组胚探讨干细胞移植治疗糖尿病进展精选课件.ppt

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1、组胚探讨干细胞移植治疗糖尿病进展(优选)组胚探讨干细胞移植治疗糖尿病进展3 干细胞的类型 胚胎干细胞 embryonic stem cells 胚胎干细胞主要是指来自囊胚内细胞团的细胞,胚胎干细胞主要是指来自囊胚内细胞团的细胞,有自我更新和多向分化潜能,可以分化为内、中、外有自我更新和多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的各类细胞。三个胚层的各类细胞。成体干细胞 adult stem cells 成体干细胞是处于干细胞状态的成体细胞,包括成体干细胞是处于干细胞状态的成体细胞,包括成年和未成年动物组织中的各种干细胞,因此又称为成年和未成年动物组织中的各种干细胞,因此又称为组织干细胞。如神经

2、干细胞、组织干细胞。如神经干细胞、造血干细胞造血干细胞、骨髓间骨髓间质干细胞、上皮干细胞质干细胞、上皮干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞等。、肝干细胞、胰腺干细胞等。胚胎干细胞ESES细胞 ES 细胞是目前研究最广泛、最成熟的干细胞体系。自 2009 年起,全球共批准了 3项人 ES(hES)细胞的临床试验,标志着 hES 细胞向临床应用迈出了重要的一步。然而,hES 细胞.临床应用面临的一个瓶颈问题是免疫排斥反应。体细胞核移植(SCNT)技术能够制备携带患者基因型的 hES 细胞,可解决免疫排斥的难题。2013 年,美国 Mitalipov 研究团队将人类皮肤成纤维细胞核移植到供体去核卵细胞中,成

3、功建立了 SCNT 的hES 细胞,标志着治疗性克隆又向前迈出关键性的一步。然而,hES 细胞建系必须摧毁人类早期胚胎,故存在剧烈的伦理学争议。此外,hES 细胞来源的分化细胞移植到体内存在发展为肿瘤的潜在风险。诱导多能干细胞iPS iPS 细胞 iPS干细胞建立的简单过程 iPS干细胞建立的过程主要包括(1)分离和培养宿主细胞;(2)通过病毒介导或者其他的方式将若干多个多能性相关的基因导入宿主细胞;(3)将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上,并于ES细胞专用培养体系中培养,同时在培养中根据需要加入相应的小分子物质以促进重编程;(4)出现ES样克隆后进行iPS干细胞的鉴定(细胞形态、表观遗传学

4、、体外分化潜能等方面)。(5)非致死性外界刺激(如物理压缩,去除细胞膜上细菌毒素等,诱导多能干细胞iPS iPS 细胞 采用体细胞重编程技术可从患者自体细胞获得的 iPS 细胞,这不但可解决免疫排斥的难题,而且避免了 hES 细胞和 SCNT 研究存在的伦理学争论。糖尿病发病机制干细胞治疗机制疾病发病机制干细胞治疗机制结构改变内环境变化细胞/组织破坏缺乏血供;免疫功能紊乱;缺乏生长与营养因子;自由基;提供外源性干细胞;刺激内源性干细胞;分化结构重建 促进血管再生;调节免疫功能;分泌生长与营养因子;清除自由基;干细胞治疗糖尿病机制干细胞治疗糖尿病机制干细胞治疗糖尿病机制u干细胞对胰岛细胞的修复u

5、干细胞对其他胰岛素分泌细胞的修复 u干细胞对胰岛素抵抗的作用目前应用的干细胞根据来源的不同,干细胞可分为胚胎干(ES)细胞、诱导性多潜能干(iPS)细胞及成体干细胞。不同种类的干细胞具有各自的优势和不足。不同种类的干细胞具有各自的优势和不足。如神经干细胞、造血干细胞、骨髓间质干细胞、上皮干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞等。胚胎干细胞主要是指来自囊胚内细胞团的细胞,有自我更新和多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的各类细胞。胚胎干细胞 诱导分化成 细胞 细胞移植(优选)组胚探讨干细胞移植治疗糖尿病进展糖尿病小鼠肾膜下移植 ICCs 后血糖水平测量(1)干细胞诱导分化的不彻底性有待解决。人胎胰腺

