1、腹腔镜全子宫切除护理查房徐晓凤腹腔镜全子宫切除护理查房徐晓凤 人体基因数目仅比低等生物线虫多两倍。人体基因数目仅比低等生物线虫多两倍。如此少的基因是如何创造出人体如此复杂如此少的基因是如何创造出人体如此复杂的生命活动？的生命活动？人体基因的主要功能是通过蛋白质来实现人体基因的主要功能是通过蛋白质来实现的，的，蛋白质扮演着构筑生命大厦的主要角蛋白质扮演着构筑生命大厦的主要角色。色。人体中大约有人体中大约有1010万种蛋白质。万种蛋白质。测定蛋白质结构的意义测定蛋白质结构的意义vX-X-射线晶体衍射法：射线晶体衍射法：85.3%85.3%v核磁共振波谱：核磁共振波谱：14.7%14.7%v电镜三维
2、重构、各种光谱技术、显微电镜三维重构、各种光谱技术、显微 技术和计算机模拟技术和计算机模拟 l 1895年年11月月8日日,德国物德国物理学家，理学家，50岁的伦琴在岁的伦琴在自己的实验室中偶然发自己的实验室中偶然发现现 一种从阴极射线管一种从阴极射线管中辐射出的新型射线，中辐射出的新型射线，由于对管子发出的由于对管子发出的“东东西西”性质不确定，伦琴性质不确定，伦琴就把这种射线命名为就把这种射线命名为“X射线射线”。图片出处:伦琴实验室伦琴实验室核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance)，1969年，Greenfield用圆二色光谱数据估计了蛋白质的二级结构。血红蛋白的
3、四级结构 模型Bloch和哈佛大学的两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象，为此他们两人获1952年诺贝尔物理奖。核磁共振波谱仪原子核从激化的状态回复到平衡排列状态的过程叫弛豫过程。1126/science.利用液相平衡原理而设计的。1997年,核小体八组蛋白结构 2004年,菠菜捕光复合物LHC-II螺旋结构在靠近192nm有一正的谱带，在222和208nm处表现出两个负的特征肩峰谱带；易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结构信息;xa=80%,通过在待测结晶蛋白质溶液的体积、浓度和组成固定的条件下，直接将不同量的饱和沉淀剂加入未饱和的蛋白质溶液以产生一个浓度梯度而使蛋白质在不同的过
4、饱和溶液中结晶。这样就有无数二维的图像，彼此重叠后就得到样本内部空间的三维图像X-射线晶体衍射法、核磁共振波谱的关系直到1960年激光出现以后，由于激光具有高亮度、单色性和方向性好以及高偏振度等特点，非常适合作为拉曼光谱的激发光源，因而迅速为科研工作者所利用。1H-1H COSY、1H-15N HSQCNOE（核欧沃豪斯效应）信号强度具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生CD谱带的位置、吸收的强弱都不相同。人类第一张人类第一张X光照片光照片图片出处:伦琴妻子之手伦琴妻子之手 1896年年1月月23日伦日伦琴将这一重大发现在维琴将这一重大发现在维尔兹堡物理医学会上报尔兹堡物理医学会上报告。告。Ko
5、lliker教授提议教授提议将该射线命名为将该射线命名为“伦琴伦琴射线射线”,但伦琴却说但伦琴却说“我还没有彻底解释这我还没有彻底解释这种射线的发生现象，还种射线的发生现象，还是称它为是称它为X射线最恰射线最恰当。当。”威廉威廉康拉德康拉德伦琴伦琴 Wilhelm Conrad Rntgen离子源轰击样品带电荷的碎片离子电场加速(zeU)获得动能(mv2)磁场分离检测器记录1997年,核小体八组蛋白结构 2004年,菠菜捕光复合物LHC-IIExample fit:myoglobin(肌红蛋白)（1）批量结晶法（Batch crystallization）质谱分析(MS)的特点射线衍射用于蛋白
6、质结构的测定适于捕捉动态结构变化信息；2、蛋白质结晶和晶体生长2005年，线粒体膜蛋白复合物2精细结构1959年佩鲁茨(Perute)完成血红蛋白0.通过在待测结晶蛋白质溶液的体积、浓度和组成固定的条件下，直接将不同量的饱和沉淀剂加入未饱和的蛋白质溶液以产生一个浓度梯度而使蛋白质在不同的过饱和溶液中结晶。from：厦门大学生命科学学院蛋白质质谱分析原理为通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子,然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。1928年，印度物理学家拉曼(Raman)发现了
