1、 在发酵工业中，工业生产水平主要由三个在发酵工业中，工业生产水平主要由三个要素决定，即：要素决定，即：1、生产菌种性能生产菌种性能 2、发酵及提取工艺条件、发酵及提取工艺条件 3、生产设备生产设备 其中，生产菌种是最重要的因素，是发酵其中，生产菌种是最重要的因素，是发酵的灵魂。的灵魂。2.1 发酵工业常用菌种发酵工业常用菌种2.1.1 发酵工业对菌种的要求发酵工业对菌种的要求（1）菌种不能是病源菌）菌种不能是病源菌（2）发酵周期短，生产能力强）发酵周期短，生产能力强（3）发酵过程中不产或少产与目标产物性质）发酵过程中不产或少产与目标产物性质相似的副产物相似的副产物（4）原料来源广价格低廉，菌种
2、能高效地将）原料来源广价格低廉，菌种能高效地将原料转化成产品原料转化成产品（5）对需添加的前体有耐受能力，且不能将）对需添加的前体有耐受能力，且不能将前体作为一般碳源利用前体作为一般碳源利用6菌种纯，遗传性能稳定，不易变异退化菌种纯，遗传性能稳定，不易变异退化7可以在易于控制的条件下发酵可以在易于控制的条件下发酵2.1.2 发酵工业常用菌种发酵工业常用菌种（1）细菌）细菌 自然界分布最广、数量最多的一类微自然界分布最广、数量最多的一类微生物，单细胞原核生物。生物，单细胞原核生物。工业常用的有枯草杆菌、短杆菌工业常用的有枯草杆菌、短杆菌 还常用作基因工程载体的宿主细胞，用于构还常用作基因工程载体
3、的宿主细胞，用于构建基因工程菌来生产外源物质。建基因工程菌来生产外源物质。（2）酵母菌）酵母菌 单细胞真核生物，主要分布于含糖较多的单细胞真核生物，主要分布于含糖较多的酸性环境中酸性环境中如水果、蔬菜、花蜜和植物叶子上，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶子上，以及果园土壤中。以及果园土壤中。常用的有啤酒酵母、酒精酵母。常用的有啤酒酵母、酒精酵母。酿酒酵母酿酒酵母假丝酵母假丝酵母红酵母红酵母（3）霉菌）霉菌 是一群在营养基质上形成绒毛状、网状、是一群在营养基质上形成绒毛状、网状、絮状菌丝真菌的通称。分布于偏酸性环境中，絮状菌丝真菌的通称。分布于偏酸性环境中，常用的有根霉、毛霉、青霉等常用的有根霉、毛霉、
4、青霉等 根霉根霉曲霉曲霉青霉青霉（4）放线菌）放线菌 因其菌落呈放射状而得名。属原核微生物因其菌落呈放射状而得名。属原核微生物类群。类群。分布于有机质丰富的微碱性环境中，分布于有机质丰富的微碱性环境中，大大多腐生，少数寄生多腐生，少数寄生。最大价值在于能生产多。最大价值在于能生产多种抗生素，从微生物中发现的抗生素有种抗生素，从微生物中发现的抗生素有60%以以上的是来自于放线菌。上的是来自于放线菌。常用的有链霉菌属、小单孢属等。常用的有链霉菌属、小单孢属等。（5）其它类）其它类 药用真菌：如灵芝、茯苓、冬虫夏草等药用真菌：如灵芝、茯苓、冬虫夏草等 藻类：如螺旋藻藻类：如螺旋藻符合发酵工业要求的菌
5、种可从如下途径获得：符合发酵工业要求的菌种可从如下途径获得：1 从自然界分离筛选从自然界分离筛选 2 从菌种保存机构直接购买所需的菌株从菌种保存机构直接购买所需的菌株 3 从生产过程中发酵水平高的批号中重新进从生产过程中发酵水平高的批号中重新进行分筛行分筛 获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工程工业生产的第一环节。程工业生产的第一环节。菌种分离菌种分离：将混杂着各种微生物的样品按照实：将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株特性采取迅速、准确、有效的方际需要和菌株特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需的微法对它们进行分离、筛选，进
6、而得到所需的微生物的过程。生物的过程。从自然界分离筛选菌种的一般步骤：从自然界分离筛选菌种的一般步骤：样品采集样品采集 样品预处理样品预处理 富集培养富集培养 菌种分离菌种分离 初筛、复筛初筛、复筛 性能鉴定性能鉴定 2.2.1 样品采集样品采集 总原则是总原则是：（1）样品来源越广，获得新菌种样品来源越广，获得新菌种的可能性越大；的可能性越大；（2）要了解目标产物的性质和可能产目标产）要了解目标产物的性质和可能产目标产物的微生物种类及其生理特征。物的微生物种类及其生理特征。了解微生物的代谢规律。如初级代谢基本了解微生物的代谢规律。如初级代谢基本相同，但通常丝状菌及产芽孢细菌才能进相同，但通常