6、的 nestin 阳性细胞的分布免疫组化技术显示nestin阳性细胞(5)非致死性外界刺激(如物理压缩,去除细胞膜上细菌毒素等,糖尿病小鼠模型制作(腹腔注射链脲佐菌素 STZ)肾膜下移植 ICCs 治疗糖尿病临床应用面临的一个瓶颈问题是免疫排斥反应。人胎胰腺 nestin阳性细胞的分离、体外培养和生物学特性检测(目的是确认 NIPs是胰腺干细胞);iPS干细胞建立的简单过程2000年,Hunziker 和 Stein 发现胰腺导管和胰岛中也存在 nestin阳性细胞。基因导入使其表达胰岛素 细胞移植cells,并将其移植到糖尿病小鼠11 I 型糖尿病的治疗外源胰岛素治疗胰腺或胰岛移植干细胞治疗

7、 胚胎干细胞 诱导分化成 细胞 细胞移植 基因导入使其表达胰岛素 细胞移植胰腺干细胞 诱导分化成 细胞 细胞移植12胰腺干细胞的标志 1990 1990年,Lendahl Lendahl 等人发现神经干细胞中存在一种新的中间丝蛋白巢蛋白(nestinnestin),现在 nestin nestin已是公认的神经干细胞标志之一。2000 2000年,Hunziker Hunziker 和 Stein Stein 发现胰腺导管和胰岛中也存在 nestin nestin阳性细胞。2001 2001年,Zulewski Zulewski等人从胰腺中分离到nestinnestin阳性细胞,将其命名为NI

8、PsNIPs(nestinpositive isletderived nestinpositive isletderived progenitor cells progenitor cells),并发现具有多向分化潜能(multipotential )(multipotential ),在体外可自发形成类胰岛细胞团(isletlike cell isletlike cell clusters,ICCsclusters,ICCs).因此,人们相信nestinnestin可能也是胰腺干细胞的标志。但是,NIPsNIPs是否确实是胰腺干细胞,能否用于细胞治疗必须进一步证实。13人胎胰腺的 nesti

9、n nestin 阳性细胞的分布免疫组化技术显示免疫组化技术显示nestinnestin阳性细胞阳性细胞 nestin 阳性细胞位于胰腺小导管壁及其相连的原始细胞团阳性细胞位于胰腺小导管壁及其相连的原始细胞团14实验步骤:人胎胰腺人胎胰腺 nestinnestin阳性细胞的分离、体外培养和阳性细胞的分离、体外培养和生物学特性检测(目的是确认生物学特性检测(目的是确认 NIPsNIPs是胰腺干是胰腺干细胞);细胞);体外诱导分化体外诱导分化 NIPsNIPs形成能产生胰岛素的形成能产生胰岛素的 细胞;细胞;类胰岛细胞团类胰岛细胞团 (ICCs)(ICCs)异种体内移植异种体内移植 糖尿病糖尿病的

10、干细胞治疗实验研究。的干细胞治疗实验研究。15糖尿病小鼠模型制作糖尿病小鼠模型制作(腹腔注射链脲佐菌素腹腔注射链脲佐菌素 STZ)肾膜下移植肾膜下移植 ICCs 治疗糖尿病治疗糖尿病NOD-Scid小鼠小鼠腹腔内注射腹腔内注射肾膜下移植含肾膜下移植含类类细胞的细胞的ICCs高血糖高血糖 注射注射 STZ前前注射注射STZ后后 移植移植ICCS后后 30 20 10 血糖水平血糖水平(mmol/l)注射后注射后3 3天小鼠出现天小鼠出现稳定的高血糖症稳定的高血糖症 移植移植4 4天后小鼠天后小鼠血糖明显下降血糖明显下降 insulin糖尿病小鼠肾膜下移植糖尿病小鼠肾膜下移植 ICCs 后形态观察

11、后形态观察免疫组化方法检测含胰岛素细胞免疫组化方法检测含胰岛素细胞 左肾移植部位左肾移植部位 移植后移植后4040天,移植部位血管增生天,移植部位血管增生免疫组化显示移植部位的胰岛免疫组化显示移植部位的胰岛素阳性细胞素阳性细胞胚胎干细胞 诱导分化成 细胞 细胞移植ICCs在正常小鼠体内的异常增殖,反映ICCs中存在较多未分化细胞,如何控制诱导分化的方向和纯度並有效抑制可能的恶性增殖是目前干细胞治疗研究碰到的棘手问题。不同种类的干细胞具有各自的优势和不足。成体干细胞是处于干细胞状态的成体细胞,包括成年和未成年动物组织中的各种干细胞,因此又称为组织干细胞。胚胎干细胞 诱导分化成 细胞 细胞移植人胎

