1、第四篇第四篇 药物制备工艺药物制备工艺第十六章第十六章 微生物发酵制药工艺微生物发酵制药工艺第十六章第十六章 微生物发酵制药工艺微生物发酵制药工艺16.1 16.1 概述概述16.2 16.2 微生物生长与生产的关系微生物生长与生产的关系16.3 16.3 制药微生物菌种建立制药微生物菌种建立16.4 16.4 制药微生物培养基制备制药微生物培养基制备16.5 16.5 灭菌工艺灭菌工艺16.6 16.6 微生物发酵培养技术微生物发酵培养技术16.7 16.7 发酵工艺过程的检测与控制发酵工艺过程的检测与控制316.116.1概述概述1 发酵制药概念与简史发酵制药概念与简史o概念：利用制药微生
2、物的生长繁殖，通过发酵，代概念：利用制药微生物的生长繁殖，通过发酵，代谢合成药物，然后从中分离提取、精制纯化，获得谢合成药物，然后从中分离提取、精制纯化，获得药品的过程。药品的过程。o简史：对抗细菌性感染药物的需求驱动简史：对抗细菌性感染药物的需求驱动o19281928年，年，Fleming Fleming 发现青霉素；发现青霉素；o19401940，FloreyFlorey和和ChainChain分离得到青霉素和疗效；分离得到青霉素和疗效；o5050年代：搅拌发酵技术成功应用年代：搅拌发酵技术成功应用o6060年代：形成了成熟的抗生素发酵工业年代：形成了成熟的抗生素发酵工业概述概述4偶然发现
3、青霉素偶然发现青霉素1945年诺贝生理学医学奖：年诺贝生理学医学奖：青霉素的发现与抗感染疗效青霉素的发现与抗感染疗效概述概述Sir Alexander FlemingLondon University 1881-1955Ernst Boris ChainUniversity of Oxford 1906-1979 Sir Howard Walter Florey University of Oxford 1898-1968 52 2发酵概念与种类发酵概念与种类o概念：通过微生物培养而获得产物的过程（注意与生物化学中的发酵的区别）o种类：u基于产物青霉素发酵，维生素发酵，生产中常用u基于代谢初级
4、代谢产物发酵；次级代谢产物发酵；过程控制相似u基于供氧厌氧发酵；好氧发酵；反应器设计相似u基于原料葡萄糖发酵；淀粉发酵u基于反应生物转化发酵，生物氧化，生物加氢6发酵类型、产物与过程特点发酵类型、产物与过程特点类发酵产物，举例发酵产物，举例过程特点过程特点厌氧厌氧初级产物，初级产物，VB12产量高，合成途径明确产量高，合成途径明确好氧好氧初级产物，谷氨酸初级产物，谷氨酸产量较高，合成途径基本明确产量较高，合成途径基本明确好氧好氧次级产物，抗生素次级产物，抗生素产量较低，合成途径复杂产量较低，合成途径复杂好氧好氧酶类，蛋白酶酶类，蛋白酶菌体向外分泌的高分子产物菌体向外分泌的高分子产物生物转化生物
5、转化激素，氢化可的松激素，氢化可的松酶催化的简单反应，非菌体代谢产物酶催化的简单反应，非菌体代谢产物发酵制药发酵制药7o放线菌：链霉菌属为主，诺卡菌属较少，小单孢菌属极少o细菌：芽孢杆菌，棒杆菌，短杆菌o真菌：霉菌，酵母16.1.1 发酵制药微生物种类发酵制药微生物种类发酵制药发酵制药816.1.1 发酵制药产物种类发酵制药产物种类种类药物举例抗生素青霉素，链霉素，头孢菌素C氨基酸谷氨酸，赖氨酸，丝氨酸维生素VB2，VB12，VC核苷与核苷酸肌苷与肌苷酸，尿苷与尿苷酸酶类蛋白酶，链激酶，葡激酶酶抑制剂他汀类，伏立波糖免疫调节剂环孢菌素A，他克莫司发酵制药发酵制药概述概述916.1.216.1.