7、拉曼光谱，同时期的苏联物理学家兰斯伯格(G.原子核从激化的状态回复到平衡排列状态的过程叫弛豫过程。核磁共振本身不能展示样体的内部结构。当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。缺点只能测定单晶，反映静态结构信息，无法测定溶液中的信息核磁共振波谱仪血红蛋白的四级结构 模型因在用X射线研究晶体结构方面所作出的杰出贡献,亨利布拉格（William Henry Bragg）和劳伦斯布拉格（William Lawrence Bragg）父子分享了1915年的诺贝尔物理学奖。MS用于多肽和蛋白质测序可分为三种方法第一种方法称为蛋白图谱(prote
8、in mapping),它是使用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽的分子量,将所得肽谱数据输入数据库,搜索与之相对应的已知蛋白,从而获取待测蛋白序列；NMR可获得分子内各核的化学环境、核间的耦合关系、空间构象等信息，但是当分子较大的时候，由于裂分谱线间的重叠，因此在测定了同一种核的一维谱之后，需要了解两种或三种不同核之间的联系关系，如C-H，N-H等就需要用到2DNMR，它是2个频率变量的函数，吸收峰对2个频率变量作图。射线衍射用于蛋白质结构的测定X射线晶体结构分析基本原理蛋白质质谱分析原理为通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子,然后利用质谱分析仪的电场、磁
9、场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。亨利布拉格(Henry Bragg)xa=80%,当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。化学因素pH值、沉淀剂类型和浓度、添加剂、离子种类、离子强度、过饱和度、氧化还原环境、蛋白质浓度等()i是第i个二级结构成分的CD信号值，fi为第i个二级结构成分的含量分数，fi规定值为1；20世纪70年代解析一个蛋白质结构则可成根据电子跃迁能级能量的大小，蛋白质的CD光谱分为三个波长范围:1997年,核小体八组蛋白
10、结构 2004年,菠菜捕光复合物LHC-II优点分辨率高，能精确确定生物大分子中各原子的坐标、键长、键角,给出生物大分子的分子结构和构型,确定活性中心的位置和结构由于自旋裂分形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为自旋自旋耦合常数,用J表示。两极之间加有数万伏特的高电压，使电子流加速，向阳极A撞击而产生X射线。l1901年第一届诺贝尔物理学奖评选时，年第一届诺贝尔物理学奖评选时，29封推荐信中就有封推荐信中就有17封集中推荐他。伦封集中推荐他。伦琴最终获得了第一次诺贝尔物理学奖金琴最终获得了第一次诺贝尔物理学奖金图片出处 X射线本质射线本质 X射线是一种短波长射线是一种短波长(0.00510nm
11、)、高能量高能量(2.5105 1.2102eV)的电磁波。的电磁波。它是原子内层电子在高速运动电子流冲它是原子内层电子在高速运动电子流冲击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。l 一般由高速电子撞击金属产生。如图所示，是一种产生一般由高速电子撞击金属产生。如图所示，是一种产生X射线的真空管，射线的真空管，K是发射电子的热阴极，是发射电子的热阴极，A是由钼、钨或是由钼、钨或铜等金属制成的阳极。两极之间加有数万伏特的高电压，铜等金属制成的阳极。两极之间加有数万伏特的高电压，使电子流加速，向阳极使电子流加速，向阳极A撞击而产生撞击而产生X射线。射线。A优 缺 点多对同晶型置
