1、G6PD的临床生物化学检测中国中国南宁南宁 黄崇庭黄崇庭 2023-1-11目目 录录一、一、G6PD与与G6PD缺乏症缺乏症二、二、G6PD的发病机制的发病机制三、三、G6PD的流行病学与遗传规律的流行病学与遗传规律四、四、G6PD临床生物化学检测临床生物化学检测五、华南常见五、华南常见G6PD试剂盒的概况试剂盒的概况 六、美康六、美康G6PD调试经验调试经验七、案例分享七、案例分享一、一、G6PD与与G6PD缺乏症缺乏症1、什么是、什么是G6PD？G6PD是葡萄糖葡萄糖6磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶的简称，是一种存在于人体红细胞内，协助葡萄糖进行新陈代谢的一种重要的酶类，在这代谢过程中会产生NAD
2、PH（还原型辅酶）的物质能以保护红细胞免受氧化物质的威胁。G6PD缺乏时，若身体接触到具氧化性的特定物质或服用了这类药物，红血球就容易被破坏而发生急性溶血反应。G6PD 对于磷酸戊糖旁路至关重要，而该途径可为髓鞘脂酸形成提供 NADPH。2、什么是什么是G6PD缺乏症？缺乏症？G6PD缺乏症缺乏症是由G6PD基因突变，导致该酶活性降低，红细胞因为缺乏NADPH而不能抵抗氧化损伤而遭受破坏，引起溶血性贫血的一种遗传病。常因食用蚕豆而发病，俗称“蚕豆病”。二、二、G6PD的发病机制的发病机制葡萄糖的代谢途径，主要是糖酵解进入三羧酸循环，产生ATP，次要途径是磷酸戊糖途经，产生NADPH和磷酸核糖。
3、二、二、G6PD的发病机制的发病机制磷酸戊糖途经磷酸戊糖途经G6PDG6P 6-磷酸葡萄糖酸内脂+NADPHG6PD谷胱甘肽还原型+氧化性物质 谷胱甘肽氧化型 NADPH在红细胞内，谷胱甘肽还原型可以抵抗氧化性的物质，在维持红细胞的细胞膜稳定方面起到重要作用，如果G6PD缺乏导致NADPH不足，谷胱甘肽的作用降低，从而使红细胞模受损，在一定条件下容易产生红细溶血，引起一些不良症状。三、三、G6PD的流行病学与遗传规律的流行病学与遗传规律1、G6PD流行病学流行病学 据估计,全球约有4亿人受累,我国华南及西南各省较常见,主要分布在热带和亚热带,我国的南方地区是高发区,尤其是广西、广东、云南、福建
4、等省,北方地区较少见。我国各地发生率报道不一,上海为0.78%、长沙0.90%、南昌为1.20%、南宁南宁为7.20%、昆明为2.50%。此病广东地区平均发病率为5%10%,广州市为3.70%、东莞3.20%、深圳2.30%,中山发生率4.20%。2、G6PD的遗传规律的遗传规律G6PD缺乏程度与性别的关系，G6PD缺乏是伴伴X不完全显性遗传不完全显性遗传,基因位于X染色体上。缺失：缺失：男性只有一条X染色体,一旦这唯一的染色体缺失G6PD基因,则表现为G6PD重度缺乏,而女性有两条X染色体,如果仅有1条X染色体缺失G6PD基因,则为杂合子,表现为中度缺乏,只有两条X染色体均缺G6PD基因才表
5、现为重度缺乏。基因突变：基因突变：不同的基因突变类型，可以导致G6PD结构不一样，酶活性有差异，即使G6PD基因没有缺失，也有可能存在不同程度缺乏。四、四、G6PD临床生物化学检测临床生物化学检测1、G6PD检测的临床意义检测的临床意义红细胞G6PD 催化反应生成的NADPH 是谷胱甘肽还原酶的辅酶，还原型谷胱甘肽(GSH)是保持血红蛋白稳定性及红细胞膜完整性的必要条件。红细胞G6PD 缺乏者，在服用某些药物(如抗在药、酬类药、伯氨哇附中、磺胶等)及食用蚕豆后，代谢产生的氧自由基，或与氧合血红蛋白作用形成的H2O2使GSH 氧化成的琉基失去GSH 的保护，被氧化变性形成Heinz 小体。红细胞