12、胰腺的 nestin 阳性细胞的分布免疫组化技术显示nestin阳性细胞1,糖尿病小鼠体内微环境对ICCs的定向诱导分化作用,可能使糖尿病的干细胞治疗成为可能。cells,并将其移植到糖尿病小鼠的cells 能够保存并发挥分泌功能,治疗糖(3)将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上,并于ES细胞专用培养体系中培养,同时在培养中根据需要加入相应的小分子物质以促进重编程;根据来源的不同,干细胞可分为胚胎干(ES)细胞、诱导性多潜能干(iPS)细胞及成体干细胞。(2)通过病毒介导或者其他的方式将若干多个多能性相关的基因导入宿主细胞;2000年,Hunziker 和 Stein 发现胰腺导管和胰岛中也存

13、在 nestin阳性细胞。胰腺干细胞 诱导分化成 细胞 细胞移植基因导入使其表达胰岛素 细胞移植胚胎干细胞 诱导分化成 细胞 细胞移植(1)干细胞诱导分化的不彻底性有待解决。干细胞对其他胰岛素分泌细胞的修复(5)非致死性外界刺激(如物理压缩,去除细胞膜上细菌毒素等,移植移植4040天后,移植物在移植部位发生异常增殖并侵入肾实质,形成导天后,移植物在移植部位发生异常增殖并侵入肾实质,形成导管、细胞团、血管等结构。管、细胞团、血管等结构。正常正常NODScid小鼠肾膜下移植小鼠肾膜下移植 ICCs 移植部位的组织切片移植部位的组织切片H.E 染色染色移植移植 ICCs后血糖明显下降后血糖明显下降(

14、P0.05)糖尿病小鼠肾膜下移植糖尿病小鼠肾膜下移植 ICCs 后血糖水平测量后血糖水平测量STZ STZ 处理处理3 3天后所有天后所有NOD-Scid NOD-Scid 小鼠出现高血糖,移植小鼠出现高血糖,移植4 4天后小鼠天后小鼠血糖水平下降至接近正常并保持稳定至血糖水平下降至接近正常并保持稳定至4040天,未移植的小鼠保天,未移植的小鼠保持高血糖。持高血糖。19讨 论 1,糖尿病小鼠体内微环境对ICCs的定向诱导分化作用,可能使糖尿病的干细胞治疗成为可能。在体内诱导较体外彻底,细胞比例高于体外,能显著降低糖尿病小鼠血糖水平,说明糖尿病小鼠体内特殊环境有利于ICCs向细胞分化。(1)糖尿

15、病小鼠的血清可作为胰腺干细胞体外培养的诱导因子,其中高浓度葡萄糖和胰高血糖素样肽1(GLP1)起主要作用。(2)移植部位血管增生,为生长和分化提供营养並有利于胰岛素及时进入血液循环。20讨 论 2,干细胞治疗的安全性问题不容忽视。(1)干细胞诱导分化的不彻底性有待解决。ICCs在正常小鼠体内的异常增殖,反映ICCs中存在较多未分化细胞,如何控制诱导分化的方向和纯度並有效抑制可能的恶性增殖是目前干细胞治疗研究碰到的棘手问题。(2)干细胞移植会不会致癌仍是有待解决的问题。肿瘤干细胞(cancer stem cell)理论认为干细胞与癌细胞在增殖调节机制方面有着相同的信号途径和调控因子,癌症可能起源

16、于异常活化的干细胞。ABCG2是一种干细胞标志分子,同时又是多种癌细胞的抗药基因,可能是联系干细胞和癌细胞的分子基础之一。21讨 论3,胰腺干细胞治疗的免疫排斥问题没有完全解决。(1)异体移植的免疫排斥 (2)自身免疫反应 I 型糖尿病是一种自身免疫性疾病,自身细胞被自己的 T 细胞误认为 异已细胞而遭受免疫攻击。因此即使自身的干细胞移植,可以避免异体免疫排斥,可能仍会遭遇自身免疫反应。前沿研究 2014年10月,哈佛大学的干细胞研究员 Douglas Melton和他的同事用人体干细胞创造了成熟 cells,并将其移植到糖尿病小鼠 身体内。结果在两周内小鼠的糖尿病症状有所缓解。挑战1型糖尿病

