1、123世界卫生组织报道：l目前全球有近1/3的人已感染结核杆菌，也就是20亿人口感染了结核菌。l全球有活动性肺结核病人约2000万，l每年新发结核病人约800-1000万，l每年约有300万人死于结核病。l结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。6结核病实验诊断方法结核病实验诊断方法概 况7主要实验诊断方法涂片镜检法LJ培养法快速培养法免疫法分子生物法噬菌体法8涂片镜检法涂片镜检法 快速 检出率：低，漏诊率高 便宜 无法鉴别死活菌 需进一步鉴定9LJ培养法培养法 结核菌检验的金标准 检测周期超长：约8周 灵敏度：一般，有一定比率假阳性 价格一般 各种分枝杆菌均能生长 需进一步鉴定1
2、0 液体培养 检测周期较长，但比 LJ培养快 灵敏度：较LJ高，污染率较高 价格：专用仪器，专用试剂，价格高 各种分枝杆菌均能生长 需进一步鉴定快速培养检测法快速培养检测法BD BACTEC MGIT 960 培养系统培养系统BacT ALERT 3D培养系统培养系统液体变色培养基液体变色培养基11免疫学方法免疫学方法酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）免疫渗滤试验（免疫渗滤试验（DIGFA）免疫层析试验（免疫层析试验（DICA）快速 灵敏度：低，有一定的假阳性和假阴性 特异性差 费用：一般 结核菌的抗原性较弱 结果判断带有主观性 缺乏有效的质控手段12分子法分子法核酸探针杂交核酸
3、探针杂交碱基序列测定碱基序列测定结核杆菌结核杆菌DNA扩增法扩增法PCR结核杆菌结核杆菌DNA链置换扩增法链置换扩增法-SDA结核杆菌结核杆菌RNA扩增法扩增法Gen-Probe基因芯片检测基因芯片检测 13 需要昂贵的仪器设备，检测成本较高，需要昂贵的仪器设备，检测成本较高，芯片制备比较复杂，样品的准备与标记又较为繁琐芯片制备比较复杂，样品的准备与标记又较为繁琐 基因芯片上原位合成探针难免有错误核苷酸掺入，基因芯片上原位合成探针难免有错误核苷酸掺入，使整个杂交背景增高，降低特异性。使整个杂交背景增高，降低特异性。其信号检测的灵敏度也有待于进一步提高。其信号检测的灵敏度也有待于进一步提高。14
4、 WHO的目标：70%检出率15 检出率低的全球性问题检出率低的全球性问题 诊断依靠诊断依靠“传统的技术传统的技术”症状症状-经常和其它病兆混淆经常和其它病兆混淆 涂片镜检涂片镜检 灵敏度低灵敏度低 培养法培养法 时间长时间长 免疫法灵敏度低，有交叉反应免疫法灵敏度低，有交叉反应 分子法：复杂，昂贵，难于推广分子法：复杂，昂贵，难于推广 X-ray X-ray 没有特定的判读标准没有特定的判读标准16 目前急需一种快速、目前急需一种快速、准确、经济、易推广的结准确、经济、易推广的结核分枝杆菌检测方法核分枝杆菌检测方法17 特异性高 敏感度高 快速 易操作 节约成本18FASTPlaque TB
5、 TM 结核诊断的创新性突破结核诊断的创新性突破19l 快速 痰标本处理后，仅24小时就报告结果l 灵敏 检测下限可达100300 cfu/mll 准确 只检出活的结核分枝杆菌l 简单 常规操作，极易掌握l 方便 肉眼直接判读结果，无需显微观察l 安全 不滋长活体感染源l 可检出大量涂片漏诊患者l 可用于HIV高危人群的鉴别诊断20检测原理检测原理21 病毒病毒核酸衣壳只能只能在活的在活的易感易感細細胞胞內生長內生長溶原性感染和溶菌性感染溶原性感染和溶菌性感染22 先以特异性噬菌体感染、裂解标本中的结核分枝杆菌，再用杀病毒剂清除所有未感染MTB的噬菌体，而结核分枝杆菌胞内的噬菌体继续扩增，进而
