1、实验四、临床血清学快速检测技术实验四、临床血清学快速检测技术p当前，新发动物疫病不断发生，老病出现新症状，当前，新发动物疫病不断发生，老病出现新症状，多重复合感染，动物疫病日趋复杂。研制快速、多重复合感染，动物疫病日趋复杂。研制快速、准确、廉价的诊断试剂是动物疫病防制的迫切需准确、廉价的诊断试剂是动物疫病防制的迫切需求。求。p在动物传染病的预防与控制中，疾病的诊断，病在动物传染病的预防与控制中，疾病的诊断，病原学与流行病学调查与研究非常重要，但这都需原学与流行病学调查与研究非常重要，但这都需要简便快速、敏感特异的诊断方法与试剂盒。要简便快速、敏感特异的诊断方法与试剂盒。新型诊断试剂的研究快速检
2、测方法快速检测方法抗原检测方法抗原检测方法抗体检测方法抗体检测方法乳胶凝集试验（乳胶凝集试验（LAT)LAT)胶体金试纸条胶体金试纸条酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)(ELISA)乳胶凝集试验（乳胶凝集试验（LAT)LAT)胶体金试纸条胶体金试纸条酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)(ELISA)常规诊断常规诊断LATLAT鉴别诊断鉴别诊断LATLAT常规诊断常规诊断ELISAELISA鉴别诊断鉴别诊断ELISAELISA聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）p胶体金胶体金（Colloidal goldColloidal gold）是氯金酸是氯金酸（HAuClHAu
3、Cl4 4）的水溶胶，氯金酸在还原剂的作的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。电作用成为一种稳定的胶体状态。质量好的胶体金：溶液呈红色，胶体金颗粒为球质量好的胶体金：溶液呈红色，胶体金颗粒为球形，大小均一，无棱角。形，大小均一，无棱角。质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，形状质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，形状各异。各异。胶体金的质量判定标准胶体金的质量判定标准p胶体金标记技术胶体金标记技术（Immunogold labeling Immunogold labeling techniquet
4、echnique）是以胶体金作为示踪标记物应是以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。p胶体金标记的原理胶体金标记的原理：胶体金在碱性条件下带胶体金在碱性条件下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合。吸引而形成牢固结合。（二）胶体金试纸条诊断技术的原理（二）胶体金试纸条诊断技术的原理 以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并慢向另一端渗
5、移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测利用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原抗原/抗体。抗体。最常用的是双抗夹心法检测抗原最常用的是双抗夹心法检测抗原试验所用试剂全部为干试剂，主要有：试验所用试剂全部为干试剂，主要有：1.免疫金复合物干片免疫金复合物干片2.特异抗体特异抗体3.抗小鼠抗小鼠IgG胶体金标记的单克隆抗胶体金标记的单克隆抗体（小鼠体（小鼠IgG）p多个试剂被组合在一个约多个试剂被组合在一个约6 6mmmm70mm70mm的塑料的塑料板条上，成为一单一试剂条：板条上，成为一单一试剂条：A A和和B B：硝酸纤维素膜条的上端和下端硝酸纤维素膜条的上端和下端C C