17、是一种自身免疫性疾病,所 以移植细胞仍然是容易受到攻击。目前的研究进展通过免疫移植剂来阻断自 身免疫系统对移植细胞的攻击,从而使移入 的cells 能够保存并发挥分泌功能,治疗糖 尿病。(1)糖尿病小鼠的血清可作为胰腺干细胞体外培养的诱导因子,其中高浓度葡萄糖和胰高血糖素样肽1(GLP1)起主要作用。(3)将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上,并于ES细胞专用培养体系中培养,同时在培养中根据需要加入相应的小分子物质以促进重编程;STZ 处理3天后所有NOD-Scid 小鼠出现高血糖,移植4天后小鼠血糖水平下降至接近正常并保持稳定至40天,未移植的小鼠保持高血糖。干细胞对胰岛素抵抗的作用胚胎干细

18、胞主要是指来自囊胚内细胞团的细胞,有自我更新和多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的各类细胞。人胎胰腺 nestin阳性细胞的分离、体外培养和生物学特性检测(目的是确认 NIPs是胰腺干细胞);但是,NIPs是否确实是胰腺干细胞,能否用于细胞治疗必须进一步证实。3,胰腺干细胞治疗的免疫排斥问题没有完全解决。人胎胰腺的 nestin 阳性细胞的分布免疫组化技术显示nestin阳性细胞临床应用面临的一个瓶颈问题是免疫排斥反应。I 型糖尿病是一种自身免疫性疾病,自身细胞被自己的 T 细胞误认为 异已细胞而遭受免疫攻击。iPS干细胞建立的过程主要包括I 型糖尿病是一种自身免疫性疾病,自身细胞被自

19、己的 T 细胞误认为 异已细胞而遭受免疫攻击。成体干细胞 adult stem cellsiPS干细胞建立的简单过程(1)干细胞诱导分化的不彻底性有待解决。ICCs在正常小鼠体内的异常增殖,反映ICCs中存在较多未分化细胞,如何控制诱导分化的方向和纯度並有效抑制可能的恶性增殖是目前干细胞治疗研究碰到的棘手问题。Douglas Melton和他的同事用人体干细胞创造了成熟(3)将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上,并于ES细胞专用培养体系中培养,同时在培养中根据需要加入相应的小分子物质以促进重编程;2013 年,美国 Mitalipov 研究团队将人类皮肤成纤维细胞核移植到供体去核卵细胞中,成功

20、建立了 SCNT 的hES 细胞,标志着治疗性克隆又向前迈出关键性的一步。的cells 能够保存并发挥分泌功能,治疗糖2013 年,美国 Mitalipov 研究团队将人类皮肤成纤维细胞核移植到供体去核卵细胞中,成功建立了 SCNT 的hES 细胞,标志着治疗性克隆又向前迈出关键性的一步。干细胞的类型移植 ICCs后血糖明显下降(P0.2013 年,美国 Mitalipov 研究团队将人类皮肤成纤维细胞核移植到供体去核卵细胞中,成功建立了 SCNT 的hES 细胞,标志着治疗性克隆又向前迈出关键性的一步。(1)干细胞诱导分化的不彻底性有待解决。cells,并将其移植到糖尿病小鼠不同种类的干细胞

21、具有各自的优势和不足。挑战1型糖尿病是一种自身免疫性疾病,所成体干细胞是处于干细胞状态的成体细胞,包括成年和未成年动物组织中的各种干细胞,因此又称为组织干细胞。此外,hES 细胞来源的分化细胞移植到体内存在发展为肿瘤的潜在风险。此外,hES 细胞来源的分化细胞移植到体内存在发展为肿瘤的潜在风险。胰腺干细胞 诱导分化成 细胞 细胞移植不同种类的干细胞具有各自的优势和不足。的cells 能够保存并发挥分泌功能,治疗糖(3)将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上,并于ES细胞专用培养体系中培养,同时在培养中根据需要加入相应的小分子物质以促进重编程;I 型糖尿病的治疗I 型糖尿病是一种自身免疫性疾病,自