6、裂解细胞，释放噬菌体。裂解释放的噬菌体感染随即添加的敏感细胞，在其胞内扩增并裂解敏感细胞，敏感细胞菌苔上肉眼可见的噬菌斑。如待检标本不含结核分枝杆菌，噬菌体被杀病毒剂完全清除，故无噬菌体感染敏感细胞，敏感细胞菌苔上无噬菌斑出现。结核分枝杆菌敏感细胞敏感细胞敏感细胞敏感细胞杀病毒剂杀灭未感染MTB的噬菌体MTB裂解,释放出来的噬菌体感染敏感细胞噬菌体感染结核分枝杆菌产生噬菌斑23质控 阳性对照 20个噬菌斑 阴性对照 10个噬菌斑阴性：无噬菌斑阳性：可数噬菌斑阳性：噬菌斑部分融合阳性：噬菌斑完全融合标本 阳性结果 50个噬菌斑 阴性结果 19个噬菌斑 可疑结果 20-50个噬菌斑24l可检测痰液
7、、胸水、腹水、脑脊液、尿、骨髓等多种标本l用于结核病的实验诊断l抗痨治疗效果的评价尤其是初诊病人的鉴别诊断l用于结核菌耐药性的快速检测l用于HIV高危人群的鉴别诊断25试验方法试验方法26痰标本处痰标本处 理理准备质控准备质控检测标本检测标本判判 读读结结 果果试验准备：试剂配制、制备培养基等试验准备：试剂配制、制备培养基等痰标本痰标本胸水胸水/腹水腹水/脑脊液脑脊液/尿等尿等检测流程检测流程27超净工作台（最好使用生物安全柜）旋涡振荡器冷藏箱（04）离心机可供高压消毒的容器水浴设备（60）电炉或微波炉高压蒸汽灭菌设备恒温培养箱（37）90mm无菌培养皿移液枪及配套枪头生物安全罩衣、一次性手套
8、、一次性容器等 28二、试验准备二、试验准备1、pH6.8磷酸缓冲液2、配制4 NaOH（或NALC-NaOH）3、准备试剂盒 A液：C液：D液 E液 F液 G液4、其它：FASTPlaqueTB培养基干粉FPTB 培养液25C 可保存4周270ml 净化水临用前，将 FPTB营养添加剂倒入冷培养液中FPTB 增强培养液，2-8 C下可保存4周 121C高压消毒器121 C,10minFPTB 营养添加剂FASTPlaqueTB琼脂干粉高压消毒器121 C,10minFPTB 琼脂60ml 净化水25C 下可保存4周使用前 55 C保存加热融化(微波炉,水浴 或 直接加热）水浴 121C31C
9、液噬菌体冻干粉（Actiphage）敏感细胞冻干粉（Sensor cells）无菌净化水杀病毒剂（Virusol）5ml11ml1.1ml2-8C下可保存下可保存7天天32每次试验均应设立阴性对照、阳性对照阴性对照 阴性对照检测杀病毒剂Virusol 的有效性 设置方法：C液阳性对照 阳性对照检测噬菌体 Actiphage 和敏感细胞 Sensor cells 的有效性设置方法：敏感细胞用C液稀释106倍33E液阳性对照各加10 ml C液0.1 ml0.1 ml0.1 ml1 ml C液 阴性对照1 ml34三、标本要求及前处理三、标本要求及前处理(痰液痰液)标本要求标本应为未进行抗结核治疗
