1、化学发光和生物发光化学发光和生物发光 I一、引言一、引言公元前亚里士多德公元前亚里士多德 真菌类和死鱼的发光真菌类和死鱼的发光1668年，罗伯特年，罗伯特.波义耳波义耳 BL需要氧参与需要氧参与19世纪世纪80年代末，年代末，Dubois命名荧光虫素酶和荧光虫素命名荧光虫素酶和荧光虫素1877年，年，Radziszewski发现洛汾碱的发现洛汾碱的CL1928年，年，Albrecht发现发现luminol的的CL1935年，光泽精的年，光泽精的CL1950年，商品化仪器出现年，商品化仪器出现 化学发光是化学反应的反应化学发光是化学反应的反应物或生成物（或荧光物质）物或生成物（或荧光物质）吸收了
2、反应释放的化学能后吸收了反应释放的化学能后所产生的光辐射。根据化学所产生的光辐射。根据化学发光反应在某一时刻的发光发光反应在某一时刻的发光强度或发光总量来确定反应强度或发光总量来确定反应中相应组分含量的分析方法中相应组分含量的分析方法叫化学发光分析法。叫化学发光分析法。Sea PansyRenilla luciferase1cm1cm1cm1mm二、常见的溶液化学发光和生物发光体系二、常见的溶液化学发光和生物发光体系鲁米诺化学发光反应体系鲁米诺化学发光反应体系过氧化草酸盐反应体系过氧化草酸盐反应体系光泽精化学发光反应体系光泽精化学发光反应体系吖啶酯类吖啶酯类化学发光反应体系化学发光反应体系1,
3、2-二氧杂环丁烷类化学发光体系二氧杂环丁烷类化学发光体系高锰酸钾化学发光反应体系高锰酸钾化学发光反应体系Ce(IV)化学发光反应体系化学发光反应体系钌钌(II)-联吡啶配合物化学发光反应体系联吡啶配合物化学发光反应体系铁氰化钾直接氧化反应体系铁氰化钾直接氧化反应体系电化学发光反应体系电化学发光反应体系荧火虫素（荧火虫素（luciferine)-荧火虫素酶（荧火虫素酶（luciferase-磷酸三腺苷（磷酸三腺苷（ATP）体系体系 NADPH：FMN氧化还原酶和细菌荧光素酶催化的发光反应氧化还原酶和细菌荧光素酶催化的发光反应其他化学发光反应体系其他化学发光反应体系1.鲁米诺化学发光反应体系鲁米诺
4、化学发光反应体系鲁米诺化学发光反应机理鲁米诺化学发光反应机理NHNHOONH2ONNOOOHNH2a-hydroxyperoxyde-N2NH2OOOHO*NH2OOOHO+lightLuminolOONHNHXNHNHOOXONHNHON4 X=NH2(isoluminol)5 X=(C2H5)2N6 X=7 X=(CH3)2N8 X=(C2H5)2N9 X=N10鲁米诺衍生物鲁米诺衍生物环状酰肼结构是发光的关键NHOONNH2CH3322NHNOONHCH2NHCONHNH111213NNNOOOONHHHRR12152CONHNHHOSNNS1422OONHNHNHC52H N()CH4
5、16OOHOHOOHNHAcONNHNH217OONHNHXNHNHOOXONHNHON4 X=NH2(isoluminol)5 X=(C2H5)2N6 X=7 X=(CH3)2N8 X=(C2H5)2N9 X=N10鲁米诺反应体系的应用鲁米诺反应体系的应用 金属离子或酶的催化作用金属离子或酶的催化作用测定金属离子或酶测定金属离子或酶 H2O2或其他氧化剂或其他氧化剂 测定过氧化氢或氧化剂测定过氧化氢或氧化剂 某些分子的增强、抑制作用某些分子的增强、抑制作用测定此类分子测定此类分子 偶合反应偶合反应间接测定无机或有机化合物间接测定无机或有机化合物 通过标记化合物通过标记化合物测定此类物质或免疫
6、分析测定此类物质或免疫分析2.过氧化草酸酯类反应体系过氧化草酸酯类反应体系OClClClCCOO O ClClCl典型过氧化草酸酯分子结构式典型过氧化草酸酯分子结构式双(2,4,6-三氯苯基)草酸盐 过氧化草酸酯体系发光机理过氧化草酸酯体系发光机理ArOCCOArOOH2O2+OOCCOO+2ArOHOOCCOO+FOOCCOOFOOCCOOFF*+2CO2F*F+light 双双(2,4-二硝基苯基二硝基苯基)草酸酯草酸酯-过氧化氢过氧化氢-红红荧烯，发光总量子产率荧烯，发光总量子产率23%。为效率最。为效率最高的化学发光反应。高的化学发光反应。溶解度小，不稳定，浓度猝灭效应强溶解度小，不稳