6、2发酵制药发酵制药基本工艺过程基本工艺过程菌种选育菌种选育种子制备种子制备发酵培养发酵培养分离纯化分离纯化产品产品10菌种选育菌种选育原料药原料药包装包装成品检验成品检验提炼工段提炼工段预处理预处理分离提取分离提取浓缩纯化浓缩纯化发酵工段发酵工段种子制备种子制备菌种活化菌种活化成品工段成品工段发酵控制发酵控制实验室、种子库实验室、种子库包装车间包装车间发酵车间发酵车间提炼车间提炼车间发酵制药过程工段岗位操作与车间流程关系发酵制药过程工段岗位操作与车间流程关系库存间库存间1116.2 微生物的生长与生产的关系微生物的生长与生产的关系微生物动力学研究微生物动力学研究微生物生长动力学微生物生长动力学
7、基质利用的动力学基质利用的动力学生长与生产关系的动力学模型生长与生产关系的动力学模型微生物发酵过程特征微生物发酵过程特征121、发酵动力学研究、发酵动力学研究概念：发酵动力学是研究发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律。包括生长动力学，基质消耗动力学，产物合成动力学。内容：发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率的相互关系，环境因素对三者的影响，以及影响其反应速度的条件。意义：确定最佳发酵工艺条件，建立工艺参数控制方案。模拟使生产控制达到最优化。13研究发酵动力学的步骤研究发酵动力学的步骤 o(1)测定发酵过程中的生物和理化参数变化。o(2)将参数变化和现象与发
8、酵代谢规律联系起来，找出它们之间的相互关系和变化规律。o(3)建立数学模型，描述参数随时间变化的关系。o(4)计算机在线控制，反复验证模型的可行性与适用范围。生长与生产的关系生长与生产的关系14已建立动力学模型的类型o机制模型：根据反应机制建立，几乎没有o现象模型：经验模型，目前大多数 定量描述发酵过程 反应主要影响因素细胞群体的动力学可用均衡生长的非结构模型简化。o发酵的反应过程与速度：r rS S（底物）（底物）X X（菌体）（菌体）P P（产物）（产物）发酵制药发酵制药152、微生物的生长动力学、微生物的生长动力学(1)(1)生长曲线：生物量或细胞数目随时间变化曲线。生长曲线：生物量或细
9、胞数目随时间变化曲线。意义：描述微生物从生长到自溶死亡的整个过程。意义：描述微生物从生长到自溶死亡的整个过程。生长速率生长速率r r：单位时间（单位时间（t t）内菌浓或质量（）内菌浓或质量（X X）变化）变化:比生长速率比生长速率：单位菌体浓度的生长速率单位菌体浓度的生长速率生长速率的标准化，菌体活力大小生长速率的标准化，菌体活力大小XdtdX1dtdXr 发酵制药发酵制药16(2)(2)菌体生物量与时间的关系是菌体生物量与时间的关系是S S形曲线。分为五个阶段形曲线。分为五个阶段时间t菌体浓度X延迟期指数期减速期静止期衰亡期延迟期：无生长指数期:减速期:静止期:衰亡期:dX/dt=-kd
10、X0dX/dt=(-kd)X=0dX/dt=XdX/dt=max X发酵制药发酵制药17(3)(3)温度对生长影响温度对生长影响酶反应速度随温度升高酶反应速度随温度升高而加快而加快酶反应以最大速率酶反应以最大速率进行进行蛋白质变性，细胞热裂蛋白质变性，细胞热裂解，细胞死亡解，细胞死亡膜凝固，无转运和吸膜凝固，无转运和吸收，无生长收，无生长菌种保存发酵温度18pH生物量pHpH值对菌体生长速率的影响与温度的影响类似，值对菌体生长速率的影响与温度的影响类似，在适宜的在适宜的pHpH值范围，生长速率最大值范围，生长速率最大(4)pH(4)pH值对生长影响值对生长影响发酵制药发酵制药193、基质利用的
11、动力学的因素、基质利用的动力学的因素（1）基质浓度对菌体生长的影响）基质浓度对菌体生长的影响菌体生长过程，基质逐渐被吸收利用，浓度呈现降低。菌体生长过程，基质逐渐被吸收利用，浓度呈现降低。dtdSrSXdtdSqS1基质浓度的减少可用基质消耗速率和比消耗速率表示：基质浓度的减少可用基质消耗速率和比消耗速率表示：发酵时间(t)基质浓度基质浓度20（2 2）限制性基质浓度与比生长速率的关系）限制性基质浓度与比生长速率的关系maxmax：各种基质对菌体的生长效率，不同基质之间比较。：各种基质对菌体的生长效率，不同基质之间比较。K Ks s：为：为饱和常数，菌体对基质亲和力，饱和常数，菌体对基质亲和力
12、，K Ks s越小，亲和力越大，利用越好。越小，亲和力越大，利用越好。S S很低，浓度与比生长很低，浓度与比生长速率成正比。速率成正比。S S很高，菌体以最大比很高，菌体以最大比生长速率进行生长。生长速率进行生长。Ks基质浓度基质浓度比生长速率比生长速率maxmax1/21/2maxmaxMonodMonod方程：方程：=maxmax S S/(/(K Ks s+S S)注意：与酶反应动力学MM方程的区别。21米氏方程：酶促反应速度00.20.40.60.811.202004006008001000SVVmVm/2KmmaxsSvvKS22Monod方程的参数求解(双倒数法)：将Monod方程