7、丝状菌及产芽孢细菌才能进行次级代谢。行次级代谢。考虑微生物的生理特征。如营养类型、生考虑微生物的生理特征。如营养类型、生长环境等。长环境等。1 土样选择土样选择 如酵母菌如酵母菌 果园果园 产蛋白酶菌产蛋白酶菌 鱼、肉加工厂鱼、肉加工厂 高温酶产生菌高温酶产生菌 火山或温泉火山或温泉 耐压菌耐压菌 油井或海洋深处油井或海洋深处2采样深度采样深度 离地表离地表5-25cm处较好。处较好。3季节条件季节条件 避免雨季，一般以秋季最理想。避免雨季，一般以秋季最理想。4采样方法采样方法 用无菌器具按规范取样，记录采样地用无菌器具按规范取样，记录采样地点、时间、环境情况等以备考证。点、时间、环境情况等以
8、备考证。2.2.2 样品的预处理样品的预处理 预处理可提高菌种的分离效率，常使预处理可提高菌种的分离效率，常使用的方法有：用的方法有：（1）物理方法：物理方法：热处理：常用来减少样品中的细菌数。热处理：常用来减少样品中的细菌数。膜过滤和离心法：用来浓缩水中的微生膜过滤和离心法：用来浓缩水中的微生 物细胞。物细胞。（2）化学方法：化学方法：在培养基中添加某些化学成分来增加在培养基中添加某些化学成分来增加特定微生物数量。特定微生物数量。（3）诱饵法：）诱饵法：将一些固体物质加到待分离的土壤或将一些固体物质加到待分离的土壤或水中做成诱饵富集目的菌。水中做成诱饵富集目的菌。2.2.3 富集培养富集培养
9、 利用不同微生物生长繁殖对环境和营利用不同微生物生长繁殖对环境和营养的要求不同，投其所好取其所抗，使目养的要求不同，投其所好取其所抗，使目的菌成为人工环境下的优势菌。的菌成为人工环境下的优势菌。（1）控制培养基的营养成分：如唯一碳源）控制培养基的营养成分：如唯一碳源（2）控制培养条件：如）控制培养条件：如T、DO、pH、添加、添加抑制剂等抑制剂等2.2.4 菌种分离菌种分离 常用的纯培养分离方法有：常用的纯培养分离方法有：（1）平板划线法）平板划线法 （2）稀释分离法）稀释分离法（3）简单平板分离法）简单平板分离法 （4）涂布分离法）涂布分离法（5）毛细管分离法）毛细管分离法 （6）小滴分离法
10、）小滴分离法 通常某些菌种在分离时就可进行筛选，一通常某些菌种在分离时就可进行筛选，一般这些菌在平板上培养时，其产物可与指示般这些菌在平板上培养时，其产物可与指示剂、显色剂或底物等反应而直接定性地鉴定。剂、显色剂或底物等反应而直接定性地鉴定。常用的平板快速检测法有：常用的平板快速检测法有：（1）透明圈法）透明圈法 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；在平板培养基中加入溶解性较差的底物，在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊；使培养基混浊；能分解底物的微生物便会在菌落周围产生能分解底物的微生物便
11、会在菌落周围产生透明圈，圈与菌落直径比的大小初步反应菌株透明圈，圈与菌落直径比的大小初步反应菌株利用底物的能力。利用底物的能力。土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后制备成菌悬液涂布在物；然后制备成菌悬液涂布在pH8-9的琼脂培的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面；碱性养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生一透明圈。产生一透明圈。例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌 分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用分离某种产生有机酸
12、的菌株时，也通常采用透明圈法初筛透明圈法初筛 在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈成清晰的透明圈 透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比。上圈的大小之间并不完全成正比。但作为初筛的手段是有意义的但作为初筛的手段是有意义的 对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂
13、，使目的微在底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来。出来。（2）变色圈法）变色圈法 用含用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果刚果红溶液染色红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。出现绛红色水解圈。如如筛选果胶酶产生菌筛选果胶酶产生菌甘油三丁酸酯为底物甘油三丁酸酯为底物罗丹明罗丹明B为指示剂为指示剂荧光圈荧光圈又如又如 分离解脂微生