22、身细胞被自己的 T 细胞误认为 异已细胞而遭受免疫攻击。糖尿病小鼠模型制作(腹腔注射链脲佐菌素 STZ)肾膜下移植 ICCs 治疗糖尿病(2)干细胞移植会不会致癌仍是有待解决的问题。nestin 阳性细胞位于胰腺小导管壁及其相连的原始细胞团临床应用面临的一个瓶颈问题是免疫排斥反应。胚胎干细胞主要是指来自囊胚内细胞团的细胞,有自我更新和多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的各类细胞。3,胰腺干细胞治疗的免疫排斥问题没有完全解决。iPS干细胞建立的简单过程正常NODScid小鼠肾膜下移植 ICCs 移植部位的组织切片H.1,糖尿病小鼠体内微环境对ICCs的定向诱导分化作用,可能使糖尿病的干细

23、胞治疗成为可能。(1)分离和培养宿主细胞;人胎胰腺 nestin阳性细胞的分离、体外培养和生物学特性检测(目的是确认 NIPs是胰腺干细胞);(1)干细胞诱导分化的不彻底性有待解决。(1)分离和培养宿主细胞;I 型糖尿病是一种自身免疫性疾病,自身细胞被自己的 T 细胞误认为 异已细胞而遭受免疫攻击。Douglas Melton和他的同事用人体干细胞创造了成熟iPS干细胞建立的简单过程STZ 处理3天后所有NOD-Scid 小鼠出现高血糖,移植4天后小鼠血糖水平下降至接近正常并保持稳定至40天,未移植的小鼠保持高血糖。(3)将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上,并于ES细胞专用培养体系中培养,同

24、时在培养中根据需要加入相应的小分子物质以促进重编程;糖尿病小鼠肾膜下移植 ICCs 后血糖水平测量的cells 能够保存并发挥分泌功能,治疗糖I 型糖尿病的治疗在体内诱导较体外彻底,细胞比例高于体外,能显著降低糖尿病小鼠血糖水平,说明糖尿病小鼠体内特殊环境有利于ICCs向细胞分化。成体干细胞 adult stem cells不同种类的干细胞具有各自的优势和不足。1,糖尿病小鼠体内微环境对ICCs的定向诱导分化作用,可能使糖尿病的干细胞治疗成为可能。不同种类的干细胞具有各自的优势和不足。以移植细胞仍然是容易受到攻击。(2)自身免疫反应肿瘤干细胞(cancer stem cell)理论认为干细胞与

25、癌细胞在增殖调节机制方面有着相同的信号途径和调控因子,癌症可能起源于异常活化的干细胞。(2)通过病毒介导或者其他的方式将若干多个多能性相关的基因导入宿主细胞;(3)将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上,并于ES细胞专用培养体系中培养,同时在培养中根据需要加入相应的小分子物质以促进重编程;因此即使自身的干细胞移植,可以避免异体免疫排斥,可能仍会遭遇自身免疫反应。的cells 能够保存并发挥分泌功能,治疗糖2013 年,美国 Mitalipov 研究团队将人类皮肤成纤维细胞核移植到供体去核卵细胞中,成功建立了 SCNT 的hES 细胞,标志着治疗性克隆又向前迈出关键性的一步。基因导入使其表达胰岛素

26、 细胞移植(2)自身免疫反应糖尿病小鼠模型制作(腹腔注射链脲佐菌素 STZ)肾膜下移植 ICCs 治疗糖尿病挑战1型糖尿病是一种自身免疫性疾病,所STZ 处理3天后所有NOD-Scid 小鼠出现高血糖,移植4天后小鼠血糖水平下降至接近正常并保持稳定至40天,未移植的小鼠保持高血糖。(1)干细胞诱导分化的不彻底性有待解决。以移植细胞仍然是容易受到攻击。胚胎干细胞 诱导分化成 细胞 细胞移植23结论 从人胎胰分离的从人胎胰分离的 nestin nestin 阳性细胞表达阳性细胞表达ABCG2ABCG2,具有干细胞特性,在体外能诱导分化成,具有干细胞特性,在体外能诱导分化成有功能的有功能的细胞,移植至糖尿病小鼠体内可产生细胞,移植至糖尿病小鼠体内可产生胰岛素、降低血糖水平。胰腺干细胞有着用作细胰岛素、降低血糖水平。胰腺干细胞有着用作细胞治疗的前景,但不少问题(安全性问题、免疫胞治疗的前景,但不少问题(安全性问题、免疫排斥问题等)有待进一步研究,到临床应用还有排斥问题等)有待进一步研究,到临床应用还有一段路要走。一段路要走。

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