13、取倒数可得：111smmSKsmmSKS或：测定不同限制性基质浓度下的比生长速度回归分析计算出Monod方程的两个参数。maxsKSS发酵制药发酵制药23例：在一定条件下培养大肠杆菌，测得如下数据：S(mg/l)6 33 64 153 221(h-1)0.06 0.24 0.43 0.66 0.70求大肠杆菌的max，Ks?解：将数据整理：S/160 167.5 192.5 231.8 311.3 S 6 33 64 153 22124max，1.11(h-1);Ks97.6 mg/L01002000100200300400/ssm10.9m108.4sksmmSKS254、真实的生物学过程模
14、拟与举例tL：延滞期；tmax:最大比速率期26一种芽孢杆菌的生长曲线一种芽孢杆菌的生长曲线27Vero细胞在细胞在16血清中生长曲线血清中生长曲线285 5、生长与生产关系的模型、生长与生产关系的模型oGaden把生长与生产分为三种：把生长与生产分为三种：oI型：生长与生产偶联型型：生长与生产偶联型oII型：生长与生产半偶联型型：生长与生产半偶联型oIIIIII型：生长与生产非偶联型型：生长与生产非偶联型29时间比速率生物量或产量生物量或产量I I型：菌体生长与生产偶联型型：菌体生长与生产偶联型菌体生长与产物生成直接关联，菌体生长与产物生成直接关联，生长期与生产期是一致生长期与生产期是一致菌
15、体生长、基质消耗、能源利用菌体生长、基质消耗、能源利用和产物生成动力学曲线几乎平行，和产物生成动力学曲线几乎平行，变化趋势同步，最大值出现的时变化趋势同步，最大值出现的时间接近间接近.产物：初级代谢的直接产物，如产物：初级代谢的直接产物，如有机酸，乳酸、醋酸等。有机酸，乳酸、醋酸等。XYdtdXYdtdPrPPp/ppYqYpdP/dX发酵制药发酵制药Rp为产物生成率；Yp为产物生成的得率系数；Qp为比速率；P为产物生成量30介于偶联和非偶联模型之间，介于偶联和非偶联模型之间，产物生成与基质消耗、能量产物生成与基质消耗、能量利用之间存在间接关系。利用之间存在间接关系。生长期期内，无产物生成，生
16、长期期内，无产物生成，生长中后期生成大量的产物生长中后期生成大量的产物产物：氨基酸的发酵，一部产物：氨基酸的发酵，一部分组成型表达的蛋白质药物分组成型表达的蛋白质药物 XXdtdPrppqII型：生长与生产半偶联型型：生长与生产半偶联型发酵制药发酵制药时间比速率生物量或产量Rp为产物生成率；Yp为产物生成的得率系数；Qp为比速率；P为产物生成量，c为常数31生长期与生产期在独立的两个生长期与生产期在独立的两个阶段阶段先形成物质消耗和生长高峰先形成物质消耗和生长高峰后菌体静止期，产物大量生成，后菌体静止期，产物大量生成，出现产物高峰。出现产物高峰。抗生素等次级代谢产物抗生素等次级代谢产物诱导型基
17、因工程菌的生产诱导型基因工程菌的生产XdtdPrppqIIIIII型：生长与产物生成非偶联型型：生长与产物生成非偶联型发酵制药发酵制药时间比速率生物量或产量326 6、微生物发酵基本过程特征（批式）、微生物发酵基本过程特征（批式）发酵后期或菌体自溶期发酵后期或菌体自溶期发酵中期或产物合成（生产）期发酵中期或产物合成（生产）期发酵前期或菌体生长期：发酵前期或菌体生长期：菌体生长与产物生成的特征，三个阶段菌体生长与产物生成的特征，三个阶段33发酵前期特征发酵前期特征o时间：生长期，包括延滞期、对数期和减速期。时间：生长期，包括延滞期、对数期和减速期。o代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗，减少代谢特
18、征：碳源、氮源等基质不断消耗，减少o生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。o溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。opHpH变化：先升后降先氨基酸作为碳源，释放出氨，变化：先升后降先氨基酸作为碳源，释放出氨，而后氨被利用。先降后升先用糖作为碳源，释放出而后氨被利用。先降后升先用糖作为碳源，释放出丙酮酸等有机酸，后又被利用。丙酮酸等有机酸，后又被利用。发酵制药发酵制药34发酵中期特征发酵中期特征o时间：生产期，以次级代谢产物或目标产物的生物时间：生产期，以次级代谢产物或目标产物的生物合成为主的一段
