1、培训课件食品中大肠菌群的测定GB 一、目的1、了解大肠菌群的定义及食品中大肠菌群测定在食品卫生检验中的意义。2、练习并掌握大肠菌群的检验方法。二、原理1、大肠菌群大肠菌群系指一群在一定条件下（37、24小时）能够发酵乳糖、产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化鉴定试验，可将大肠菌群细分为大肠埃希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。另一种说法：（主要由肠杆菌科中埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属的一部分及沙门氏属的亚属细菌组成。）2、测定的意义该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品
2、的卫生质量，推断食品中是否有肠道致病菌污染的可能性，具有广泛的卫生学意义。食品中大肠菌群数系以每1g（或mL）检样内大肠菌群最可能数MPN（themostprobablenumber-简称MPN）表示3大肠杆菌的生物学特性基本形态：此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。在普通营养琼脂上有3中菌落形态：1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；2）粗糙型：菌落扁平、干
3、涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝；3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。培养特性：大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37，在42-44条件下仍能生长，生长温度范围15-46。三、材料1、食品样品乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。2、阳性对照菌大肠杆菌3、仪器设备除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱、恒温水浴箱、均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、无菌培养皿、菌落计数器等。4、培养基和试剂月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VR
4、BA)、无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液、1mol/L氢氧化钠（NaOH)、1mol/L 盐酸（HCL)。四、检验方法第一法 大肠菌群MPN计数法。第二法 大肠菌群平板计数法。大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。应取典型菌落，如无应多取几个菌落，以免出现假阳性。月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA)、无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液、1mol/L氢氧化钠（NaOH)、1mol/L盐酸（HCL)。具有金属光泽的深紫黑色菌落；（1）固体和半固体样品（3）平板菌落数的选择在生理盐水中自凝；该菌主要来源于人畜粪便，故以
5、此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中是否有肠道致病菌污染的可能性，具有广泛的卫生学意义。1、了解大肠菌群的定义及食品中大肠菌群测定在食品卫生检验中的意义。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。用接种环从所有48h2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB）肉汤管中，361培养48h2h，观察产气情况。大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。第一法大肠菌群MPN计数法典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。（5）大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以（3）中计数的平板菌落数，再乘以
6、稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。培训课件食品中大肠菌群的测定GB恒温培养箱、恒温水浴箱、均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、无菌培养皿、菌落计数器等。根据进一步的生化鉴定试验，可将大肠菌群细分为大肠埃希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。最适生长温度为37，在42-44条件下仍能生长，生长温度范围15-46。5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCI）调节。试验流程第一法 大肠菌群MPN计数法1、样品的稀释（1）固体和半固体样品称取25g 样品，放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均
7、质杯内，8 000r/min-10000r/min 均质1 min-2 min，或放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min-2 min，制成1:10 的样品匀液。（2）液体样品以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。（3）样品匀液的pH 值应在6.5-7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH）或1 mol/L 盐酸（HCI）调节。（4）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液
8、或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。（5）、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。2、初发酵试验每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤）,361 培养24h2h，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继
9、续培养至48h2h。记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。3、复发酵试验用接种环从所有48h2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB）肉汤管中，361 培养48h2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。煌绿乳糖胆盐(BGLB）肉汤管4、大肠菌群最可能数（MPN）的报告根据大肠菌群阳性管数，检索MPN 表（见下页表)，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN 值。注意：当检样的量与表中的量有增加或减少时，表内的数也应相应减少或增加。3、接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1
10、ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤）,361培养24h2h，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h2h。4、大肠菌群最可能数（MPN）的报告光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；大肠菌群在去氧胆酸钠琼脂上的典型特征应取典型菌落，如无应多取几个菌落，以免出现假阳性。根据进一步的生化鉴定试验，可将大肠菌群细分为大肠埃希氏菌（俗称大肠杆
11、菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。用接种环从所有48h2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB）肉汤管中，361培养48h2h，观察产气情况。5、对初发酵时未产气的发酵管有疑问时，可用手轻轻敲动或摇动试管，如有气泡沿管壁上升，应考虑有气体产生，做进一步试验。大肠杆菌在MFC琼脂上的典型特征这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。大肠杆菌0157显色培养基上的菌落（2）及时将15mL-20mL冷至46的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。产气者，计为大肠菌群阳性管。大肠杆菌合成代谢能力强，在含无
12、机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。（1）选取2个3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1mL。这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。结果报告：MPN 表大肠杆菌0157显色培养基上的菌落在伊红美兰乳糖琼脂（EMB）上 大肠菌群在去氧胆酸钠琼脂上的典型特征典型菌落为红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为 2-3mm 或更大。大肠菌群在结晶紫中性红琼脂(VRBA)上典型特征 典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为 0.5mm 或更大。大肠杆菌在MFC琼脂上的典型特征 试验流程1、样品的稀释按第一法中的稀释方法进行。2、平板计数（1）选取2个3个适宜
13、的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1mL。同时分别取1mL生理盐水加入两个无菌平皿作空白对照。（2）及时将15 mL-20mL冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL-4mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，置于36l 培养18h-24h。（3）平板菌落数的选择选取菌落数在15-150 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。结晶紫中性胆盐琼脂（4）、证实试验 从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典