6、：免疫金复合物干片，紧贴硝酸纤维素膜条免疫金复合物干片，紧贴硝酸纤维素膜条T T：包被特异抗体的测试区包被特异抗体的测试区R R：包被抗小鼠包被抗小鼠IgGIgG的参照区的参照区 p1.1.测定时将试纸条下端浸入液测定时将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经取液体向上端移动，流经C C处时处时使干片上的使干片上的免疫金复合物免疫金复合物复溶，复溶，并带动其向膜条渗移。并带动其向膜条渗移。测测 定定p2.2.若标本中有待测特异抗原，若标本中有待测特异抗原，其时可与免疫金复合物之抗体其时可与免疫金复合物之抗体结合，此抗原抗体复合物流至结合，此抗
7、原抗体复合物流至测试区即被固相抗体所获，在测试区即被固相抗体所获，在膜上显出红色膜上显出红色反应线条反应线条（T T）。）。测测 定定测测 定定p3.3.过剩的免疫金复合物继续前过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相抗小鼠行，至参照区与固相抗小鼠IgGIgG结合（免疫金复合物中的单克结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠隆抗体为小鼠IgGIgG），），而显出红而显出红色色质控线条质控线条（R R）。）。测测 定定p4.4.反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条质控线条。胶体金试纸条构成示意图胶体金试纸条构成示意图检测线检测线质检线质检线金标颗粒金标
8、颗粒吸收垫吸收垫样品垫样品垫硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜胶体金试纸条示意图胶体金试纸条示意图胶体金快速诊断技术的特点胶体金快速诊断技术的特点 p1.1.简捷快速：简捷快速：操作简单，一般只要操作简单，一般只要5 5-10min-10min 就会出结果，而其它方法如就会出结果，而其它方法如ELISAELISA需要需要1 1-2h-2h，PCR PCR 需要时间更长。需要时间更长。p2.2.结果易于判定：结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断。眼很容易判断。p3.3.特异性好：特异性好：因为该技术大多用于单克隆抗因为该技术大多用于单克隆抗体标记，这决定了它具有很好的特异
9、性。体标记，这决定了它具有很好的特异性。p1.1.病毒性疾病：病毒性疾病：传染性法氏囊病、禽流感、传染性法氏囊病、禽流感、新城疫、犬细小病毒、猪瘟等。新城疫、犬细小病毒、猪瘟等。p2.2.寄生虫疾病：寄生虫疾病：血吸虫病、旋毛虫病、囊血吸虫病、旋毛虫病、囊虫病、恙虫病。虫病、恙虫病。p3.3.细菌性疾病：细菌性疾病：霍乱弧菌、类鼻疽。霍乱弧菌、类鼻疽。胶体金快速诊断技术的应用胶体金快速诊断技术的应用（三）实验材料三）实验材料p1.1.流感胶体金试纸条试剂盒流感胶体金试纸条试剂盒p2.2.枪头枪头p3.3.被检样品被检样品p4.4.移液器移液器（四）操作方法四）操作方法p1.1.用移液器吸取被检
10、样品用移液器吸取被检样品20l20l，滴在试纸，滴在试纸条的加样孔中。条的加样孔中。p2.2.静置静置5 51010分钟。分钟。p3.3.观察反应结果。观察反应结果。阳性结果阳性结果阴性对照阴性对照（五）结果判定五）结果判定二、乳胶凝集试验二、乳胶凝集试验 Latex agglutination test，LAT一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理三、实验材料三、实验材料四、操作步骤四、操作步骤五、实验注意事项五、实验注意事项六、实验结果处理六、实验结果处理乳胶凝集试验乳胶凝集试验（一）实验目的一）实验目的p1.1.了解并掌握乳胶凝集试验的基本原理。了解并掌握乳胶凝集试验的基本原理