7、定，浓度猝灭效应强TCPO-CL在药物分析中的应用待测物CL 体系LOD or LR安非他明TCPOH2O2fmol苄达明TDPOH2O2双密达莫TDPOH2O2DOP10 amol叔胺类TCPOH2O2500 pg仲胺类DNPOH2O2100 fg伯胺类TCPOH2O25 fmol咔唑类化合物TCPOH2O20.50.7 ng美托洛尔TDPOH2O20.8 ng/mL硫醇类TCPOH2O27113 fmol雌二醇TCPOH2O250 pg前列腺素 E2TCPOH2O250 fmol透明质酸TDPOH2O2无机磷TCPOH2O2perylene50 mol/L甲状腺素TCPOH2O210 pm
8、ol/L乌本苷DNPOH2O2220 pmol/L胆固醇TCPOH2O2400 ng苯异丙胺TCPOH2O20.001 pmol3.光泽精化学发光反应体系光泽精化学发光反应体系 光泽精化学发光反应光泽精化学发光反应NNC HC H33NO3-3NO光泽精的分子结构式光泽精的分子结构式NCH33HCN3HCN3HCN3HCN3HCN3HCNCOORCOCl+COOOH+HOCOOHOOOOH OOROOO+H O2 2OHHO2OH2222324*h4.吖啶酯类化学发光反应体系吖啶酯类化学发光反应体系OOOPO Na32OCH3O-OOOCH3OO-OCH3OO-OCH3OAP-HPO42-+*
9、+光AMPPDAMP-DOOOPO Na32OCH3O-OOOCH3OO-OCH3OO-OCH3OAP-HPO42-+*+光AMPPDAMP-D5、1,2-二氧杂环丁烷类化学发光体系二氧杂环丁烷类化学发光体系6、酸性高锰酸钾化学发光体系、酸性高锰酸钾化学发光体系 高锰酸钾高锰酸钾-吗啡吗啡 高锰酸钾高锰酸钾-连二亚硫酸钠体系连二亚硫酸钠体系 KMnO4(H+)-甲氧苄啶甲氧苄啶-硫代硫酸钠化学发光反硫代硫酸钠化学发光反应体系应体系 KMnO4(H+)-EC-RNA化学发光体系化学发光体系 高锰酸钾高锰酸钾-草酸草酸高锰酸钾高锰酸钾-亚硫酸盐体系发光机理亚硫酸盐体系发光机理最佳最佳pH=2.5H
10、SO3+MnO4 HSO3+MnO42 2HSO3 S2O62 +2H+S2O62 SO42 +SO2*HSO3为为SO2水解生成，水解生成，pH=2.5时比例最大时比例最大高锰酸钾TCs CL体系测定盐酸四环素、盐酸土霉素待测物CL 体系LOD吗啡MnO40.7 pg吗啡MnO450 ng氯普唑仑MnO4163 ng丁丙诺啡MnO40.5 pmol儿茶酚胺MnO4pmol磺胺甲基异噁唑MnO4？苯佐卡因MnO430ng/mL布他卡因20ng/mLbutoform30 ng/mL普鲁卡因40 ng/mL丁卡因3 ng/mL可待因8 pmol海洛因？高锰酸钾 CL体系的应用 过氧化氢药物氧化还原
11、化学发光体系测定核黄素、VB1、四环素、土霉素、金霉素等 7.过氧化氢直接氧化化学发光体系8.Ce(IV)化学发光反应体系化学发光反应体系1、Ce(IV)SO32体系体系lightanalytesanalytesCe(III)analytesanalytesCe(III)SOCe(III)SOCe(IV)*24*23 喹诺酮类化合物（氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星等）的FIACL测定 2、Ce(IV)Ru(bpy)32+CL体系 利用此体系测定测定丙酮酸、Vc、巴比妥酸、酒石酸等Ru(bpy)32+Ce(IV)Ru(bpy)33+Ce(III)Org+Ce(IV)Org-Ce(IV)快
12、反应Org-Ce(IV)Org*+Ce(III)慢反应Ru(bpy)33+Org*Ru(bpy)32+*+PRu(bpy)32+*Ru(bpy)32+h3、Ce(IV)直接氧化药物产生化学发光 利用此体系测定一系列药物，如奎宁、奎尼丁、辛可宁、萘普生、卡托普利、非那西汀、青霉胺、安乃近、VK3等。9.钌钌(II)-联吡啶配合物化学发光反应体系联吡啶配合物化学发光反应体系lightRu(bpy)Ru(bpy)Ru(bpy)Ru(bpy)Ru(bpy)Ru(bpy)23*23*23333323Ru(bpy)33+药物氧化还原CL体系的应用待测物DL or LR肼苯哒嗪红无霉素内酰胺抗生素可待因8.