10、的初诊疑似患者标本 痰处理的必要性去污染：抑制某些污染细菌，以防止其在平板上过度生长痰液液化：使标本更易于操作，释放TB杆菌，并使TB杆菌 更易为特异性噬菌体感染浓缩MTB细胞去除痰液中某些抑制因子35l室温下用NALC-NaOH 处理 痰液15 minl磷酸缓冲液加至45ml中和l4000 rpm 离心 15 minl弃去上清液l用C液15 ml 洗涤l4000 rpm 离心 15 minsl弃去上清液l用 C液 1 ml 重悬36NALC-NaOH 溶液室温静置 15 min加等体积 NALC-NaOH 溶液旋紧盖子后漩涡振荡 15 s 将痰液从痰瓶中转移至离心管中痰标本消化方法痰标本消化
11、方法37磷酸缓冲液加磷酸缓冲液至体积为 45ml4000rpm 离心 15 分钟弃去上清液加 15ml C液C液请勿让标本在磷酸缓冲液中停留过长时间38弃去上清液4000 rpm离心 15分钟C液 1ml转移至反应管中用 1ml C 液悬浮0.1ml D液39四、检测过程四、检测过程1、分别加0.1ml 试剂D溶液于阳性对照、阴性对照及标本中，轻轻摇晃，确保试管内容物位于试管底部，37孵育60分钟。痰处理痰处理0.1ml D液37孵育60min0.1ml D液400.1ml F液2、分别加0.1ml试剂F溶液于阳性对照、阴性对照及标本中，充分混匀（确保杀病毒剂与反应管内壁完全接触），置于室温置
12、于室温5-7分钟（严格控制时间）。分钟（严格控制时间）。室温室温5分钟分钟413、分别加5 ml C液于阳性对照、阴性对照及标本中，颠倒混匀一次。4、分别加1 ml 试剂E溶液于阳性对照、阴性对照及标本中。5ml C 液1 ml E 液425、将标本、阳性对照，阴性对照分别倒入相应的培养皿。6、立即将冷却至552的试剂G 5ml 于培养皿中，快速混匀。置于室温定型。7、倒置于37培养箱中培养，1824小时判读结果。43结果判定标准结果判定标准44FASTplaqueTBTM检测质控（对照），噬菌斑数应在如下范围 阳性对照 20 个噬菌斑 阴性对照 10个噬菌斑FASTplaqueTBTM检测临
13、床标本，噬菌斑数应在如下范围：阳性结果 50个噬菌斑 阴性结果 19个噬菌斑 可疑结果 20-50个噬菌斑45阴性：阴性：无噬菌斑无噬菌斑阳性：阳性：可数噬菌斑可数噬菌斑阳性：阳性：噬菌斑部噬菌斑部分融合分融合阳性：阳性：噬菌斑完噬菌斑完全融合全融合46评评 价价一、技术评价一、技术评价二、临床评价二、临床评价47l灵敏性-可以检出低浓度的 MTBl 标本MTB浓度100300cfu/ml即可检出l特异性-只检测活的 MTB 噬菌体法仅对结核分枝杆菌复合群敏感，对其它非结核分枝杆菌、非分枝杆菌均不敏感。l快速 -48h内出结果简便 -不需任何特殊仪器48结核分枝杆菌复合群结果非结核分枝杆菌结果
14、非分枝杆菌结果 结核分枝杆菌阳性阳性 瘰疠分枝杆菌阴性金黄色葡萄球菌阴性 牛分枝杆菌阳性阳性鸟分枝分枝杆菌阴性表皮葡萄球菌阴性 非洲分枝杆菌阳性阳性戈登分枝杆菌阴性链球菌阴性 田鼠分枝杆菌阳性阳性偶然分枝杆菌阴性肺炎双球菌阴性龟分枝杆菌阴性肠球菌阴性草分枝杆菌阴性绿脓杆菌阴性蟾蜍分枝杆菌阴性变形杆菌阴性淡黄色分枝杆菌阴性胞内分枝杆菌阴性胃内分枝杆菌阴性爱知分枝杆菌阴性无色分枝杆菌阴性金色分枝杆菌阴性苏尔加分枝杆菌阴性抗热分枝杆菌阴性马尔摩分枝杆菌阴性母牛分枝杆菌阴性49国内临床评价国内临床评价 1、中国、中国CDC结核防治中心结核防治中心 2、解放军三、解放军三O九医院九医院 3、上海市肺科医