12、换法(MIR)X射线是一种短波长(0.质谱分析目前主要测定一级结构，包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。由于测定出蛋白质的精细结构,两位英国科学家M.肌红蛋白的三维结构模型220-230(弱)，180-190（强）根据分子离子的质荷比可确定分子量及分子式。X射线晶体衍射技术要求蛋白质是晶体存在状态，而对一些柔性的、结构复杂的生物大分子蛋白质来说，比较难以得到所需的晶体结构。作用反映分子的结构信息。多波长反常散射法(MAD)易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结构信息;第三节 蛋白质结构测定的其他方法60MHz或100MHz。5nm的原子核时，如果用双共振法照射其中一个核
13、，使干扰场的强度增加到刚使被干扰的谱线达到饱和，则另一个靠近的原子核的共振信号就会增加，这种现象称核欧沃豪斯效应（NOE）。当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。6 Angstrom Resolution,10.质谱分析(MS)的特点核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance)，如果一个人知道了一间房子的所有尺寸，就可以画出房子的三维图形。平面偏振光、圆偏振光和椭圆偏振光XH+X+XR=1由于自旋裂分形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为自旋自旋耦合常数,用J表示。X射线衍射射线衍射l1912年年Max von
14、 Laue发现发现X射线具有衍射线具有衍射的现象。（射的现象。（1914年的诺贝尔物理学奖）年的诺贝尔物理学奖）图片出处图片出处:劳厄的实验装置劳厄的实验装置 图片出处图片出处:X X射线晶体结构分析基本原理射线晶体结构分析基本原理 l X射线衍射分析所依赖的基本原理是射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象射线衍射现象l X射线衍射现象利用射线衍射现象利用X射线的波长和晶体中原子的大小及射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。l 当当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原
15、子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。l 衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子距离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子的堆积、有序或无序的排列等。的堆积、有序或无序的排列等。X X射线通过红宝石晶体射线通过红宝石晶体(a)a)和硅单晶体和硅单晶体(b)b)所拍摄的劳厄斑所拍摄的劳厄斑图片出处图片出处:劳伦斯劳伦斯布拉格布拉格(Lawrence Bragg)因在用因在用X射线研究晶体结构方面所作出的杰出贡射线研究晶
16、体结构方面所作出的杰出贡献献,亨利亨利布拉格（布拉格（William Henry Bragg）和劳伦和劳伦斯斯布拉格（布拉格（William Lawrence Bragg）父子分享了父子分享了1915年的诺贝尔物理学奖。年的诺贝尔物理学奖。图片出处图片出处 图片出处图片出处http:/nobelprize.org/physics/laureates/1915/wl-bragg-bio.html l 20世纪世纪60年代解析一个蛋白质结构可以获年代解析一个蛋白质结构可以获 得诺贝尔奖；得诺贝尔奖；l 20世纪世纪70年代解析一个蛋白质结构则可成年代解析一个蛋白质结构则可成 为轰动世界的新闻；为轰
17、动世界的新闻；l 20世纪世纪80年代解析一个蛋白质结构则可申请到教授的职位；年代解析一个蛋白质结构则可申请到教授的职位；l 20世纪世纪90年代解析一个蛋白质结构通常可以获得博士学位；年代解析一个蛋白质结构通常可以获得博士学位；l 今天，一个博士研究生也许就可解析多个蛋白质结构，但如今天，一个博士研究生也许就可解析多个蛋白质结构，但如果没有深入研究其结构与功能的关系，往往不能毕业。果没有深入研究其结构与功能的关系，往往不能毕业。蛋白质结构解析的发展蛋白质结构解析的发展饶子和院士饶子和院士HIV基质蛋白基质蛋白 SARS射线衍射用于蛋白质结构的测定射线衍射用于蛋白质结构的测定l1954年伯纳尔