14、物分离解脂微生物豆油作底物豆油作底物中性红（红黄中性红（红黄.6.88.0.）指示指示菌落周围呈红色圈菌落周围呈红色圈 （3）生长圈法）生长圈法 通常用于分离筛选氨基酸、通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌核苷酸和维生素的产生菌 指示菌（工具菌）是一些相对应的营养指示菌（工具菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株缺陷型菌株 将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈成一个混浊的生长圈如
15、如 嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌菌（4 4）抑菌圈法）抑菌圈法 常用于抗生素产生菌的分常用于抗生素产生菌的分离筛选离筛选若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈菌不能生长的抑菌圈 指示菌采用抗生素的敏感菌指示菌采用抗生素的敏感菌2.2.5 菌种的初筛和复筛菌种的初筛和复筛 目的是选择
16、产物合成能力较高的菌株。目的是选择产物合成能力较高的菌株。并不是所有菌种都能利用平板快速检测法并不是所有菌种都能利用平板快速检测法鉴定，因此就要使用常规的生产性能鉴定，鉴定，因此就要使用常规的生产性能鉴定，即初筛和复筛。即初筛和复筛。（1）初筛：以量多为原则）初筛：以量多为原则 （2）复筛：结合生产工艺条件）复筛：结合生产工艺条件2.3 性能鉴定性能鉴定 （1）确定菌种类型）确定菌种类型 （2）测定一系列生产指标，包括菌种毒性）测定一系列生产指标，包括菌种毒性试验和生产性能鉴定。试验和生产性能鉴定。常用的鉴定菌种的方法有：常用的鉴定菌种的方法有：（1）经典的分类鉴定法（细胞的形态和习性）经典的
17、分类鉴定法（细胞的形态和习性）（2）现代分类鉴定法（遗传型的鉴定、细胞化）现代分类鉴定法（遗传型的鉴定、细胞化学成分等）学成分等）（3）将菌种送到权威机构鉴定将菌种送到权威机构鉴定2.4 发酵工业菌种改良发酵工业菌种改良 2.4.1 菌种改良目的菌种改良目的 1 提高产物产量提高产物产量 2 提高产物纯度，减少副产物提高产物纯度，减少副产物 3 改良菌种性能，改善发酵过程改良菌种性能，改善发酵过程 4 改变生物合成途径，获得高新产品改变生物合成途径，获得高新产品2.4.2 菌种改良的方法菌种改良的方法1 自然选育自然选育 在生产过程中，不经过人工处理，利用微在生产过程中，不经过人工处理，利用微
18、生物的生物的自然突变自然突变而进行菌种筛选的过程。而进行菌种筛选的过程。引起自然突变的因素：引起自然突变的因素：（1）多因素低剂量的诱变效应）多因素低剂量的诱变效应（2）互变异构效应互变异构效应2、诱变育种、诱变育种 人工采用物理、化学和生物的方法促使微人工采用物理、化学和生物的方法促使微生物发生突变的育种手段。生物发生突变的育种手段。（1）选择出发菌株：）选择出发菌株：原则是要对诱变剂的敏原则是要对诱变剂的敏感性强，变异幅度大，产量高感性强，变异幅度大，产量高（2）同步培养：）同步培养：使生理状态一致使生理状态一致（3）制备单细胞或单孢子菌悬液：）制备单细胞或单孢子菌悬液：能均匀接能均匀接触
19、诱变剂触诱变剂（4）诱变处理：诱变处理：诱变剂种类、剂量大小、诱变剂种类、剂量大小、处理时间处理时间（5）筛选变异菌株：）筛选变异菌株：平板快速检测法平板快速检测法 形态变异的利用形态变异的利用 高通量筛选高通量筛选3、杂交育种、杂交育种 微生物杂交的本质是基因重组。微生物杂交的本质是基因重组。4、原生质体融合、原生质体融合 原生质体融合和杂交育种都是在细胞原生质体融合和杂交育种都是在细胞水平上的操作。原生质体融合可以在种间、水平上的操作。原生质体融合可以在种间、种内、属间发生。种内、属间发生。5、基因工程育种、基因工程育种2.5.1 菌种变异及退化机理菌种变异及退化机理一、菌种退化一、菌种退
