1、1.什么是微生物：什么是微生物：微生物（微生物（microorganism,microbe）是一类个体微小、）是一类个体微小、结构简单，肉眼不可见或看不清楚的微小生物的统称结构简单，肉眼不可见或看不清楚的微小生物的统称。2.微生物的特点：微生物的特点：个体微小，结构简单个体微小，结构简单:细胞大小以微米和纳米计量。细胞大小以微米和纳米计量。种类繁多、分布广泛种类繁多、分布广泛：一克沃土中含菌量高达几亿甚至几一克沃土中含菌量高达几亿甚至几十亿十亿 生长繁殖快，代谢能力强生长繁殖快，代谢能力强：大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli）在适宜的条件下，每在适宜的条件下，每20分钟即繁殖
2、一代，分钟即繁殖一代，24小时即可繁殖小时即可繁殖72代。代。遗传稳定性差，容易发生变异遗传稳定性差，容易发生变异：自发突变频率为自发突变频率为10-6左左右右18841884年丹麦医师年丹麦医师GramGram所发明所发明 真细菌根据细胞壁结构分为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌真细菌根据细胞壁结构分为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌革兰氏阳性菌（G+）细胞壁结构革兰氏阴性菌（G-）细胞壁结构脂多糖的结构模型O-特异侧链核心多糖类脂A内毒素热源质2、菌落（菌落（colony）：）：单个单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形
3、成的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可肉眼可见见的、的、有一定形态结构的有一定形态结构的子细胞生长群体。子细胞生长群体。菌落菌落单位为单位为CFU(Colony-Forming Units)。众多菌落连成一片菌苔（lawn）通常情况下，纯培养能较好地被研究、利用和重复结果，通常情况下，纯培养能较好地被研究、利用和重复结果，因此，把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、因此，把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是微生物学研究的基础。纯化出来的纯培养技术是微生物学研究的基础。适应期对数增长期稳定期衰亡期酵母菌是对一类单细胞真菌的通称；酵母菌是对一
4、类单细胞真菌的通称；有球形、卵形、椭圆形、圆柱形等；有球形、卵形、椭圆形、圆柱形等；大小在大小在5-20 mm湿干薄而小薄而小厚而大厚而大密而小密而小厚而大厚而大细菌细菌酵母酵母放线菌放线菌霉菌霉菌酵母菌计数培养基计数培养基 控制菌检查用控制菌检查用培养基培养基 1.2.1培养基适用性检查的基础培养基适用性检查的基础一、对照培养基一、对照培养基 系指按培养基处方系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查。由中国药品生物培养基适用性检查。由中国药品生物制品检定所研制及分发。制品检定所研制及分发。1.2.2 计数培养基适用性检查计数培养基适用性
5、检查 大肠埃希菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 白色念珠菌白色念珠菌 黑曲霉黑曲霉 白色念珠菌白色念珠菌营养琼脂培养基营养琼脂培养基Nutrient Agar(NA)玫瑰红钠琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基 酵母浸出粉胨葡萄糖酵母浸出粉胨葡萄糖 琼脂培养基琼脂培养基（YPD）Yeast Peptone Dextrose Agar 50-100CFU 1.2.2 计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查 结果判定结果判定 被检培养基上的菌落平均数被检培养基上的菌落平均数 对照培养基上的菌落平均数对照培养基上的菌落平均数 菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致菌落形态
6、大小应与对照培养基上的菌落一致 70%1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养基适用性检查 促生长能力促生长能力 抑制能力抑制能力 指示能力指示能力 检查项目检查项目1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养基适用性检查 促生长能力检查促生长能力检查增菌培养基促生长能力检查：增菌培养基促生长能力检查：分别接种不大于分别接种不大于100cfu 的试验菌于被检培的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及的培养温度及最短培养时间最短培养时间下培养。与对照培下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管养基管比较
7、，被检培养基管试验菌应生长良好。试验菌应生长良好。培养基基本要求培养基基本要求1.2.3 控制菌控制菌检查用培养基适用性检查检查用培养基适用性检查 促生长能力检查促生长能力检查固体培养基促生长能力检查：固体培养基促生长能力检查：取试验菌各取试验菌各0.1ml（含菌数（含菌数50100cfu）分别分别涂布涂布于被检培养基和对照培养基平板上，于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基生长的时间下培养。被检培养基与对照培养基生长的菌落大小形态特征应一致。菌落大小形态特征应一致。培养基基本要求培养基
8、基本要求1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养基适用性检查 抑制能力检查抑制能力检查培养基抑制能力检查：培养基抑制能力检查：接种不少于接种不少于100cfu 的试验菌于被检培的试验菌于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及度及最长时间最长时间下培养，下培养，试验菌应不得生长。试验菌应不得生长。针对选择性培养基：胆盐乳糖培养基、胆盐乳糖发酵针对选择性培养基：胆盐乳糖培养基、胆盐乳糖发酵培养基、四硫磺酸亮绿培养基；（金黄色葡萄球菌）培养基、四硫磺酸亮绿培养基；（金黄色葡萄球菌）溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基，亚碲酸盐肉汤培养溴化十六烷基三