6、膜失去疏基保护而功能受损，导致溶血。所以检测患者G6PD，可以对多种溶血性病进行早期诊断和早期预防。适用人群适用人群：新生儿及其父母：可以早期筛查新生儿是否缺乏G6PD，了解家庭遗传方式。婚检：分析后代可能缺乏G6PD的概率。溶血性疾病患者：鉴别和分析溶血性病类型和原因，有利于临床采取适当治疗措施和药物治疗。2、G6PD的检测方法的检测方法 2.1 比色法（生化仪）比色法（生化仪）G6PD 活性校正值测定活性校正值测定原理：原理：红细胞G6PD 催化G6P 生成6-磷酸葡萄糖内脂，后者很快氧化成6-磷酸萄糖酸(6-PGA)，同时NADP 被还原成NADPH。在340 nm 处监视NADPH 吸
7、光度的升高，计算酶的活性。红细胞中还含有6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)，催化6-PGA 脱羧，生成核酮体糖-5-磷酸，同时使辅酶NADP 还原成NADPH。在本测定系统中，由6-PGA和G6 P 组成的底物系统，测得的酶活性，减去单独以6-PGA 为底物时测得的酶活性，代表真正G-6-PD 的活性。本法测定包含如下2 个反应式:（1）G6P+NADP+6PGA+NADPH+H+(2)6PGA+NADP+R-5-P+NADPH+H+CO2 G6PD6-PGD血红蛋白测定血红蛋白测定氰化高铁血红蛋白测定法氰化高铁血红蛋白测定法原理：原理：血液在Hb转化液中溶血后，除SHb外各种Hb均可被高铁氰
8、化钾氧化为高铁Hb再与CN-结合生成稳定的棕红色氰化高铁Hb。HiCN最大波峰在540nm,最小吸收峰为504nm。特定标准条件下，毫摩尔消光系数为44Lmmol1cm。因此，根据标本的吸光度，即可测定Hb浓度。HiCN 试剂试剂:氰化钾(KCN)高铁氰化钾无水磷酸二氢钾特别提醒：该法是测定血红蛋白的标准方法，但是试剂中含有氰化钾剧毒物，特别提醒：该法是测定血红蛋白的标准方法，但是试剂中含有氰化钾剧毒物，操作时必须小心。实验后的废液也要小心处理。操作时必须小心。实验后的废液也要小心处理。G6PD活力计算：活力计算：G6PD=(G6PD+6PGD)6PGD (U/L)G-6-PD,U/g Hb=
9、G6PD/Hb意义：每克血红蛋白中G6PD的活性参考值：参考值：健康成年人，红细胞G6PD 活性(己校正6-PGD)8.341.59 U/g Hb 红细胞活6PGD性为6.8-12.0U/g Hb注意一：注意一：NADPH比值法或比值法或G6PD/6GPD法，在上面基础上不采用两个指标相法，在上面基础上不采用两个指标相减，而是相除，原理是减，而是相除，原理是6GPD尚未报道在尚未报道在G6PD患者和正常人之间有差异，通患者和正常人之间有差异，通过比值法筛查，一定程度上可以确认女性杂合子，也就是过比值法筛查，一定程度上可以确认女性杂合子，也就是G6PD基因缺陷携基因缺陷携带者。此法受到一些试剂厂
10、家和医院青睐。带者。此法受到一些试剂厂家和医院青睐。G6PD 活性直接测定法活性直接测定法 G6PD 活性校正值测定虽然能提供G6PD 活性真值和6GPD的活性，但在溶血性疾病的检查中尚未发现红细胞6PGD活性正常而掩盖G6PD活性缺乏的现象。因此，就临床使用而言，G6PD活性的的简易测定法己能满足临床。原理：原理：G6P+NADP+6PGA+NADPH+H+在波长340 nm 处监测NADPH 的吸光度增高，计算G6PD活性。活性计算：活性计算：G-6-PD,U/g Hb=G6PD/Hb参考值：参考值：健康成年人，红细胞G6PD 活性为8-18 U/g Hb。注意：医院可以根据需要决定是否需
