1、LC-MS/MS临床检验应用进展临床检验应用进展上海市徐汇区中心医院上海市徐汇区中心医院李水军李水军2013.10.29报告提纲q 液质联用技术原理q 国内外临床应用进展q 在我院的应用情况介绍 同型半胱氨酸 25-羟基维生素D 1,5-脱水葡萄糖醇q 问题和展望质谱技术发展历史1906Joseph John测定电子荷质比1922Francis William发现同位素1989Wolfgamg Paul 发明离子阱2002John Fenn发明电喷雾离子化质谱仪组成q 由离子源、真空接口、质量分析器和检测器组成。q 根据检测器类型可分为磁质谱、四级杆质谱、离子阱质谱、傅里叶回旋共振质谱、飞行时
2、间质谱。产生带电离子离子源真空接口质量分析器检测器引入带电离子按m/z分离和排列电信号放大样品引入数据分析LC-MS/MS仪灵敏度灵敏度g/mL灵敏度灵敏度ng/mL或者或者pg/mLHPLC,$MS,$APIHigh vacuumLC-MS/MS工作原理+Ionization+MS1+MS2FragmentationDetectionLCLC-MS/MS优势q特异性好，免疫分析对小分子化合物的检测缺陷q比HPLC和GC-MS的容易使用，通量更大，是免疫分析法的主要互补方法q与其他技术相比，单个样本的测试成本更低q建立和验证新方法比较容易国外LC-MS/MS应用q2000年，LC-MS/MS开
3、始应用于药物研发领域，逐步从标准技术成为国际通用技术q2010年，LC-MS/MS广泛应用于欧美临检参考实验室。由于第三方检测机构的推动，从大型医院临检实验室向中小型、甚至社区医院扩展Vogeser,Clin Chem Lab Med 2003;41:117-126.Dooley,Clin Biochem 2003;36:471-481.Vogeser,Clin Biochem 2008;41:649-662.0 0 10,000 10,000 20,000 20,000 30,000 30,000 40,000 40,000 50,000 50,000 60,000 60,000 70,00
4、0 70,000 20002000200220022004200420062006200820082010201020122012LC-MS cumulative publications in PubmedYearLC-MS在PubMed论文发表数量临检主要应用领域q新生儿筛查：氨基酸、肉毒碱、脂肪酸、有机酸q药物中毒、滥用药物分析、止痛药物分析q治疗药物监测：免疫抑制剂、抗癫痫药物、抗心律失常药q内分泌分析：肾上腺激素、性激素q蛋白鉴定和定量：C肽、PTH、血管紧张素q功能医学检测q以美国Mayo Clinic为例，1998年没有LC-MS/MS。2010年，60台LC-MS/MS，200
5、万个测试。Grebe SK,Singh RJ.Clin Biochem Rev.2011 Feb;32(1):5-31.LC-MS/MS国内应用现状q在各大医院已普及，主要用于临床药理q但在临检领域尚处于起步阶段q卫生部临检中心q部分医院检验科q第三方检验机构质谱法常作为参考方法，用于参考测量程序和校准品定值我院应用简介q 2000年引进LC-MS/MS，主要用于临床药理和临床科研。q 2002年开始探索临检应用：同型半胱氨酸、TDM、生物标志物（心血管病、糖尿病、前列腺癌）、内分泌（性激素、肾上腺激素）、维生素、氨基酸等。同型半胱氨酸同型半胱氨酸(Hcy)(Hcy)：心血管疾病独立危险因子心
6、血管疾病独立危险因子H H型高血压增加心脑血管事件型高血压增加心脑血管事件3030倍倍051015202530ReferenceCholesterolSmokingHypertension No Elevated Fasting Homocysteine Elevated Fasting HomocysteineRisk FactorsRelative Risk(Vascular Disease)流行病学研究证明，“H型”高血压患者心血管事件发生率较单纯存在高血压的患者高出约5倍，较正常人高出约25-30倍。Graham IM,et al.JAMA.1997;277(22):1775-81.H
7、cy代谢HcyMetAdoMetAdoHcyTHFCH3THFCH2THFCHOTHFCysB6BHMTMTRB12B2蛋氨酸循环叶酸循环Refsum H,et al.Clin Chem.2004;50(1):3-32.血中Hcy形式Hcy-AlbuminHcy-CysHcy80%bHcy20%fHcy正常正常tHcy5-15 mol/LHcy检测方法原理HcyHHcy-HcyHcy-CysHcy-AlbuminHcyHXHcy XHcy XAbLC-MS/MS特异性和准确性特异性和准确性更加优越更加优越HPLC-FU/UVGC-MSAA AnlyzerEnzyme assaysImmunoa