19、时间，主要静止期。合成为主的一段时间，主要静止期。o菌体生长：恒定，不增加菌体数目菌体生长：恒定，不增加菌体数目o呼吸强度：无明显变化呼吸强度：无明显变化o产物量：逐渐增加，生产速率加快，直至最大高峰，产物量：逐渐增加，生产速率加快，直至最大高峰，随后合成能力衰退。随后合成能力衰退。o对外界变化敏感：容易影响代谢过程，从而影响整对外界变化敏感：容易影响代谢过程，从而影响整个发酵进程。个发酵进程。发酵制药发酵制药35发酵后期特征发酵后期特征o菌体：衰老，细胞开始自溶的一段时间菌体：衰老，细胞开始自溶的一段时间o产物合成能力：衰退，生产速率减慢。产物合成能力：衰退，生产速率减慢。opHpH：上升，
20、氨基氮增加，。：上升，氨基氮增加，。o发酵：必须结束，否则产物被破坏。发酵：必须结束，否则产物被破坏。o菌体自溶给过滤和提取等带来困难。菌体自溶给过滤和提取等带来困难。36小结小结微生物生长动力学：生长速率与比生长速率微生物生长动力学：生长速率与比生长速率基质利用动力学：基质消耗、基质利用动力学：基质消耗、MonodMonod方程方程生长与生产之间动力学模型生长与生产之间动力学模型:偶联、非偶联、偶联、非偶联、半偶联型半偶联型微生物发酵过程特征：前、中、后期微生物发酵过程特征：前、中、后期发酵制药发酵制药3716.3 16.3 制药微菌种的建立制药微菌种的建立o16.3.1 新药生产菌种的选育
21、新药生产菌种的选育o16.3.2 菌种保藏菌种保藏o16.3.3 菌种库建立与质量控制菌种库建立与质量控制 38制药生产对菌种的要求制药生产对菌种的要求o1.遗传稳定性：能长期繁殖，不易变异和退化。纯种，无杂菌及噬菌体。o2.易生长性：生长旺盛、迅速；o4.容易培养性：条件易控，利用价廉易得的原料。o3.抗污染性：自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。o4.经济性：发酵周期短，产量高，良好经济能力。o5.突变敏感性：对各种诱变较敏感，提高的潜力大。菌种选育的目的：改善菌种的特性，使提高产量，改进质量，降低成本，改革工艺，方便管理及综合利用3916.3.1.1 自然分离自然分离o目的：出发菌的获取目
22、的：出发菌的获取o样品的采集：大陆表层土壤，海洋水体样品的采集：大陆表层土壤，海洋水体o预处理：根据分离目的和微生物的特性。预处理：根据分离目的和微生物的特性。温度；化学处理；离心、膜过滤温度；化学处理；离心、膜过滤o培养基：选择性，营养和培养基：选择性，营养和pH；添加抑制剂。；添加抑制剂。o分离方法：分离方法：（1）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲液）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲液（2）滤膜法：细菌在膜上，放线菌进入培养基。）滤膜法：细菌在膜上，放线菌进入培养基。o培养条件：温度。放线菌：培养条件：温度。放线菌：2530，3237，4550；716天至天至1月。月。40药物的筛选药物的筛选
23、o琼脂扩散法琼脂扩散法活性测定：活性测定：非致病菌为对象，筛选生物活性物质。非致病菌为对象，筛选生物活性物质。耐药和超敏菌种。耐药和超敏菌种。HPLCHPLC、LCLCMSMS等，分析鉴定活性物质。等，分析鉴定活性物质。o靶向筛选靶向筛选o高通量筛选高通量筛选o高内涵筛选高内涵筛选41微生物药物与菌种的筛选流程微生物药物与菌种的筛选流程样品采集样品采集微生物分离微生物分离培养培养筛选鉴定筛选鉴定筛选方法学建立筛选方法学建立阳性结果阳性结果化合物分离化合物分离纯化鉴定纯化鉴定前药新前药新化合物化合物新新药药研研究究与与开开发发菌种鉴定与保藏菌种鉴定与保藏生产出发菌生产出发菌4216.3.1.2
24、生产选育生产选育o概念：不经过人工诱变处理，根据菌种的自概念：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。然突变而进行的菌种筛选过程。o应用应用：（1 1）菌种的提纯复壮。（菌种的提纯复壮。（2 2）防止）防止退化，稳定生产水平。退化，稳定生产水平。1 1年年1 1次。次。o过程过程菌菌种种单孢单孢子子单菌落单菌落测活测活平板平板分离分离优良优良菌株菌株效率低（效率低（16E5E8），增产幅度小），增产幅度小4316.3.1.3 诱变育种诱变育种o概念：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种发概念：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种发生变异，筛选优良个体，淘汰劣质个体。生变异，筛选
25、优良个体，淘汰劣质个体。o物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。o化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。o生物类：噬菌体，转座子。生物类：噬菌体，转座子。v特点：快速，简单，效益大。特点：快速，简单，效益大。v缺点：无定向性，大量筛选。缺点：无定向性，大量筛选。44诱变方案设计诱变方案设计o出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。o诱变剂的使用：交叉使用多种，合理组合。中诱变剂的使用：交叉使用多种，合理组合。中等剂量（等剂量（8080致死率）。致死率）。o选择压：施加一定的选择压，获
