1、LOGO分子生物学分子生物学李松李松2023-1-91质粒质粒2用于基因克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有合适的筛选标记 具有较高的外源DNA的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 质粒的基本特征质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色
2、体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是DNA型的型的绝大多数的天然绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即即cccDNA（covalently closed circular DNA）质粒质粒DNA的分子量范围：的分子量范围：1-300 kb质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制质粒质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系上的复制子结构决定了质
3、粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：两大复制类型：严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒 1-3 拷贝拷贝 stringent plasmid松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒 10-60 拷贝拷贝 stringent plasmid质粒的不相容性质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质以大肠杆菌的质粒为例：以大
4、肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容粒组成不相容性群。粒组成不相容性群。质粒的不相容性：分子机制质粒的不相容性：分子机制两种含有两种含有相似复制子结构相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有两种含有不
5、同复制子结构不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。细胞内。其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。质粒的可转移性质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一
6、个细胞（接合作用），如另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等；质粒等；如如Col、R的其它成员；的其它成员；非接合型质粒非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒在接合型质粒的存在和协助下，也能发生的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由转移，这个过程由 bom 和和mob 基因决定基因决定携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记野生型的质粒野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必
7、需的附加性状，包括：使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义质粒的构建质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人
8、工构建。多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC101 8.8 kb 拷贝数拷贝数 5 四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因 TcrColE1 6.5 kb 拷贝数拷贝数 20-30 大肠杆菌内毒素标记基因大肠杆菌内毒素标记基因 E1RSF2124 ColE1衍生质粒衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因氨苄青霉素抗性标记基因 Apr人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因突变拷贝数控制
9、基因 拷贝数拷贝数1000-3000 扩增基因扩增基因低拷贝质粒低拷贝质粒 来自来自pSC101 拷贝数小于拷贝数小于10 表达某些毒性基因表达某些毒性基因温敏质粒温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒整合质粒 装有整合促进基因及位点装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合便于外源基因的整合穿梭质粒穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆便于基因克隆表达质粒表达质粒 装有强化外源基因表达的
10、转录、翻译、纯化的元件装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒探针质粒 装有报告基因装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选便于启动子等元件的克隆筛选重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制松弛型复制 pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR322：氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数 50-100/cell用于基因克隆用于基因克隆 pUC18/19：拷贝数拷贝数 2000-3000/cell用于基因克隆和测序用于基因克
11、隆和测序 装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZBamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII质粒质粒表达型质粒载体的结构表达型质粒载体的结构172023-1-9常用克隆载体常用克隆载体类型：类型：T-T-载体，载体，pUCpUC系列，系列，pMDpMD系列，一些系列，一些 表达型质粒表达型质粒特点：功能单位特点：功能单位小小，拷贝数，拷贝数多
12、多182023-1-9 T-vector192023-1-9Blue white Screen202023-1-9212023-1-9常用表达系统常用表达系统原核细胞：大肠杆菌、芽孢杆菌等原核细胞：大肠杆菌、芽孢杆菌等真核细胞：丝状真菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等真核细胞：丝状真菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等质粒质粒DNA的分离纯化的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 质粒质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法碱溶法 质粒质粒DNA纯度底、快速、操作简
13、便纯度底、快速、操作简便沸水浴法沸水浴法 质粒质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间碱溶法：碱溶法：用含有用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加加NaOH和和SDS的混合溶液，去膜释放内含物的混合溶液，去膜释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体色体DNA及大部分蛋白质及大部分蛋白质 离心取上清液，用苯酚离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无用无DNase的的RNase去除残余的去除残余的RNA cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA
