离变差。b.分子扩散
27、项与流速有关，流速分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，滞留时间，扩散，扩散 c.扩散系数：扩散系数：D ；Mr，B值值1rM3)传质阻力传质阻力(mass transfer)项项 Cu流动相的流速越快，传质阻力项流动相的流速越快，传质阻力项Cu就越大，就越大，C称为传质阻力系数，为固定称为传质阻力系数，为固定相传质阻力系数相传质阻力系数(Cs)和流动相传质阻力系数和流动相传质阻力系数(Cm)之和，即之和，即C=Cs+Cm。Cm是指组分分子从流动相移向固定相表面进行两相之间的质量交换时所是指组分分子从流动相移向固定相表面进行两相之间的质量交换时所受到的阻力。受到的阻力。Cs指组分分子由流动相进
28、入固定相后，扩散到固定相内部，达到分配平指组分分子由流动相进入固定相后，扩散到固定相内部，达到分配平衡后，又回到界面，再逸出，被流动相带走这一过程中所受到的阻力。衡后，又回到界面，再逸出，被流动相带走这一过程中所受到的阻力。4)4)载气流速与柱效载气流速与柱效-最佳流速最佳流速载气流速高时：载气流速高时：传质阻力项是影响柱效的主要因素，传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速流速，柱效，柱效,右图曲线的右边。右图曲线的右边。H-u曲线与最佳流速：曲线与最佳流速：由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，
29、即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度以塔板高度H对应载气流速对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。载气流速低时：载气流速低时：分子扩散项成为影响柱效的主要因素分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速，流速 ，柱效，柱效 ，右图曲线的坐边。，右图曲线的坐边。22BBBC=0CCdHuduuu 最佳2HABCBCABC最小其中其中A、B、C的数值可以通过在一定色谱条件下测得三种不同的数值可以通过在一定色谱条件下测得三种不同流速对应的流速对应的H值，建立一个三元一次方
30、程求得，进而求出值，建立一个三元一次方程求得，进而求出H最小最小和和u最小最小9.3.3分离度分离度多组分物质分离的好坏可以用分离度多组分物质分离的好坏可以用分离度R来衡量。一般两个组分在色谱图来衡量。一般两个组分在色谱图上必须要分开有足够的距离，两色谱峰互不重叠（上必须要分开有足够的距离，两色谱峰互不重叠（tR要有足够差别），要有足够差别），峰形较窄，才可以认为是彼此分开。峰形较窄，才可以认为是彼此分开。1.分离度分离度(resolution，R)是衡量两个相邻色谱峰的分离程度的指标，定义为相邻两色谱峰的保留是衡量两个相邻色谱峰的分离程度的指标，定义为相邻两色谱峰的保留值之差与两峰宽度平均值
31、之比，即：值之差与两峰宽度平均值之比，即：2121()2RRttRWW式中：式中：tR1、tR2为相邻两个组分的保留时间，为相邻两个组分的保留时间，Wl、W2为对应的峰宽。通过为对应的峰宽。通过测量保留时间和峰宽即可求算相邻峰的分离度。测量保留时间和峰宽即可求算相邻峰的分离度。2.影响分离度的因素影响分离度的因素将分离度（将分离度（R）与柱效、选择性联系起来，可推出色谱分离）与柱效、选择性联系起来，可推出色谱分离的基本方程式。对于难分离的物质对，它们的保留值相差很的基本方程式。对于难分离的物质对，它们的保留值相差很小，可以认为小，可以认为W1=W2=W，k1 k2 k，可推出，可推出:1141