8、ssaysFPIA,EIA还原还原衍生化衍生化抗体结合抗体结合XAbDDT检测分析流程临床研究与应用体检人群血浆体检人群血浆/血清血清Hcy测定结果测定结果组别例数年龄Hcy（mol/L）P值*正常对照组2039.99.913.13.4 心脑血管病高危人群心脑血管病高危人群14945.07.920.212.70.01糖尿病糖尿病2447.25.921.312.30.01住院病人血浆住院病人血浆/血清血清Hcy测定结果测定结果组别例数年龄Hcy（mol/L）P值*对照组3869.212.313.96.6 脑梗塞脑梗塞4075.09.422.014.90.01冠心病4579.35.818.37.9
9、0.05高血压4871.110.316.87.80.05Li S,et al.J Chromatogr B.2008;870(1):63-67卫生部临床检验中心卫生部临床检验中心20112011年全国同型半胱氨酸年全国同型半胱氨酸EQA循环酶法和LC-MS/MS法结果差异明显，Bias从10.64%至21.80%循环酶法的室间差异较大，CV 9.10-12.61%。合作开发检测试剂盒国内首个获得国内首个获得SFDA批准，具有自主知批准，具有自主知识产权的液相色谱串联质谱识产权的液相色谱串联质谱HCY体外体外诊断试剂盒诊断试剂盒 国食药监械（准）字国食药监械（准）字2007第第3401206号号
10、 与现有方法比较优势q LC-MS/MS技术已成为目前生物样品中小分子化合物定性定量测定的金标准方法q 高准确性和特异性，直接测定质量,专一、灵敏、通用q 高通量：超过400测试/天q 长期运行成本低：使用通用试剂、消耗品成本低廉，大批量测定有优势2525羟基维生素羟基维生素D(25OHD)D(25OHD)：维生素维生素D D营养状况的最佳指标营养状况的最佳指标q 据估计，全球有10亿人维生素D缺乏或者不足。骨质疏松症只是维生素D缺乏的冰山一角，对人体的健康的影响极为广泛。q 维生素D 可降低慢性病，包括癌症、自身免疫性疾病、感染、心血管疾病等发病风险。20 ng/mL缺乏缺乏21-29 ng
11、/mL不足不足30-60 ng/mL充足充足25OHD水平维生素D营养状态维生素D缺乏相当普遍Holick MF.N Engl J Med.2007;357(3):266-281.上海的维生素上海的维生素D D调查情况调查情况25OHD 浓度浓度 维生素维生素D状况状况比例比例150 ng/mL 中毒（0）0%25OHD 16.4 5.3 ng/mL(2.5th-97.5th 7.9-28.8 ng/mL)130 M35 M020406080100120140全球全球中国中国25OHD 测试量测试量国内市场份额估计可达数十亿元人民币25OHD检测市场需求巨大25OHD检测方法比较免疫法 通常只
12、能测总25OHD 体内类似物多，交叉反应大，影响结果准确性HPLC法 测定费时，工作量大 灵敏度可能不足LC-MS/MS 可分别测定25OHD2和25OHD3，有助于临床疗效判断 灵敏度、特异性较好LC-MS/MS与ECLIA方法比较y=0.514x+1.269 ng/mL,r=0.590,Sy|x=-11.9 ng/mL(ECLIA for 25OHD3)LC-MS/MS与ECLIA总25OHD比较y=1.364x-1.815 ng/mL,r=0.834,Sy|x=5.22 ng/mL(ECLIA for 25OHD total)LC-MS/MS与EIA总25OHD比较y=1.120 x+7
13、.274 ng/mL,r=0.723,Sy|x=9.06 ng/mL(EIA for 25OHD total)y=0.885x+1.672 ng/mL,r=0.987,Sy|x=-1.88 ng/mL(LC-MS/MS for 25OHD2 and 25OHD3)LC-MS/MS与美国CAP比较LC-MS/MS与NIST的LC-MS/MS参考方法比较y=0.9222x-0.045 ng/mL,r=0.9971,Sy|x=1.47 ng/mL(LC-MS/MS for 25OHD2 and 25OHD3)0510152025303540基线值基线值3个月个月6个月个月9个月个月12个月个月25O