11、。p2.2.掌握乳胶凝集试验检测细小病毒抗体快掌握乳胶凝集试验检测细小病毒抗体快速检测方法的操作方法和结果判定方法。速检测方法的操作方法和结果判定方法。（二）基本原理二）基本原理 乳胶凝集试验是以聚苯乙烯乳胶颗粒作乳胶凝集试验是以聚苯乙烯乳胶颗粒作为载体，吸附特定的抗原或抗体，当遇为载体，吸附特定的抗原或抗体，当遇到血清中相应的抗体或处理过的病料中到血清中相应的抗体或处理过的病料中相应的抗原成份时，会形成肉眼可见的相应的抗原成份时，会形成肉眼可见的凝集颗粒。凝集颗粒。p1.1.普通乳胶：普通乳胶：依靠物理吸附发生致敏。依靠物理吸附发生致敏。p2.2.羧化乳胶：羧化乳胶：通过化学发应在乳胶颗粒和
12、通过化学发应在乳胶颗粒和致敏原之间形成酰氨键，发生化学偶联致致敏原之间形成酰氨键，发生化学偶联致敏乳胶，从而更稳定。敏乳胶，从而更稳定。p3.3.双色乳胶：双色乳胶：缓冲液和乳胶颗粒为不同的缓冲液和乳胶颗粒为不同的颜色，结果更易于观察。颜色，结果更易于观察。乳胶类型乳胶类型（三）实验材料三）实验材料p1.1.洁净玻片洁净玻片p2.2.枪头枪头p3.3.细小病毒致敏乳胶细小病毒致敏乳胶p4.4.细小病毒病阳性、阴性或临床细小病毒病阳性、阴性或临床待检血清待检血清（四）操作方法四）操作方法p1.1.在一洁净的玻片的不同位置滴加在一洁净的玻片的不同位置滴加3 3滴致敏滴致敏乳胶（每滴约乳胶（每滴约2
13、0l20l）。）。p2.2.用移液器分别取用移液器分别取20l20l的待检血清，滴加的待检血清，滴加到上述到上述3 3滴致敏乳胶中，并用枪头混匀。滴致敏乳胶中，并用枪头混匀。p3.3.轻轻摇晃玻片，使抗原和血清充分混匀，轻轻摇晃玻片，使抗原和血清充分混匀，静置静置1-21-2分钟，观察结果。分钟，观察结果。（五）实验注意事项五）实验注意事项p1.1.取不同试剂时应注意更换枪头，防止交取不同试剂时应注意更换枪头，防止交叉污染。叉污染。p2.2.混匀过程中，避免阳性对照、阴性对照混匀过程中，避免阳性对照、阴性对照和被检样品之间的交叉污染。和被检样品之间的交叉污染。乳胶凝集的阴性和阳性反应乳胶凝集的
14、阴性和阳性反应（六）结果判定六）结果判定判判 定定 标标 准准+为全部乳胶凝集，颗粒聚集于液滴边缘，液体为全部乳胶凝集，颗粒聚集于液滴边缘，液体透明；透明；+为大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊；为大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊；+为为50乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊；乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊；+有极少量的凝集，液体呈混浊；有极少量的凝集，液体呈混浊；-呈原有的均匀乳状。呈原有的均匀乳状。致敏乳胶试剂与致敏乳胶试剂与被检血清样品检被检血清样品检测结果测结果致敏乳胶试剂致敏乳胶试剂+-+-+空白乳胶试剂空白乳胶试剂乳胶凝集试验的特点乳胶凝集试验的特点p1.1.操作简捷，结果易
15、于判定；操作简捷，结果易于判定；p2.2.敏感性较低；敏感性较低；p3.3.致敏乳胶的稳定性低，保存期短。致敏乳胶的稳定性低，保存期短。乳胶凝集试验的应用乳胶凝集试验的应用p1.1.病毒性疾病：伪狂犬病毒抗体，细小病病毒性疾病：伪狂犬病毒抗体，细小病毒抗体、乙型脑炎病毒抗体，禽流感病毒毒抗体、乙型脑炎病毒抗体，禽流感病毒和抗体，传染性法氏囊病毒血清抗体和抗体，传染性法氏囊病毒血清抗体 ，鸭，鸭呼肠孤病毒；呼肠孤病毒；p2.2.寄生虫疾病：弓形虫等；寄生虫疾病：弓形虫等；p3.3.细菌性疾病：猪萎缩性鼻炎抗体等。细菌性疾病：猪萎缩性鼻炎抗体等。实验报告撰写要求n实验内容实验内容n实验目的实验目的n基本原理基本原理n实验材料实验材料n简述操作过程简述操作过程n结果判定结果判定n总结分析总结分析