32、4nkn rrRrkr有效22222116()()116()1krnRrkrnRr 有效 首先相对保留值首先相对保留值r对于相邻组分的分离度有对于相邻组分的分离度有重要的影响。例如，当重要的影响。例如，当r由由1.10下降到下降到1.05或或1.02时，要保证时，要保证R=1.5的分离效果，的分离效果，n需要相需要相应增加应增加3.64倍与倍与21.5倍。由于两组分的倍。由于两组分的r值与值与固定相、流动相的性质直接相关，说明根据固定相、流动相的性质直接相关，说明根据难分离物质对的化学性质，合理选择固定相难分离物质对的化学性质，合理选择固定相和流动相，增大和流动相，增大r值，对于提高难分离物质
33、值，对于提高难分离物质对的分离度可起到事半功倍的作用。对的分离度可起到事半功倍的作用。其次分离度其次分离度R与理论塔板数与理论塔板数n的平方成正比。的平方成正比。增加柱长增加柱长L固然能增加理论塔板数固然能增加理论塔板数n，但柱，但柱子过长，分离时间延长，柱阻也增加，峰子过长，分离时间延长，柱阻也增加，峰变宽，不利于分离。在不改变塔板高度变宽，不利于分离。在不改变塔板高度(H)的条件下，可得到分离度与柱长的关系为的条件下，可得到分离度与柱长的关系为:21212()R RL L最后增大容量因子最后增大容量因子k值能改善分离情况，但同时分离时间将增长。值能改善分离情况，但同时分离时间将增长。k值超
34、值超过过10以后，再增大对分离度的影响不显著，但对分离时间的影响依然明显。以后，再增大对分离度的影响不显著，但对分离时间的影响依然明显。所以，所以，k值一般取值一般取210。【例例9-5】在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和秒和100秒，秒，要达到完全分离，即要达到完全分离，即R=1.5。计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔。计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为板高度为0.1 cm，柱长是多少？，柱长是多少？21trt1001.1885r 解：解：由由2216()1rnRr有效221.1816 1.5()15471.181n有效L
35、nH有效有效15470.1154.7155Lcmcmcm有效9.49.4色谱定性和定量的方法色谱定性和定量的方法9.4.1 色谱定性方法色谱定性方法1.保留值对比定性保留值对比定性1）已知物对照法）已知物对照法 同一种物质在同一根色谱柱上，在相同一种物质在同一根色谱柱上，在相同的操作条件下保留值相同。适用于同的操作条件下保留值相同。适用于有对照品的已知组分的鉴定。先将试有对照品的已知组分的鉴定。先将试样注入色谱柱，记录色谱图。再将适样注入色谱柱，记录色谱图。再将适量的已知对照物质加入试样中，按相量的已知对照物质加入试样中，按相同方法测定。对比加入对照物前后的同方法测定。对比加入对照物前后的色谱
36、图，若加入后某色谱峰相对增高，色谱图，若加入后某色谱峰相对增高，则该色谱组分与对照物质可能为同一则该色谱组分与对照物质可能为同一物质。物质。2)利用保留指数定性利用保留指数定性 又称又称KovatsKovats指数（指数（），是一种重现性较好的定性参数。），是一种重现性较好的定性参数。测定方法：测定方法：将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以乘以100100（如正己烷的保留指数为（如正己烷的保留指数为600600）。）。其它物质的保留指数（其它物质的保留指数（I IX X）是通过选定两个相邻的正构烷烃）是通过选定两个相邻的正
37、构烷烃，其分别具有，其分别具有Z Z和和Z Z1 1个碳原子。被测物质个碳原子。被测物质X X的调整保留时间的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：保留指数计算方法保留指数计算方法()()(11)()()()lglg100lglgR iR zR zR ZiR zRR ZtttttIZtt【例例9-7】乙酸正定酯在阿匹松乙酸正定酯在阿匹松L柱上，柱温柱上，柱温100时，以记录纸长度代表时，以记录纸长度代表调整保留时间。正庚烷的调整保留时间为调整保留时间。正庚烷的调整保留时间为174.0s，正辛烷的调整保留时间，正辛烷的调整保留时间