26、得耐药菌株。选择压：施加一定的选择压，获得耐药菌株。措施：添加抗生素，提高前体浓度，增加产物措施：添加抗生素，提高前体浓度，增加产物浓度。浓度。45诱变育种流程诱变育种流程出发菌种出发菌种单孢子悬液单孢子悬液稀释涂板稀释涂板单菌落初筛单菌落初筛高产菌株高产菌株诱变处理诱变处理稳定性稳定性特性特性放大放大中试中试复筛复筛投入生产投入生产4616.3.1.4 原生质体融合育种原生质体融合育种o概念概念通过化学或物理学的方法，使两个不同种类的通过化学或物理学的方法，使两个不同种类的体细胞融合在一起，形成杂合细胞，产生兼具体细胞融合在一起，形成杂合细胞，产生兼具两个亲本遗传性状的新细胞。两个亲本遗传性
27、状的新细胞。特点：有一定的定向性，效果显著。特点：有一定的定向性，效果显著。47d.d.筛选，鉴定筛选，鉴定e.e.高产菌株高产菌株a.a.原生质体制备：原生质体制备：用去壁酶处理将微生用去壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成物细胞壁除去，制成原生质体。原生质体。操作过程操作过程hybrid cell c.细胞壁再生细胞壁再生b.b.原生质体融合：原生质体融合：异核体或重组子异核体或重组子菌株菌株1 1菌株菌株2 2去细胞壁去细胞壁原生质体原生质体1原生质体原生质体2高渗，高渗，PEGPEG处理处理杂合原生质体杂合原生质体48概念：操作对象为单染色体组成的基因组，以原生质概念：操作对象为单染色体组
28、成的基因组，以原生质体融合技术为基础，使基因组整体发生重组形成候选体融合技术为基础，使基因组整体发生重组形成候选突变库，经过筛选得到生产途径和表型改进的菌种，突变库，经过筛选得到生产途径和表型改进的菌种，即经济适用的菌种。即经济适用的菌种。特点：短时、快速，定向特点：短时、快速，定向应用：效果很显著应用：效果很显著16.3.1.516.3.1.5基因组基因组shufflingshuffling49基因组Shuffling过程o突变：随机突变获得单个性状优良的菌株突变：随机突变获得单个性状优良的菌株o重组：多个菌株的原生质体混合、融合、再生，重组：多个菌株的原生质体混合、融合、再生，形成第一个融
29、合库（形成第一个融合库（F1F1）o筛选鉴定：获得有益突变积累的新性状菌株筛选鉴定：获得有益突变积累的新性状菌株o多轮循环：再次融合，得到融合库多轮循环：再次融合，得到融合库F2F2、F3F3、F4.,F4.,筛选鉴定筛选鉴定o结果：消除有害突变，组合有益突变新菌种结果：消除有害突变，组合有益突变新菌种50例1：改良青霉菌生产青霉素的产量随机突变育种方法：X-射线(X)紫外线(UV)氮芥(N)120 units2658 units51toothpick1.01.251.251.01 菌落菌落1 菌落菌落0.5 ml2.516 菌落菌落16 菌落菌落CKINVaF0.5INVaF-80 stoc
30、k E.colitoothpick0.5ml 0.5ml 1.251.51.52.02.02.5-80 stock2 菌落菌落-80 stock例例2：菌种筛选示意图（选择压逐步增加）：菌种筛选示意图（选择压逐步增加）52例3：提高泰乐菌素生产能力突变育种 基因组shuffling出发菌种效果Zhang YX,et al.,Nature,415(6872):644-666.5316.3.2 菌种保藏菌种保藏o原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，从而丧失生产能力甚至菌株死亡。从而丧失生产能力甚至菌株死亡。o目的：目的：保持菌种保持菌
31、种原有原有优良特性优良特性，延长生命时限，延长生命时限，长期存活、长期存活、不退化，不污染，随时为生产供菌。不退化，不污染，随时为生产供菌。o原理：使菌种代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制的原理：使菌种代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制的休眠状态。休眠状态。o措施：物理和化学方法（温度：低温；水分：干燥；氧气：措施：物理和化学方法（温度：低温；水分：干燥；氧气：缺氧；营养；缺乏）缺氧；营养；缺乏）54保藏方法比较保藏方法比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法沙土保藏法冷冻干燥法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各类细菌