13、310-7 M鸦片碱1.010-7 M6巯嘌呤310-10 g/mL雷尼替丁氢氟噻嗪环噻嗪10.铁氰化钾直接氧化反应体系铁氰化钾直接氧化反应体系铁氰化钾铁氰化钾直接氧化直接氧化发光体系发光体系尿尿 酸酸伯胺、仲胺伯胺、仲胺马来酸麦角新碱马来酸麦角新碱芦芦 丁丁Vc酮酮 酸酸四环素四环素3,5-四氢醛甾酮四氢醛甾酮N-溴丁二酰亚胺（NBS）可以在碱性介质中氧化脲产生强的化学发光。H2NCONH2+H2O 2NH3+CO2 3NBS+2NH3+3OH-3NHS+N2*+3Br-+3H2O N2*+f N2+f*f*f+h12.电化学发光反应体系电化学发光反应体系 电化学发光分析是对电极施加一定的电
14、压进行电化学发光分析是对电极施加一定的电压进行电化学反应，反应的产物之间或与体系中某种电化学反应，反应的产物之间或与体系中某种组份进行反应产生化学发光，用光电倍增管等组份进行反应产生化学发光，用光电倍增管等光学仪器测量发光光谱和强度，从而对物质进光学仪器测量发光光谱和强度，从而对物质进行痕量分析的一种方法。行痕量分析的一种方法。12.1电致化学发光反应体系电致化学发光反应体系 ECL物质包括三联吡啶（或联吡嗪或林菲罗啉）物质包括三联吡啶（或联吡嗪或林菲罗啉）的钌、锇和铼类络合物、鲁米诺、吖啶酯等。的钌、锇和铼类络合物、鲁米诺、吖啶酯等。研究最多的还是钌研究最多的还是钌(II)-联吡啶的联吡啶的
15、ECL。e-电电极极e-Ru(bpy)32+Ru(bpy)33+Ru(bpy)33+Ru(bpy)32+还原剂还原剂氧化产物氧化产物Ru(bpy)3+Ru(bpy)32+Ru(bpy)32+*发光发光（620nm）Ru(bpy)32+和还原性分析物的和还原性分析物的ECL反应机理反应机理12.2 鲁米诺电化学发光体系鲁米诺电化学发光体系 在电极上所产生氧化性物质来氧化鲁米诺产生化学发光。在电极上施加一定的电压，从而使溶液中的溶解氧还原成H2O2，H2O2进一步反应产生一些具有强氧化性的氧自由基，这些活性氧与鲁米诺反应产生化学发光 鲁米诺直接接受电极通过的能量生成激发态或自由基离子，从而产生化学
16、发光。鲁米诺电化学发光体系在分析化学中应用主要分以下四类：（1）测定H2O2，或通过偶合反应测定生物活性物质，如葡萄糖、乳酸等。（2）基于金属离子对鲁米诺电化学发光反应的催化作用，测定金属离子,，如Co2+、Cu2+、Ni2+。（3）基于一些有机物对鲁米诺电化学发光体系的增敏或抑制作用测定这些有机物，如异烟肼、肾上腺素、没食子酸。（4）利用不同的电极材料，测定鲁米诺或鲁米诺所标记的物质。12.3 电位溶出化学发光反应体系电位溶出化学发光反应体系Sam pleVabPM TFECW astePum p1RILight-tightPum p2ElectrolyteC arrierstreamWCO
17、 ut特点：1.高灵敏度和高选择性 2.结合了两种方法的优点，克服各自的缺点 3.从原理上说，所有能用电化学方法富集且能用CL检测的物质都可用此法测定。电化学富集数据完善，CL检测体系很多。此方法有很好应用前景。12.4电生试剂化学发光反应体系电生试剂化学发光反应体系 电生试剂化学发光分析电生试剂化学发光分析 Co()+quinine(Red)Co()+quinine(OX)*Quinine(OX)*quinine(OX)+h(540mm)Mn3+HSO3-HSO3 +Mn2+2HSO3 S2O62-+2H+S2O62-SO42-+SO2*SO2*+quinine quinine*+SO2 q
18、uinine*quinine+h quinine+h (450 nm)(450 nm)Mn3+pyruvate +O2 Mn2+1O2 +product 1O2 +1O2 2O2 +h (640nm)abPumpSampleVEJH2CDWasteFPCFig.1MInletOutletWCMFig.213、荧 光 素（、荧 光 素（l uci feri ne)-荧 光 素 酶荧 光 素 酶（luciferase-磷酸三腺苷（磷酸三腺苷（ATP）体系体系检测食品中总菌数NC14、NADPH：FMN氧化还原酶和细菌荧光氧化还原酶和细菌荧光素酶催化的发光反应素酶催化的发光反应)P(NADFMNHH
19、FMNH)P(NAD2FMN:H)P(NAD氧化还原酶hvOHRCOOHFMNRCHOOFMNH222细菌荧光素酶hvOHRCOOHFMNRCHOOFMNH222细菌荧光素酶15、基于纳米材料的CL 纳米TiO2 乙醇，丙酮Anal.Chem.2002,74,120-124含氯有机物Anal.Chem.2002,74,6279-6284A Catalytic Nanomaterial-Based Optical Chemo-Sensor ArrayJ.Am.Chem.Soc.2006,128,14420-14421纳米金催化化学发光Anal.Chem.,2005,77,3324-3329量子点 HgTe,H2O2,KMnO416、微波引发的金属增强化学发光J.Am.Chem.Soc.2006,128,13372-13373