38、为为373.4s，乙酸丁酯的调整保留时间为，乙酸丁酯的调整保留时间为310.0s，求乙酸丁酯的保留指数，求乙酸丁酯的保留指数I。解解：依题意可知，：依题意可知，XZ=174.0mm，XZ+1=373.4mm，Xi=310.0mm 1lglg100lglgiZZZXXIZXXlg310.0lg174.01007775.6lg373.4lg174.0I2.利用化学反应定性利用化学反应定性把由色谱柱流出的待鉴定组分通入官能团分类试剂中，观察是否发生反应把由色谱柱流出的待鉴定组分通入官能团分类试剂中，观察是否发生反应（显色或产生沉淀），可判断该组分的官能团或类别。例如，要鉴定组分（显色或产生沉淀），可
39、判断该组分的官能团或类别。例如，要鉴定组分是否为醛、酮，可将该色谱馏分通入是否为醛、酮，可将该色谱馏分通入2,4-二硝基苯肼试剂中，如产生橙色沉二硝基苯肼试剂中，如产生橙色沉淀，则说明组分为淀，则说明组分为18碳原子的醛或酮。碳原子的醛或酮。3.与其他仪器联用定性与其他仪器联用定性目前常用目前常用“在线在线”(on-line)联用方式，用毛细管色谱柱与傅里叶红外仪联用联用方式，用毛细管色谱柱与傅里叶红外仪联用(GC-FTIR)或与质谱联用或与质谱联用(GC-MS)。这些联用仪器和技术已完全成熟，成。这些联用仪器和技术已完全成熟，成为现代仪器分析的重要工具。其中毛细管气相色谱与质谱联用已成为药物
40、为现代仪器分析的重要工具。其中毛细管气相色谱与质谱联用已成为药物分析的重要手段，如挥发油的成分分析、部分治疗药物的鉴别和定量、违分析的重要手段，如挥发油的成分分析、部分治疗药物的鉴别和定量、违禁药物的检测、药物代谢动力学的研究等。禁药物的检测、药物代谢动力学的研究等。SampleSampleGas Chromatograph(GC)Gas Chromatograph(GC)Mass Spectrometer(MS)SeparationIdentification mfAmfh或9.4.2 定量分析法定量分析法 被测组分的色谱峰面积或峰高与待测组分的浓度成正比是色谱法定量的依被测组分的色谱峰面积
41、或峰高与待测组分的浓度成正比是色谱法定量的依据。现今的色谱仪色谱数据处理系统在记录色谱图的同时，可存储、打印出据。现今的色谱仪色谱数据处理系统在记录色谱图的同时，可存储、打印出各种参数和数据处理的结果，如峰高、峰面积、保留时间等。各种参数和数据处理的结果，如峰高、峰面积、保留时间等。1.定量校正因子定量校正因子相同量的不同组分在同一检测器中的响应值并不同，即相同量的不同组分产相同量的不同组分在同一检测器中的响应值并不同，即相同量的不同组分产生不同值的峰高或峰面积，而且同一组分在不同的检测器上也会有不同的响生不同值的峰高或峰面积，而且同一组分在不同的检测器上也会有不同的响应值。为使色谱峰的峰面积
42、或峰高与组分含量间建立起确定的数量关系，就应值。为使色谱峰的峰面积或峰高与组分含量间建立起确定的数量关系，就需要知道二者之间的比例系数，该比例系数就是定量校正因子需要知道二者之间的比例系数，该比例系数就是定量校正因子f。在相同色。在相同色谱条件下，某一组分产生的色谱响应值（峰面积谱条件下，某一组分产生的色谱响应值（峰面积A或峰高或峰高h），与这一组分的），与这一组分的质量质量m成正比：成正比：f 为该组分在检测器上的响应斜率，是一个比例常数，称为该组分的绝对校为该组分在检测器上的响应斜率，是一个比例常数，称为该组分的绝对校正因子。其物理含义是单位峰面积或单位峰高所代表的组分的量（质量、物正因子
43、。其物理含义是单位峰面积或单位峰高所代表的组分的量（质量、物质的量或体积）。质的量或体积）。由于各化合物的绝对校正因子不易测定，它随实验条件而变化，不同实验室由于各化合物的绝对校正因子不易测定，它随实验条件而变化，不同实验室之间所测得的绝对校正因子往往不具有可比性，因而很少使用。实际工作中之间所测得的绝对校正因子往往不具有可比性，因而很少使用。实际工作中普遍采用相对校正因子，它定义为某组分普遍采用相对校正因子，它定义为某组分i与所选定的基准物质与所选定的基准物质s的绝对校正的绝对校正因子之比，以因子之比，以 f 表示，即表示，即:在实践中，相对校正因子往往简称为校正因子。在实践中，相对校正因子