32、、酵母菌各类产孢子微生物各类36月612月12年116年515年以上简便简便简便简便有效简便有效5516.3.3 菌种库建立与质量控制o依据：GMP对药品生产的有关要求和规定建立各级种子细胞库，实施种子批系统管理，进行验证确保菌种的稳定、无污染，保证生产正常有序进行。56建库的流程W CBQCW CBQCQCMCB新菌种或细胞系原始培养物QC质保实验室，繁殖保存实验室，繁殖主菌种库MCB：来源于原始菌种或细胞培养物工作菌种库WCB：由主菌种库或主细胞库繁殖而来。57菌种库的质量管理菌种库的质量管理细胞类型质量控制（QC）内容细菌活性，纯度，真实性，革兰氏染色，形态特征，生化特征，遗传特征真菌活
33、性，纯度，真实性，形态特征，生化特征，遗传特征基因工程菌宿主菌特征，表达质粒结构与功能，鉴别标志，基因序列，稳定性，表达方式与水平动物细胞系活性，纯度，真实性，无菌实验，核型，DNA分析（如指纹图谱），同工酶分析，支原体试验，其他外源物试验，稳定性和基因型分析58保藏机构中国保藏机构中国o中国典型培养物保藏中心中国典型培养物保藏中心:China Center for Type:China Center for Type Culture Collection(CCTCC)Culture Collection(CCTCC)。o中国科学院典型培养物保藏委员会中国科学院典型培养物保藏委员会,下设下设9
34、 9个库个库o中国普通微生物菌种保藏管理中心：中国普通微生物菌种保藏管理中心：China General China General Microbiological Culture Collection Center(CGMCC)Microbiological Culture Collection Center(CGMCC)，微生物所（真菌和细菌）；武汉所（病毒）微生物所（真菌和细菌）；武汉所（病毒）o抗生素菌种保藏管理中心（抗生素菌种保藏管理中心（CACCCACC）：中国医学科学院抗生）：中国医学科学院抗生素所，四川抗生素所，华北制药集团抗生素所素所，四川抗生素所，华北制药集团抗生素所59保
35、藏机构国外保藏机构国外oWFCCWFCC：World federation for culture World federation for culture collections,collections,o 美国的典型菌种保藏中心美国的典型菌种保藏中心ATCC:American Type ATCC:American Type Culture Collection,Culture Collection,o日本发酵研究所日本发酵研究所IFO:Institute for IFO:Institute for Fermentation,Osaka,JapanFermentation,Osaka,Jap
36、ano英国国家典型菌种保藏所英国国家典型菌种保藏所NCTC:National NCTC:National Collection of Type Culture,London,UK Collection of Type Culture,London,UK 6016.4 16.4 培养基制备培养基制备o 概念概念 供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的按供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。一定比例配制的多种营养物质的混合物。作用：营养作用；环境条件（渗透压、作用：营养作用；环境条件（渗透压、pH等）；稳等）；稳定工艺控制（非营养成分，前体，促进剂，消
37、沫定工艺控制（非营养成分，前体，促进剂，消沫剂）。剂）。o培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。61碳源碳源氮源氮源无机盐无机盐水水生长因子生长因子前体与促进剂前体与促进剂消泡剂消泡剂16.4.1 培养基的成分培养基的成分62概念：概念：构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质。构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质。作用：作用：为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物质和代谢产物的合成提供碳骨架。质和代谢产物的合成提供碳骨架。