14、HD浓度（浓度（ng/mL)LC-MS/MSECLIA点线图方法不同导致完全不同的临床判断1,5-1,5-脱水葡萄糖醇脱水葡萄糖醇(1,5-AG)(1,5-AG)我国糖尿病现状36控制糖尿病并发症风险q 糖尿病的并发症分为微血管并发症和大血管并发症。q 中华医学会糖尿病学分会慢性并发症调查组报告住院2型糖尿病并发症患病率分别为：高血压34.2%，脑血管病12.6%，心血管病17.1%，下肢血管病5.2%。防治心脑血管疾病所需的医疗支出，占糖尿病医疗费用的最主要部分。q 单纯餐后血糖升高者占近单纯餐后血糖升高者占近50%。37中国2型糖尿病防治指南（2010版）血糖控制不良人群占63%Data
15、from NHANES and DCCT血糖监测指标1,5AG果糖胺108975643120HbA1C葡萄糖葡萄糖Weeks before measurement1,5-AG使血糖监控更加严密完整和科学！1,5-AG的生理特征40组织库存(500-1000 mg)肾肾饮食摄入1,5-AG(5-10mg/天)尿排泄1,5-AG(5-10mg/天)Buse JB et al.Diab Tech&Ther 2003,5(3):355-363高血糖高血糖尿排泄1,5-AG增加增加1,5-AG重吸收血血1,5-AG下降下降1,5-AG可监测到血糖的细微变化Yamanouchi T et al.Lance
16、t 19962型糖尿病人治型糖尿病人治疗过疗过程中考察程中考察1，5-AG的的变变化化A组28例糖尿病人连续治疗6周B组28例糖尿病人连续治疗4周后终止治疗方法验证临床应用临床应用 Li S et al.J Chromatogr.2008;875(2):459-64.010203040504914191,5-AGHbA1Cr=-0.569(n=328)0102030405001020301,5-AGPPGr=-0.456(n=181)0102030405001020301,5-AGFBGr=-0.409(n=174)01020304050050010001,5-AGFAr=-0.539(n=6
17、3)1,5-AG与其他指标的相关性与其他指标的相关性1,5-AG临床意义 1 1,5-AG是短期血糖控制和血糖波动的监测指标，反映反映3天天-1周的血糖水平周的血糖水平。2 快速敏感地响应血糖变化快速敏感地响应血糖变化，适用于严格血糖控制监测，可作为诊断糖尿病情好转与恶化趋势的敏锐指标。3 1,5-AG能更特异性且有效地反映餐后血糖有效地反映餐后血糖，即使在HbA1C水平相同者也截然不同，因此测定1,5-AG有利于监控糖尿病并发症监控糖尿病并发症的风险。4 1,5-AG水平不受轻度或中度肾功能不全的影响，对轻度或中度肾功能不全的2型糖尿病患者，1,5-AG仍可作为血糖控制的可靠指标。1,5-A
18、G与血糖控制关系1,5-AG(g/mL)血糖控制情况血糖控制情况14.0 正常1013.9控制良好69.9控制一般25.9控制差2控制非常差 美国糖尿病协会指出预防糖尿病病并发症的重要性在于严格的血糖控制严格的血糖控制。间歇性的血糖波动间歇性的血糖波动比慢性高血糖对血管内皮细胞的损伤更大。1,5-AG测试结果2周内发生变化，医生可以利用检测结果及时了解患者血糖控制的改进效果或恶化程度。1,5-AG能更准确地反映餐后血糖餐后血糖变化情况，有利于监控糖尿病并发症的风险。优势和潜力q国际认可、国内尚未普及的临检新指标q 金标准方法，临床诊断的准确性优势明显q 高通量检测，连续测试可超过300个/天q
19、 有效填补临床糖尿病管理的信息数据链缺口 可客观评价病人住院期间的血糖控制情况 其临床应用推广及相关科研价值凸显质谱技术用于临床问题与瓶颈q 技术q 操作q 政策技术q 方法重现性q 通量限制分析时间样品处理和信息系统的连接q 内源性物质、同分异构体、代谢物的干扰q 基质效应（离子抑制增强）稳定同位素内标（ID-MS）Vogeser,Clin Chem Lab Med 2003;41:117-126.Dooley,Clin Biochem 2003;36:471-481.Vogeser,Clin Biochem 2008;41:649-662.操作q 仪器贵，试剂成本低仪器贵，试剂成本低q 初始投资大，长期回报高q技术门槛高，有利自主创新技术门槛高，有利自主创新q 要求批量分析，报告周期长q 配套技术及专用试剂盒有待开发政策q 用于临床检验在国内刚起步q 高新技术临床应用社会认同有待提高q 缺乏相应的规范性文件和专业组织q 没有相应的临检收费标准未来展望q 样品前处理、检测通量和配套试剂的创新q 蛋白和多肽定量q 高分辨质谱