44、往往简称为校正因子。iisisiissisifm Amhfffm Am h 或 【例例9-8】测定以苯为基准物质的甲苯、乙苯、邻二甲苯的峰高的校正测定以苯为基准物质的甲苯、乙苯、邻二甲苯的峰高的校正因子，实验数据如下：因子，实验数据如下：苯苯甲甲 苯苯乙乙 苯苯邻二甲苯邻二甲苯质量质量/g0.59670.54780.61200.6680峰高峰高/mm180.184.445.249.0iisisissmhh mfmhmh180.1 0.59671.00180.1 0.5967siish mfhm苯180.1 0.54781.9684.4 0.5967siish mfhm甲苯180.1 0.612
45、04.0945.2 0.5967siish mfhm乙苯180.1 0.66804.1149.0 0.5967siish mfhm二甲苯2.定量计算方法定量计算方法色谱定量计算方法常用的有三种：归一化法、外标法和内标法。下面只色谱定量计算方法常用的有三种：归一化法、外标法和内标法。下面只以峰面积、校正因子为定量参数进行讨论，其他的可以类推。以峰面积、校正因子为定量参数进行讨论，其他的可以类推。1)面积归一化法面积归一化法(area normalization method)试样中的各组分均能流出色谱柱，并在检测器上出现相应的色谱峰，试样中的各组分均能流出色谱柱，并在检测器上出现相应的色谱峰，可
46、采用归一化法定量。即是将试样中所有组分含量之和定为可采用归一化法定量。即是将试样中所有组分含量之和定为100%，来计算被测组分的含量。来计算被测组分的含量。假设试样中有假设试样中有n个组分，每个组分的质量分别为个组分，每个组分的质量分别为m1，m2，m3，mn，各组分质量总和为，各组分质量总和为m，则组分，则组分i的质量分数为的质量分数为11(%)100%100%iiiinniiiiimA fwmA f2)外标法外标法(external standard method)用待测组分的纯品作标准品（也称为对照品），比较在相同条件下对照用待测组分的纯品作标准品（也称为对照品），比较在相同条件下对照品
47、与样品中待测组分的峰面积或峰高，来进行定量的方法称为外标法。品与样品中待测组分的峰面积或峰高，来进行定量的方法称为外标法。外标法中最常用的是标准曲线法外标法中最常用的是标准曲线法(calibration by standards)，即将被测组，即将被测组分的标准品配制不同浓度的系列标准溶液，同时配制一个样品溶液。分的标准品配制不同浓度的系列标准溶液，同时配制一个样品溶液。在完全相同条件下，以相同体积准确进样得到各自的色谱图。以标准在完全相同条件下，以相同体积准确进样得到各自的色谱图。以标准溶液的浓度对其峰面积（或峰高）绘制标准曲线，或按最小二乘法进溶液的浓度对其峰面积（或峰高）绘制标准曲线，或
48、按最小二乘法进行线性回归得出线性回归方程，最后根据待测组分的信号，从标准曲行线性回归得出线性回归方程，最后根据待测组分的信号，从标准曲线查得或从线性回归方程计算出浓度。线查得或从线性回归方程计算出浓度。3)内标法内标法(internal standard method)内标法是在样品中加入一种纯物质作内标物，根据内标物与待测组分的内标法是在样品中加入一种纯物质作内标物，根据内标物与待测组分的定量校正因子、内标物与样品的质量和相应的峰面积，求出样品中待测定量校正因子、内标物与样品的质量和相应的峰面积，求出样品中待测组分的含量的一种方法。组分的含量的一种方法。精密称取质量为精密称取质量为m的样品，再加入质量为的样品，再加入质量为ms的内标物，溶解、混匀、进的内标物，溶解、混匀、进样。测得待测组分样。测得待测组分i的峰面积的峰面积Ai、内标物的峰面积、内标物的峰面积As，则样品中所含组分，则样品中所含组分i的质量的质量mi与内标物的质量与内标物的质量ms有下述关系：有下述关系：iiiiisisssssmA fA f mmmA fA f则待测组分在样品中的含量则待测组分在样品中的含量wi(%)为为:(%)100%iiisissmA f mwmA f m