18、年伯纳尔(Bernal)获得第一张胃蛋白获得第一张胃蛋白酶晶体衍射图片。酶晶体衍射图片。l1957年肯特罗年肯特罗(Kendrew)完成肌红蛋白完成肌红蛋白的的0.6 nm分辨率的蛋白质晶体结构分辨率的蛋白质晶体结构图片出处:图片出处:肌红蛋白的三维结构肌红蛋白的三维结构 肌红蛋白的三维结构模型肌红蛋白的三维结构模型图片出处:图片出处:http:/1959年佩鲁茨年佩鲁茨(Perute)完成血完成血红蛋白红蛋白0.55分辨分辨率的晶体结构率的晶体结构图片出处:血红蛋白的四级结构血红蛋白的四级结构 模型模型图片出处 血红蛋白分子就是由二个由血红蛋白分子就是由二个由141个氨基酸残基组成的个氨基酸
19、残基组成的亚基和二个由亚基和二个由146个氨基酸个氨基酸残基组成的残基组成的亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子，每个亚基中亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子，每个亚基中各有一个含亚铁离子的血红素辅基。四个亚基间靠氢键和八个盐键维系着血红蛋各有一个含亚铁离子的血红素辅基。四个亚基间靠氢键和八个盐键维系着血红蛋白分子严密的空间构象。白分子严密的空间构象。由于测定出蛋白质的精细结构由于测定出蛋白质的精细结构,两位英国科两位英国科学家学家M.F.M.F.佩鲁茨和佩鲁茨和J.C.J.C.肯德鲁获得肯德鲁获得19621962年的诺年的诺贝尔化学奖。贝尔化学奖。图片出处：图片出处：1
20、997年年,核小体八组蛋白结构核小体八组蛋白结构 2004年年,菠菜捕光复合物菠菜捕光复合物LHC-II2005年，线粒体膜蛋白复合物年，线粒体膜蛋白复合物2精细结构精细结构X射线衍射测定蛋白和核酸精细结构，为新药设计提供了全新方向射线衍射测定蛋白和核酸精细结构，为新药设计提供了全新方向中国科学家研制抗癌新药首获瑞典爱明诺夫奖施一公抗癌抗乙肝病毒新药施一公抗癌抗乙肝病毒新药Birinapant，进入临床二期，进入临床二期蛋白质蛋白质X X射线晶体结构测定程序射线晶体结构测定程序 l 1、样品制备、样品制备 l 2、蛋白质结晶和晶体生长、蛋白质结晶和晶体生长 l 3、衍射数据收集和处理、衍射数据
21、收集和处理 l 4、位相求解、位相求解 l 5、模型建立和修正、模型建立和修正 由于自旋裂分形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为自旋自旋耦合常数,用J表示。这样就有无数二维的图像，彼此重叠后就得到样本内部空间的三维图像作用反映分子的结构信息。离子源轰击样品带电荷的碎片离子电场加速(zeU)获得动能(mv2)磁场分离检测器记录在蛋白质晶体中引入散射能力强的重金属原子如Pb和Hg等作为标志原子，制备出重原子的衍生物，然后求出这些重原子在晶胞中的坐标，根据坐标计算出重原子散射波在各个衍射点的相角，最后推测出蛋白质分子在各个衍射中的位相。（3）液相扩散法(Liquid diffusion)自旋自旋弛
22、豫 两个进动频率相同，进动取向不同的磁性核，在一定距离内时，它们相互交换能量，改变进动方向。蛋白质质谱分析原理为通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子,然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。核磁共振技术能测出溶液状态下分子量较小蛋白质的结构，但对分子量较大的蛋白质的数据处理显得比较复杂。74岁的美国科学家保罗劳特布尔和70岁的英国科学家彼得曼斯菲尔德为2003诺贝尔医学奖的得主这样就有无数二维的图像，彼此重叠后就得到样本内部空间的三维图像适于捕捉动态结构变化信息；蛋白质晶体生长
23、的影响因素蛋白质质谱分析原理为通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子,然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。NMR可获得分子内各核的化学环境、核间的耦合关系、空间构象等信息，但是当分子较大的时候，由于裂分谱线间的重叠，因此在测定了同一种核的一维谱之后，需要了解两种或三种不同核之间的联系关系，如C-H，N-H等就需要用到2DNMR，它是2个频率变量的函数，吸收峰对2个频率变量作图