14、型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，361 培养24h-48h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。根据进一步的生化鉴定试验，可将大肠菌群细分为大肠埃希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。具有金属光泽的深紫黑色菌落；第一法大肠菌群MPN计数法具有金属光泽的深紫黑色菌落；翻转平板，置于36l培养18h-24h。培训课件食品中大肠菌群的测定GB约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；大肠菌群在结晶紫中性红琼
15、脂(VRBA)上典型特征用接种环从所有48h2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB）肉汤管中，361培养48h2h，观察产气情况。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。（3）平板菌落数的选择大肠杆菌0157显色培养基上的菌落4、大肠菌群最可能数（MPN）的报告3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。6、MPN检索表是采用三个稀释度九管法，较理想的结果是最低3管为阳性，最高3管为阴性。（2）及时将15mL-20mL冷至46的结晶紫中性红胆盐琼
16、脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。2、平板计数（5）大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以（3）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取 其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105 CFU/g（mL）。可疑菌落特点：具有金属光泽的深紫黑色菌落；不带或略带金属光泽的菌落；中心色较深的淡紫黑色菌落。三、注意事项1、第一步乳糖胆盐发酵试验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，初发酵阳性管，经过
17、后两步，有可能成为阴性。只做一步，会有相当多的合格样品作为不合格处理，应注意。2、胆盐可抑制革兰氏阳性菌的生长，有利于大肠杆菌的生长繁殖。3、接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。4、大肠菌群菌落在EMB琼脂上大多呈紫黑色有金属光泽或无金属光泽。应取典型菌落，如无应多取几个菌落，以免出现假阳性。一般平板上有较多的大肠杆菌典型菌落，且革兰氏染色为阴性，可做出判定。5、对初发酵时未产气的发酵管有疑问时，可用手轻轻敲动或摇动试管，如有气泡沿管壁上升，应考虑有气体产生，做进一步试验。6、MPN检索表是采用三个稀释度九管法，较理想的结果是最低3管为阳性，
18、最高3管为阴性。如无法估测样品中的菌数时，应做一定范围的稀释度。7、MPN检索表只提供了3个稀释度，若改用其它浓度时，表内数字应相应增加或减少。月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA)、无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液、1mol/L氢氧化钠（NaOH)、1mol/L盐酸（HCL)。5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCI）调节。（4）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL
19、无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。大肠杆菌0157显色培养基上的菌落大肠菌群在结晶紫中性红琼脂(VRBA)上典型特征在普通营养琼脂上有3中菌落形态：（5）、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。第一法大肠菌群MPN计数法。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。第二法大肠菌群平板计数法。4、大肠菌群最可能数（MPN）的报告1、了解大肠菌群的定义及食品中大肠菌群测定在食品卫生检验中的意义。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。在伊红美兰乳糖琼脂（EMB）上具有金属光泽的深紫黑色菌落；月桂基硫酸
20、盐胰蛋白胨（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA)、无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液、1mol/L氢氧化钠（NaOH)、1mol/L盐酸（HCL)。（4）、证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，361培养24h-48h，观察产气情况。（4）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。最适生长温度为37，在42-44条件下仍能生长
21、，生长温度范围15-46。光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；（1）固体和半固体样品5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCI）调节。不带或略带金属光泽的菌落；选取菌落数在15-150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；（2）及时将15mL-20mL冷至46的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。另一种说法：（主要由肠杆菌科中埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属的一部分及沙门氏属的亚属细菌组成。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，
22、菌落直径为0.例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤）,361培养24h2h，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h2h。应取典型菌落，如无应多取几个菌落，以免出现假阳性。5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCI）调节。大肠杆菌0157显色培养基上的菌落（1）固体和半固体样品具有金属光泽的深紫黑色菌落；第一法大肠菌群MPN计数法（
23、3）平板菌落数的选择第一法大肠菌群MPN计数法光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；典型菌落为红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。在生理盐水中自凝；只做一步，会有相当多的合格样品作为不合格处理，应注意。4、大肠菌群最可能数（MPN）的报告第一法大肠菌群MPN计数法。这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。应取典型菌落，如无应多取几个菌落，以免出现假阳性。3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。2、练习并掌握大肠菌群的检验方法。3、接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。应取典型菌落，如无应多取几个菌落，以免出现假阳性。这
24、些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。用接种环从所有48h2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB）肉汤管中，361培养48h2h，观察产气情况。（1）固体和半固体样品产气者，计为大肠菌群阳性管。大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。应取典型菌落，如无应多取几个菌落，以免出现假阳性。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCI）调节。CFU/g（mL）。第二法大肠菌群平板计数法。典型菌落为紫红色,菌落
25、周围有红色的胆盐沉淀环。1、第一步乳糖胆盐发酵试验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，初发酵阳性管，经过后两步，有可能成为阴性。除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；（5）大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以（3）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。在普通营养琼脂上有3中菌落形态：（3）平板菌落数的选择培训课件食品中大肠菌群的测定GB应取典型菌落，如无应多取几个菌落，以免出现假阳性。2、练习并掌握大肠菌群的检验方法。光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；5、对初发酵时未产气的发酵管有疑问时，可用手轻轻敲动或摇动试管，如有气泡沿管壁上升，应考虑有气体产生，做进一步试验。大肠杆菌0157显色培养基上的菌落（3）平板菌落数的选择第一法大肠菌群MPN计数法3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。具有金属光泽的深紫黑色菌落；典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCI）调节。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。谢谢!