15、院、上海市肺科医院 4、无锡市传染病医院、无锡市传染病医院50（资料来源：中国CDC结核病防治临床中心）各方法检测结核分枝杆菌结果比较各方法检测结核分枝杆菌结果比较 51检测方法检测方法阳性例数阳性例数阳性率阳性率（）（）P值值（与（与FTPTB法比较）法比较）涂片法涂片法5243.30.25FTTB法法8671.6几种方法检测结核分枝杆菌结果比较（检测例数均为120例）（资料来源：解放军三O九医院结核中心）标本类型标本类型检测例数检测例数阳性例数阳性例数阳性率（）阳性率（）涂片阳性涂片阳性524892.3涂片阴性涂片阴性683855.9FASTPlque TB法检测结核分枝杆菌结果 52标本
16、类型标本类型检测例数检测例数阳性例数阳性例数阳性率（）阳性率（）涂片阳性涂片阳性201995涂片阴性涂片阴性402050FASTPlaqueTB法检测结核分枝杆菌结果 阳性阳性阴性阴性阳性阳性34741阴性阴性51419合计合计392160BACTEC-460FASTPlaqueTB法法合计合计FPTB法与BACTEC-460法检测结核分枝杆菌结果比较（资料来源：上海市肺科医院）53检测方法检测方法阳性例数阳性例数阳性率（）阳性率（）P值（与值（与FPTB法比较）法比较）涂片法涂片法3942.90.01BACTEC-960法法61670.05FPTB法法5963.7几种方法检测结核分枝杆菌的结
17、果比较（资料来源：无锡市传染病医院）54l1、FASTPlaque法比涂片法和LJ培养法检出率更高；l2、FASTPlaque法与BACTEC-960、BACTEC-460法检出率无明显差别；l3、FASTPlaque法比LJ培养法和BACTEC-960快速培养法检测周期大大缩短，有助于真正实现结核病的快速诊断，是结核分枝杆菌检测技术的重大飞跃，值得广泛推广。55国外临床评价国外临床评价敏感度（）敏感度（）特异度（）特异度（）所有标本（所有标本（n=1618）72.599涂片阳性（涂片阳性（171）86.783.3涂片阴性（涂片阴性（1447）48.799.5 FASTPlaqueTB总特异性
18、99.0%，对涂阴及涂阳标本的检测特异性分别达99.5和83.3。该方法可从涂片阴性标本中检出48.7%的阳性病例，表明该方法可用于涂片阴性TB患者的快速检测。国际结核与肺疾病杂志2002年第6卷6期）56FPTB阳性阳性35（34MTB1MOTT*）2*37FPTB阴性阴性9（MOTT）95104总计总计4497141FPTB法检测痰标本的结果 FPTB法检测其它类型标本的结果快培阳性快培阳性快培阳性快培阳性总计总计FPTB阳性阳性11（MTB）011FPTB阴性阴性6（MOTT）1622总计总计171633*堪萨斯分枝杆菌；*MOTT：非结核分枝杆菌；（肯尼亚奈洛比地区Aga Khan医院
19、对FASTPlaqueTBTM试剂盒的临床评估）57 足够的信心 结果是真正的阳性显示特异性特异性阳性阳性阴性阴性（%）开普敦开普敦FPTB阳性阳性15014（1618例）例）FPTB阴性阴性571397卡拉奇卡拉奇FPTB阳性阳性2006（514例）例）FPTB阴性阴性45263培养培养9997.758大数量的NTMs提供了 一个竞争性的环境在巴塞罗那，30%的分支杆菌为NTMs噬菌体空斑法只检测出13%的NTMs总特异性非常高，保持在99.1%59比培养更具优势两天出结果检测活的菌比涂片更高的灵敏度60对涂片阴性标本的检出情况对涂片阴性标本的检出情况培养灵敏度（%）特异性（%）阳性阴性 开