38、1、碳源、碳源63糖类：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜糖类：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜脂肪：豆油、棉籽油和猪油脂肪：豆油、棉籽油和猪油醇类：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇醇类：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白类：蛋白胨、酵母膏蛋白类：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖类、有机酸速效碳源：糖类、有机酸迟效碳源：酪蛋白水解产生的脂肪酸迟效碳源：酪蛋白水解产生的脂肪酸碳源种类碳源种类642、氮源、氮源概念：概念：构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质。构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质。作用：作用：为生长和代谢主要提供氮素来源。为生长和代谢主要提供氮素来源。种类：无机氮源、有机氮源种类：无机氮源、有机
39、氮源65几乎所有微生物都能利用有机氮源：几乎所有微生物都能利用有机氮源：黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、尿素。母粉、尿素。选择性利用无机氮源：选择性利用无机氮源：氨水、铵盐和硝酸盐。氨盐比硝酸盐更快被利用。氨水、铵盐和硝酸盐。氨盐比硝酸盐更快被利用。生理酸性物质：代谢后能产生酸性残留物质。生理酸性物质：代谢后能产生酸性残留物质。（NHNH4 4）2 2SOSO4 4利用后，产生硫酸利用后，产生硫酸生理碱性物质：代谢后能产生碱性残留物质。生理碱性物质：代谢后能产生碱性残留物质。硝酸钠利用后，产生氢氧化钠。硝酸钠利用后，产生氢氧
40、化钠。663、无机盐和微量元素、无机盐和微量元素o概念：概念：组成生理活性物质或具有生理调节作用矿物质组成生理活性物质或具有生理调节作用矿物质o作用方式：作用方式：低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。o种类：种类：盐离子盐离子磷、硫、钾、钠、镁、钙，常常添加磷、硫、钾、钠、镁、钙，常常添加铁、锌、铜、钼、钴、锰、氯，一般不加。铁、锌、铜、钼、钴、锰、氯，一般不加。674、水、水o菌体细胞的主要成分。菌体细胞的主要成分。o营养传递的介质。营养传递的介质。o良好导体，调节细胞生长环境温度。良好导体，调节细胞生长环境温度。o培养基的主要成分之一。培养基的主要成分之
41、一。685、生长因子、生长因子概念：概念：维持微生物生长所必需的微量有机物，不起碳源和氮维持微生物生长所必需的微量有机物，不起碳源和氮源作用。源作用。种类：种类：维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般无需添加天然成分中含有：一般无需添加 。营养缺陷型菌株：必需添加。营养缺陷型菌株：必需添加。696、前体、前体o概念：概念：加入到发酵培养基中的某些化合物，被直接结合加入到发酵培养基中的某些化合物，被直接结合到目标产物分子中，而自身的结构无多大的变到目标产物分子中，而自身的结构无多大的变化。化。有些氨基酸、核苷酸和抗生素
42、发酵必须添加前体物有些氨基酸、核苷酸和抗生素发酵必须添加前体物质才能获得较高的产率质才能获得较高的产率o使用：使用：添加前体是提高抗生素产量的重要措施。添加前体是提高抗生素产量的重要措施。多次少量流加的工艺。多次少量流加的工艺。70前体产物苯氧乙酸，苯乙酸及其衍生物青霉素V，青霉素G氯化钠金霉素，氯霉素，灰黄霉素肌醇，精氨酸链霉素丙酸、丙醇红霉素丁酸盐柱晶白霉素丙酸盐核黄素-紫罗酮类胡萝卜素氯化钴维生素B12-氨基丁酸L异亮氨酸甘氨酸L丝氨酸邻氨基苯甲酸L色氨酸71氨基酸发酵的前体物质氨基酸发酵的前体物质氨基酸氨基酸菌体菌体前体物质前体物质产量产量/%/%丝氨酸丝氨酸嗜甘油棒状嗜甘油棒状杆菌杆
43、菌甘氨酸甘氨酸1.61.6色氨酸色氨酸异常汉逊酵异常汉逊酵母母氨茴酸氨茴酸0.80.8色氨酸色氨酸麦角菌麦角菌吲哚吲哚1.31.3蛋氨酸蛋氨酸脱氢极毛杆脱氢极毛杆菌菌2-2-羟基羟基4-4-甲基硫代甲基硫代丁醇丁醇1.11.1异亮氨异亮氨酸酸粘质赛杆菌粘质赛杆菌-氨基丁酸氨基丁酸0.80.8异亮氨异亮氨酸酸阿氏棒状杆阿氏棒状杆菌菌D-D-苏氨酸苏氨酸1.51.572抗生素发酵常用的前体物质抗生素发酵常用的前体物质抗生素抗生素前体物质前体物质抗生素抗生素前体物质前体物质青霉素青霉素G G苯乙酸或在发酵中能形苯乙酸或在发酵中能形成苯乙酸的物质，如乙成苯乙酸的物质，如乙基酰胺等基酰胺等金霉素金霉素氯