20、化 指生产菌种或选育过程中筛选出来的较指生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良菌种，由于进行接种传代或保藏之后，优良菌种，由于进行接种传代或保藏之后，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象。完全丧失的现象。1、退化表现：、退化表现：2、退化原因：、退化原因：从量变到质变的逐步演变过程。从量变到质变的逐步演变过程。（1）基因突变：根本原因基因突变：根本原因（2）连续传代：直接原因连续传代：直接原因3、防止菌种退化的措施、防止菌种退化的措施（1）减少传代次数）减少传代次数（2）选择合适的培养条件）选择合适的培养条件（3）利用不易衰退的细胞传代）利用
21、不易衰退的细胞传代（4）采用有效的菌种保藏方法）采用有效的菌种保藏方法二、退化菌种的复壮二、退化菌种的复壮1、纯种分离法、纯种分离法2、淘汰退化的个体、淘汰退化的个体2.5.2 菌种保藏技术菌种保藏技术一、菌种保藏原理一、菌种保藏原理 采用低温、干燥、缺氧、缺营养等手段采用低温、干燥、缺氧、缺营养等手段使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。抑制的休眠状态。二、常用的菌种保藏方法二、常用的菌种保藏方法1、斜面低温保藏法（定期移植保藏法）、斜面低温保藏法（定期移植保藏法）方法：方法：原理：低温原理：低温适用范围：各类微生物适用范围：各类微生物保存期
22、限：不产芽孢的细菌每月需移植一次保存期限：不产芽孢的细菌每月需移植一次 产芽孢的细菌产芽孢的细菌3个月移植一次个月移植一次 酵母、霉菌、放线菌酵母、霉菌、放线菌36个月移植一次个月移植一次优点：方法简便，便于操作优点：方法简便，便于操作缺点：保存时间短，变异退化几率大缺点：保存时间短，变异退化几率大2、液体石蜡覆盖保藏法、液体石蜡覆盖保藏法方法：方法：原理：低温、缺氧原理：低温、缺氧适用范围：酵母、霉菌、放线菌和好气性细菌适用范围：酵母、霉菌、放线菌和好气性细菌保存期限：不同种类保存期限：不同种类M保藏期限不同，一般为保藏期限不同，一般为 110年年优点：方法简单，不需特殊设备，保藏期限相优点
23、：方法简单，不需特殊设备，保藏期限相 对较长对较长缺点：对厌氧菌及可分解利用烃类的缺点：对厌氧菌及可分解利用烃类的M保藏效保藏效 果较差果较差3、砂土管保藏法、砂土管保藏法方法：制备砂土管方法：制备砂土管 制备斜面培养物制备斜面培养物 制制 备菌悬液备菌悬液 干燥干燥 保藏保藏原理：低温、缺氧、干燥、缺营养原理：低温、缺氧、干燥、缺营养适用范围：耐干燥的菌种，如细菌芽孢、适用范围：耐干燥的菌种，如细菌芽孢、放线菌及真菌孢子放线菌及真菌孢子保存期限：几年保存期限：几年几十年几十年优点：简单易行，保藏时间长优点：简单易行，保藏时间长缺点：工作量大，费人力，对干燥敏感的缺点：工作量大，费人力，对干燥
24、敏感的 M不适用不适用4、冷冻干燥保藏法、冷冻干燥保藏法方法：选择和制备保护剂方法：选择和制备保护剂 准备菌种和菌准备菌种和菌 液液 预冻预冻 冷冻干燥冷冻干燥 保藏保藏原理：低温、缺氧、干燥原理：低温、缺氧、干燥适用范围：除某些不产孢子的丝状真菌，适用范围：除某些不产孢子的丝状真菌，其他各类其他各类M均可采用均可采用保存期限：一般可达保存期限：一般可达10年以上年以上优点：保存期长、变异小、适用范围广、优点：保存期长、变异小、适用范围广、存活率高，大多数专业保藏机构采用存活率高，大多数专业保藏机构采用缺点：需要专业设备，操作过程相对复杂缺点：需要专业设备，操作过程相对复杂5、液氮超低温保藏法
25、、液氮超低温保藏法方法：准备安瓿管方法：准备安瓿管 制备菌悬液制备菌悬液 分装和分装和 熔封安瓿管熔封安瓿管 冷冻冷冻 保藏保藏 复活复活原理：超低温，原理：超低温，M的所有代谢活动暂时停止的所有代谢活动暂时停止适用范围：除少数对低温损伤敏感的适用范围：除少数对低温损伤敏感的M外，外，该该 法适用各类法适用各类M保存期限：一般可达保存期限：一般可达415年年优点：保存期长、变异小、适用范围广优点：保存期长、变异小、适用范围广缺点：需特殊设备，液氮消耗多、操作费用缺点：需特殊设备，液氮消耗多、操作费用 高、操作复杂高、操作复杂第一章第一章1、什么是发酵？什么是发酵工程？、什么是发酵？什么是发酵工程？2、简述典型好气性发酵的一般工艺流程、简述典型好气性发酵的一般工艺流程第二章第二章1、菌种选育的目的是什么？具体有哪些方、菌种选育的目的是什么？具体有哪些方 法？法？2、菌种保藏的原理是什么？有哪些方法？、菌种保藏的原理是什么？有哪些方法？3、设计一个从自然界筛选高温淀粉酶生产菌、设计一个从自然界筛选高温淀粉酶生产菌的实验方案，详细说明主要步骤。的实验方案，详细说明主要步骤。