20、普墩（n=1447）噬菌体阳性38748.799.5噬菌体阴性401362卡拉奇（n=332）噬菌体阳性47467.198.4噬菌体阴性23248 检测出约检测出约1/2到到2/3涂片漏检的阳性标本涂片漏检的阳性标本 高特异性保证了结果的更可信高特异性保证了结果的更可信61*资料来源肯尼亚、印度和埃及灵敏度灵敏度特异性特异性阳性阳性阴性阴性（%）（%）总标本数总标本数*FPTB阳性阳性563（218例）例）FPTB阴性阴性5154L-J培养培养91.898.162应应 用用1、临床初诊结核疑似病人的鉴别诊断、临床初诊结核疑似病人的鉴别诊断 肺结核、肠结核、肾结核、脑结核、脊髓结核、骨结核等 由
21、于本方法能快速、准确地检出活的结核分枝杆菌，且适用于包括痰液、胸水、腹水、尿、脑脊液、骨髓在内的多种类型标本，因此通过本方法检测结果可直接判定患者是否为活动性结核患者，无需进一步鉴定。如联合涂片法，检测效果更佳。63l一些权威的刊物资料提出噬菌体空斑法在肺部以外结核诊断中的时效作用高特异性高灵敏度 痰标本、淋巴组织切片和抽出物少数资料用某些类型标本如：脑脊液等642、用于抗痨效果观察、用于抗痨效果观察 由于检测结果噬菌斑数量与标本中所含MTB数量成正性相关，因此可通过噬菌斑数量变化，实验结果强阳性弱阳性阴性的转变来实时监控抗痨药物是否对症。653、从、从“结核病并发艾滋病结核病并发艾滋病”中检
22、出结核病患者中检出结核病患者 很多结核病高发国家，结核病并发艾滋病比例相当高肯尼亚有55%的结核病人并发艾滋病 FASTPlaqueTB法检出活的结核分枝杆菌 检测结果不受被艾滋病削弱的免疫反应影响664、用于涂片阴性疑似病例的确诊、用于涂片阴性疑似病例的确诊 涂片法检出率极低，造成大量结核患者漏诊 FASTPlaque TB 法可检出约1/22/3涂片漏检的阳性标本 从而防止结核病的扩散67l儿童时期结核进一步评估的需要68l噬菌体空斑法试验在地理上不同区域的应用用FastPlaqueTB鉴定，阳性标本的检出率约5884%，用时两天v在NTMs存在的情况下l结果可以作为优异预期值的指示l检测
23、痰涂片阴性病例联合痰涂片检测率可达8090%，用时两天l节约成本l艾滋病患者和肺部以外标本中有理想的结果69常 见 问 题70常见错误常见错误原原 因因采采 取取 措措 施施 杀病毒剂不足 搅拌不充分，未杀灭所有未感染的噬菌体 检查污染源 弃用所有可疑污染试剂 对所有可以仪器设备重新无菌化处理？阴性对照噬菌斑数大于10个 请参阅检测过程（7.2）培养基或仪器设备被MTB、敏感细胞污染或分枝杆菌噬菌体污染7172常见错误常见错误原原 因因采采 取取 措措 施施 标本消毒处理不够 请 参 考 样 品 准 备（6.1）标本从采集到检测时间间隔较长，导致微生物过度生长 请参考当地标本采集和运送相关规定 C液未回复到室温；琼脂温度过低？琼脂凝结性不好 按 操 作 说 明 进 行（7.2）？杂菌生长，平皿中敏感细胞模糊不清，噬菌斑不清晰？阳性率比预期值过低 标本处理过程太粗糙，如NaOH浓度过高或孵育时间过长等 请 参 考 标 本 处 理（7.1），严格按要求处理标本。73