9、甲胺琼脂培养基，亚碲酸盐肉汤培养基、卵黄氯化钠琼脂培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基、卵黄氯化钠琼脂培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基，念珠菌显色培养基。（大肠埃希菌）基，念珠菌显色培养基。（大肠埃希菌）1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养基适用性检查 指示能力检查指示能力检查固体培养基指示能力检查：固体培养基指示能力检查：取试验菌各取试验菌各0.1ml（含菌数不大于（含菌数不大于100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。养。被检培养基中试验菌生长
10、的菌落形态、大被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。针对鉴别培养基针对鉴别培养基1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养基适用性检查 指示能力检查指示能力检查液体培养基指示能力检查：液体培养基指示能力检查：分别接种不大于分别接种不大于100cfu 的试验菌于的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。培养。与对照培养基管比较，被检培养基与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长情况、指示
11、剂反应等应与对管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。照培养基一致。针对鉴别培养基针对鉴别培养基大肠杆菌在伊红美蓝琼脂大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB，曙红亚甲蓝，曙红亚甲蓝)上典型特征上典型特征黑曲霉和白色念珠菌在玫瑰红钠琼脂黑曲霉和白色念珠菌在玫瑰红钠琼脂Rose Bengal Agar上典型特征上典型特征金黄色葡萄球菌在甘露醇氯化钠金黄色葡萄球菌在甘露醇氯化钠Mannitol Salt Agar琼脂上典型特征琼脂上典型特征沙门氏菌在沙门氏菌在SS琼脂上琼脂上沙门氏菌在沙门氏菌在BS琼脂（亚硫酸铋琼脂）上琼脂（亚硫酸铋琼脂）上培养基质量控制（培养基质量控制（2019版药典）版药典）
12、实验室配制的培养基的常规监控项目实验室配制的培养基的常规监控项目pH 适用性检查试验适用性检查试验 定期的稳定性定期的稳定性 检查以确定有效期检查以确定有效期 中国医学菌种保藏中心提供的标准菌株 美国国家菌种保藏中心提供的标准菌株 法国生物梅里埃公司提供的商业派生菌株（Bioball)低温冷冻保藏的标准储备菌株低温蜡封保藏的标准储备菌株 我所制备的工作菌株干热灭菌：160-180 2h高压蒸汽灭菌(湿热灭菌)：121 15-30min试管、瓶子、培养皿等常用的灭菌方法：常用的器具：无菌环境的保证：无菌室：万及洁净区 净化工作台：万及洁净区下的局部百级 酒精灯：外焰温度最高，r=5cm的球形区为
13、无菌区1）无菌环境）无菌环境微生物的环境器皿及培养基的无菌操作者的外界环境及操作过程的无菌（环境及操作的无菌）2）无菌操作无菌操作火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行2.划线接种，分离纯化划线接种，分离纯化Inoculating an agar plate to obtain single colonies 菌落总数的测定方法（活菌计数法），主要步骤为：菌落总数的测定方法（活菌计数法），主要步骤为：将样品制作成将样品制作成10倍梯度的稀释液，选择倍梯度的稀释液，选择3个合适的稀释个合适的稀释度，吸取度，吸取1mL于平皿，倾注培养基后，培养观察，计数。于平皿，倾注培养基后，培养观察，计数。对对霉菌霉菌
14、的计数，还可以采用显微镜的计数，还可以采用显微镜直接镜检直接镜检计数的方法计数的方法使用郝氏计测玻片使用郝氏计测玻片。酵母菌酵母菌的总数测定，可采用血球计数板进行显微镜的总数测定，可采用血球计数板进行显微镜直接镜检直接镜检计数。计数。酵母菌的酵母菌的死活死活鉴定可以通过鉴定可以通过0.1%的美兰染液染色的美兰染液染色2-3min完完成，活菌不着色。成，活菌不着色。与与CP一致一致1 要求每片滤膜上的菌落数要求每片滤膜上的菌落数 应不超过应不超过100个。个。2 平皿法菌数报告规则平皿法菌数报告规则 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30300之间、霉菌平均菌落数在之间
15、、霉菌平均菌落数在30100之间的稀释级，作为菌数报告之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。（取两位有效数字）的依据。3 仅有仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。以稀释倍数的值报告菌数。当同时有当同时有2个稀释级的菌落符合上述规个稀释级的菌落符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于2，以两稀释级的
16、菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比值大于当出现比值大于5或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。各稀释级的平均菌落数均小于新验证。各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的落数乘以稀释倍数的 值报告。值报告。4 所有稀释度均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，所有稀释度均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于但平均菌落数小于1时，以时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