44、化物氯化物青霉素青霉素O O烯丙基硫基乙酸烯丙基硫基乙酸溴四环素溴四环素溴化物溴化物青霉素青霉素V V苯氧乙酸苯氧乙酸红霉素红霉素丙酸、丙醇、丙酸盐、丙酸、丙醇、丙酸盐、乙酸盐乙酸盐放线菌素放线菌素C C3 3肌氨酸肌氨酸灰黄霉素灰黄霉素氯化物氯化物链霉素链霉素肌醇、精氨酸、甲硫氨肌醇、精氨酸、甲硫氨酸酸736、促进剂、促进剂o概念：概念：促进产物生成的物质，但不是营养物，也不是前促进产物生成的物质，但不是营养物，也不是前体的一类化合物。体的一类化合物。o种类：种类：氯化物有利于灰黄霉素、金霉素合成。氯化物有利于灰黄霉素、金霉素合成。表面活性剂吐温、清洗剂，脂溶性小分子化合物表面活性剂吐温、清
45、洗剂，脂溶性小分子化合物等，起诱导作用。等，起诱导作用。74不同促进剂所起的作用不同促进剂所起的作用o起生长因素的作用；起生长因素的作用；o可推迟菌体的自溶；可推迟菌体的自溶；o抑制某些合成其他产物的途径而使之向所需产物的抑制某些合成其他产物的途径而使之向所需产物的途径转化；途径转化；o降低了生产菌的呼吸，使之有利于抗生素的合成；降低了生产菌的呼吸，使之有利于抗生素的合成；o改变发酵液的物理性质，改善通气效果；改变发酵液的物理性质，改善通气效果；o可与抗生素形成复盐，降低发酵液中抗生素的浓度可与抗生素形成复盐，降低发酵液中抗生素的浓度和促进抗生素的合成等。和促进抗生素的合成等。75抗生素的抑制
46、剂抗生素的抑制剂抗生素抗生素被抑制的产物被抑制的产物抑制剂抑制剂链霉素链霉素甘露糖链霉素甘露糖链霉素甘露聚糖甘露聚糖去甲基链霉素去甲基链霉素链霉素链霉素乙硫氨酸乙硫氨酸四环素四环素金霉素金霉素溴化物、巯基苯并噻唑、硫脲溴化物、巯基苯并噻唑、硫脲嘧啶、硫脲嘧啶、硫脲去甲基金霉素去甲基金霉素金霉素金霉素磺胺化合物、乙硫氨酸磺胺化合物、乙硫氨酸头孢菌素头孢菌素C C头孢菌素头孢菌素N NL-L-蛋氨酸蛋氨酸利福霉素利福霉素B B其他利福霉素其他利福霉素巴比妥药物巴比妥药物767、消沫剂、消沫剂o概念：概念：降低泡沫的液膜强度和表面黏度，使泡沫破裂的化合物。降低泡沫的液膜强度和表面黏度，使泡沫破裂的化
47、合物。o种类：表面活性剂，低表面张力。种类：表面活性剂，低表面张力。天然动植物油脂类、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和天然动植物油脂类、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯类、聚醚类、硅酮类）。酯类、聚醚类、硅酮类）。o作用：作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。消除泡沫，防止逃液和染菌。77培养基的种类培养基的种类按用途：选择性、鉴别性、富营养培养基等按用途：选择性、鉴别性、富营养培养基等按物理性质：固体，半固体、液体培养基按物理性质：固体，半固体、液体培养基按化学组成：合成、半合成、天然培养基按化学组成：合成、半合成、天然培养基按发酵过程中所处位置和作用：斜面或平板固按发酵过程中所处位置和作用：斜面或平板
48、固体、种子、发酵和补料培养基。体、种子、发酵和补料培养基。16.4.2 培养基种类及其质量控制技术培养基种类及其质量控制技术781、固体培养基、固体培养基概念：概念：细菌和酵母的固体斜面或平板培养基，链霉菌和丝状细菌和酵母的固体斜面或平板培养基，链霉菌和丝状真菌的孢子培养基。真菌的孢子培养基。制备：制备：液体培养基添加液体培养基添加1.0-2.0%1.0-2.0%琼脂粉。琼脂粉。作用：作用：提供菌体的生长繁殖，形成孢子。提供菌体的生长繁殖，形成孢子。791 1、固体培养基要求与质量控制、固体培养基要求与质量控制o单细胞培养基：单细胞培养基：营养丰富，满足菌体生长迅速，不能引起变异。营养丰富，满
49、足菌体生长迅速，不能引起变异。o孢子培养基：孢子培养基：基质浓度较低，无机盐浓度适量，以利于孢子形基质浓度较低，无机盐浓度适量，以利于孢子形成。营养不宜太丰富，否则不易产生孢子。成。营养不宜太丰富，否则不易产生孢子。802、种子培养基、种子培养基o概念：概念：供孢子发芽和菌体生长繁殖，摇瓶和种子罐供孢子发芽和菌体生长繁殖，摇瓶和种子罐培养基培养基,为液体。为液体。o作用：作用：使种子扩大培养，增加细胞数目，生长形成使种子扩大培养，增加细胞数目，生长形成强壮、健康和高活性的种子。强壮、健康和高活性的种子。812、种子培养基要求与质量控制、种子培养基要求与质量控制培养基成分必需完全，营养丰富。培养
50、基成分必需完全，营养丰富。用速效性、容易被利用的碳、氮源和无机盐等物用速效性、容易被利用的碳、氮源和无机盐等物质，但浓度不宜高。质，但浓度不宜高。种子培养基要与发酵培养基相适应，主要成分接种子培养基要与发酵培养基相适应，主要成分接近，不能差异太大。近，不能差异太大。缩短发酵的延滞期。缩短发酵的延滞期。823 3、发酵培养基、发酵培养基o概念：概念：提供微生物生长、目标产物生成的生产用培养基。提供微生物生长、目标产物生成的生产用培养基。o作用：作用：不仅要满足菌体的生长和繁殖，还要满足菌体合成不仅要满足菌体的生长和繁殖，还要满足菌体合成目标产物，是发酵生产中最关键和最重要的培养基。目标产物，是发
