1、血浆循环血浆循环MicroRNAMicroRNA提取检测及其在冠心病的表达提取检测及其在冠心病的表达 郑志伟郑志伟 劳海燕劳海燕 余细勇余细勇 林秋雄林秋雄 朱杰宁朱杰宁 王玲王玲 孙硕孙硕 陈纪言陈纪言 钟诗龙钟诗龙 广东省人民医院医学研究中心，广东省心血管病研究所广东省人民医院医学研究中心，广东省心血管病研究所讲述目录讲述目录简述血浆循环简述血浆循环miRNA提取检测提取检测的方法的方法采用前述建立的方法，在采用前述建立的方法，在25例冠例冠心病患者和心病患者和30例健康对照中检测例健康对照中检测miRNA的表达情况。的表达情况。在细胞实验进一步探讨在细胞实验进一步探讨miRNA的作用机制
2、的作用机制 研究背景MicroRNAMicroRNA是生物体内长度约为是生物体内长度约为20202323个核苷酸的非编个核苷酸的非编码小码小RNARNA，通过与靶，通过与靶mRNAmRNA的互补配对而在转录后水的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行调控。平上对基因的表达进行调控。最近研究发现血液循环中也存在最近研究发现血液循环中也存在miRNAmiRNA，有希望作为，有希望作为疾病无创诊断或者疾病预后的生物标志物。疾病无创诊断或者疾病预后的生物标志物。Solexa Whole Genome SequencingSolexa Whole Genome Sequencing miRNAs(21
3、-23nt)were most abundant sequences in serum RNAsChen et al.2008 Cell Res.miRNA差异？差异？疾病疾病预后，转归预后，转归血浆循环血浆循环miRNA的表达的表达 预测预测?生物标记物？生物标记物？我们的设想我们的设想我们的研究工作我们的研究工作研究血浆中存在的循环研究血浆中存在的循环miRNA，建立其提取检，建立其提取检测的方法，并且检测血测的方法，并且检测血浆浆miRNA在冠心病人中在冠心病人中的表达情况，寻找疾病的表达情况，寻找疾病发生发展或者影响预后发生发展或者影响预后的生物标记物。的生物标记物。血浆血浆miRNA
4、提取检测基本流程提取检测基本流程血浆循环血浆循环miRNAmiRNA提取方法提取方法血浆血浆miRNA 的提取的提取第四步第四步晾干，加无晾干，加无RNAase水进行溶解，检测浓水进行溶解，检测浓度，保存度，保存第一步第一步ProteinK 消化，消化，Trizol LS和氯仿对和氯仿对血浆进行提取血浆进行提取第三步第三步离心，取得离心，取得RNA沉淀沉淀，70%乙醇洗涤乙醇洗涤第二步第二步异丙醇和核酸共沉淀异丙醇和核酸共沉淀剂对前述水相进行沉剂对前述水相进行沉淀淀血浆循环血浆循环miRNA的检测原理的检测原理实验结果实验结果二、二、miRNA提取方法学的考察（一）提取方法学的考察（一）1、采
5、用外源合成的cel-miRNA-39检验提取方法的提取效率：2、has-miR-16的累加实验的累加实验采用加入外源合成的采用加入外源合成的has-miR-16 mimics，比较提取方法的有效性。，比较提取方法的有效性。二、二、miRNA提取方法学的考察（二）提取方法学的考察（二）内源内源BmimicsA三、检测三、检测miRNA在两组人群中的表达差异在两组人群中的表达差异Coronary artery heart disease（CHD）25例例Healthy contron30例例3.1、研究的一般资料、研究的一般资料年龄年龄3.2、研究的一般资料、研究的一般资料性别性别P=0.1553
6、.3、血浆循环、血浆循环has-miR-126的表达量的表达量3.4、血浆循环、血浆循环has-miR-16的表达量的表达量四、进一步的机制探讨四、进一步的机制探讨1、培养人心肌细胞、培养人心肌细胞AC16，进，进行行miR-126 inhibitor 的转染，的转染，Q-PCR检测检测miR-126和和血管内血管内皮生长因子皮生长因子(VEGF)的表达。的表达。2、Tunel 检测心肌细胞凋检测心肌细胞凋 亡情况。亡情况。四、四、Q-PCR检测检测VEGF的表达结果的表达结果VEGF有促进血管生成的作有促进血管生成的作用，在冠心病患者中用，在冠心病患者中miR-126的表达下降，可能跟的表达
7、下降，可能跟VEGF调节血管生成有关，调节血管生成有关，其具体的机制还有待进一其具体的机制还有待进一步的研究。步的研究。三、三、TUNEL凋亡结果分析（一）凋亡结果分析（一）图图 1 AC16 细胞细胞-正常正常A：细胞形态；：细胞形态；B：Tunel；C:DAPI 染色（核定位）；染色（核定位）；D：B 和和 C 的重的重叠图叠图三、三、TUNEL凋亡结果分析（二）凋亡结果分析（二）图图 3 AC16 细胞转染细胞转染 mir-126 inhibitorA：细胞形态；：细胞形态；B：Tunel；C:DAPI 染色（核定染色（核定位）；位）；D：B 和和 C 的重叠图的重叠图四、本文结论：结论
8、：采用结论：采用Trizol LSTrizol LS提取血浆总提取血浆总RNARNA的方法可行，的方法可行，miRNAmiRNA检测方法的特异性和灵敏性较好，血浆检测方法的特异性和灵敏性较好，血浆hsa-miR-126hsa-miR-126表达表达的差异可能在冠心病的发展过程中发挥调节作用，其作用的差异可能在冠心病的发展过程中发挥调节作用，其作用机制可能与影响血管生成和心肌保护作用有关，具体的机机制可能与影响血管生成和心肌保护作用有关，具体的机制还有待于进一步的研究。制还有待于进一步的研究。感谢各位关心和指导实验的老师，感谢广东省人民医院提供的的实验平台和临床标本收集的支持！谢谢各位专家和老师的指导！致谢致谢