11、要注意：医院可以根据需要决定是否需要6PGD校正。校正。G6PD其他方法：其他方法：2.2高铁血红蛋白还原试验高铁血红蛋白还原试验:2.3免疫斑点杂交法：免疫斑点杂交法：G6PD活性测定注意事项活性测定注意事项：1、Mg2+是G6PD的激活剂，铜离子和锌离子有轻度抑制作用，汞离子和对氯汞苯甲酸有完全抑制作用，因此日常使用中尽量避免抑制剂的污染。2、避免样本溶血，样本溶血后G6PD活性不稳定，影响其活性测定。溶血后活性降低很快，25min内需要及时测定。五、华南常见五、华南常见G6PD试剂盒概况试剂盒概况 目前，市场常见的生化仪比色试剂盒分为两种方法，一是G6PD直接测定法（速率法），直接测量G
12、6PD活性，二是NADPH比值法，测定G6PD/6PGD。有的试剂盒提供血红蛋白测定试剂，多数没有提供血红蛋白测试试剂。G6PD直接测定法的厂家有：直接测定法的厂家有：宁波美康、北京利德曼、上海执成、长春汇力、广州科方 参考值：成人参考值：成人1300-3600U/L 儿童儿童1700-4000U/L NADPH比值法的厂家有：比值法的厂家有：广州科方、广州米基 参考值：成人参考值：成人G6PD/6PGD 1.0-2.3（0.95-1.05为可疑，建议复查）为可疑，建议复查）新生儿（脐带血、静脉血）新生儿（脐带血、静脉血）1.1-2.5（1.05-2.05为可疑，建议复查）为可疑，建议复查）不
13、同厂家试剂盒比较不同厂家试剂盒比较1、底物方面：、底物方面：长春汇力说明书反应底物为G6PDNa2外，其它厂家为G6P，但是实际上两者是同一物质的不同叫法。2、样本类型、样本类型：宁波美康、上海执成、北京利德曼采用压积红细胞，长春汇力、广州科方、广州米基可以采用全血、脐带血，长春汇力还可以采用末梢血。3、参考值方面：、参考值方面：G6PD直接测定法一般为成人成人1300-3600U/L 儿童儿童1700-4000U/L NADPH比值法成人成人G6PD/6PGD 1.0-2.3（0.95-1.05为可疑，建议复查）为可疑，建议复查）新生儿（脐带血、静脉血）新生儿（脐带血、静脉血）1.1-2.5
14、（1.05-2.05为可疑，建议复查）为可疑，建议复查）长春汇力与以上有所区别，具体如下：全血G6PD:638-1980U/L 4.2-14.5U/gHb脐带血或末梢血G6PD：832-2460U/L 4.9-14.5U/gHb血清G6PD：0-5U/L北京利德曼对参考值也规定的比较细:EDTA抗凝血：1300U/L以上正常，600-1300U/L可疑，需要血红蛋白校正。肝素抗凝血：1100U/L以上正常，500-1100U/L可疑，需要血红蛋白校正。每克血红蛋白中G6PD活性：3.8U/gHb4、G6PD活性校正活性校正：G6PD活性测定与血红蛋白含量和红细胞老幼有关，因此正确的做法是与血红
15、蛋白求比值来校正，长春汇力提供血红蛋白试剂校正，其他均无此试剂。由于血红蛋白测定有剧毒试剂以及占用通道和试剂，一般都不测定。G6PD/6PGD在筛查基因突变杂合子方面比较有优势，其他厂家没有5、美康、美康G6PD测定副波长为测定副波长为660nm，其他为，其他为405nm。六、美康六、美康G6PD调试经验调试经验1、参数按照说明书，定标方式有因子法，两点定标。试剂盒自带定标液，配有两个水平质控。定标液定出K因子为230000左右，与理论因子209084偏高10%，两种方法做两个水平质控都比较好。2、个别标本出负数。解决方案：有案例表明把副波长改成405可以解决负数问题。七、案例分享七、案例分享案例：案例：本人堂哥的儿子四岁，出生检测G6PD属于缺乏患者，其父母检测均正常，今年曾经得过严重小儿肺炎，经合理治疗好转。分析分析：因为小孩是G6PD缺乏症患者，母亲和父亲正常，遗传规律如下生男孩得病概率1/2，女儿1/2是携带者。看病时，向医生说明小孩是G6PD缺乏者，医生使用药物时避免开了一些不良药物。