24、。发明了利用核磁共振(NMR)技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法获得了2002年度诺贝尔化学奖X射线晶体衍射技术和核磁共振技术是当前蛋白质空间结构测定的主要方法，但它们都存在一些不足。1、样品制备、样品制备 l大量表达、分离和纯化目标蛋白大量表达、分离和纯化目标蛋白 一般要求纯度大于一般要求纯度大于97%，浓度达到浓度达到5mg/ml以上。以上。2、蛋白质结晶和晶体生长、蛋白质结晶和晶体生长 蛋白质结晶原理蛋白质结晶原理 与小分子结晶一样，蛋白质在溶液中处于与小分子结晶一样，蛋白质在溶液中处于过饱和状态时，分子间可以规则的方式堆过饱和状态时，分子间可以规则的方式堆积起来形成晶体析出积起来形
25、成晶体析出 蛋白质晶体生长的影响因素蛋白质晶体生长的影响因素l 物理因素温度、重力、压力、震动、时间、电场磁场、介物理因素温度、重力、压力、震动、时间、电场磁场、介质的电解质性质和粘度、均相或非均相成核等质的电解质性质和粘度、均相或非均相成核等 l 化学因素化学因素pH值、沉淀剂类型和浓度、添加剂、离子种类值、沉淀剂类型和浓度、添加剂、离子种类、离子强度、过饱和度、氧化还原环境、蛋白质浓度等、离子强度、过饱和度、氧化还原环境、蛋白质浓度等l l 生化因素蛋白质纯度、配合体、抑制剂、化学修饰、遗传生化因素蛋白质纯度、配合体、抑制剂、化学修饰、遗传修饰、蛋白质的聚集状态、蛋白质水解、蛋白质自身的对
26、修饰、蛋白质的聚集状态、蛋白质水解、蛋白质自身的对称性、蛋白质的稳定性和等电点等称性、蛋白质的稳定性和等电点等 蛋白质结晶方法蛋白质结晶方法（1）批量结晶法（）批量结晶法（Batch crystallization）（2）透析法）透析法(Dialysis)（3）液相扩散法液相扩散法(Liquid diffusion)（4）气相扩散法（气相扩散法（Vapour diffusion）（5）蛋白质结晶新方法蛋白质结晶新方法（1）批量结晶法（）批量结晶法（Batch crystallization）l通过在待测结晶蛋白质溶液的体积、浓度通过在待测结晶蛋白质溶液的体积、浓度和组成固定的条件下，直接将不同
27、量的饱和组成固定的条件下，直接将不同量的饱和沉淀剂加入未饱和的蛋白质溶液以产生和沉淀剂加入未饱和的蛋白质溶液以产生一个浓度梯度而使蛋白质在不同的过饱和一个浓度梯度而使蛋白质在不同的过饱和溶液中结晶。溶液中结晶。（2）透析法）透析法(Dialysis)l利用半透膜允许小分子透过而大分子不能利用半透膜允许小分子透过而大分子不能透过的性质来调节蛋白质溶液的沉淀剂浓透过的性质来调节蛋白质溶液的沉淀剂浓度、度、pH或离子强度，从而使蛋白质溶液缓或离子强度，从而使蛋白质溶液缓慢形成过饱和状态以形成晶核。该法是培慢形成过饱和状态以形成晶核。该法是培养蛋白质晶体的常用方法。养蛋白质晶体的常用方法。（3）液相扩
28、散法液相扩散法(Liquid diffusion)l利用液相平衡原理而设计的。由于蛋白质在利用液相平衡原理而设计的。由于蛋白质在不同溶液中的溶解度不同，把待结晶蛋白质不同溶液中的溶解度不同，把待结晶蛋白质溶液缓慢加入溶解性差异大的溶剂中，在界溶液缓慢加入溶解性差异大的溶剂中，在界面处形成沉淀剂浓度梯度在局部达到瞬间过面处形成沉淀剂浓度梯度在局部达到瞬间过饱和，从而促使晶核形成。饱和，从而促使晶核形成。（4）气相扩散法（气相扩散法（Vapour diffusion）l把待结晶蛋白质、高于此蛋白质结晶所需把待结晶蛋白质、高于此蛋白质结晶所需盐浓度的溶液和低于这种浓度的盐溶液放盐浓度的溶液和低于这种
29、浓度的盐溶液放在一个密闭体系内，两种浓度不同的溶液在一个密闭体系内，两种浓度不同的溶液由于发生蒸汽扩散最后达到平衡，随着溶由于发生蒸汽扩散最后达到平衡，随着溶液中沉淀剂浓度的增加蛋白质溶解性降低液中沉淀剂浓度的增加蛋白质溶解性降低，从而蛋白质达到过饱和而析出晶体。，从而蛋白质达到过饱和而析出晶体。核磁共振的序参数可测定该分子的可能移动范围或在其他结构内运动。折叠的CD光谱在216nm有一负谱带，在185200nm有一正谱带；线晶体衍射法适用于研究各种大小的蛋白质。蛋白质或多肽是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子，主要的光学活性生色基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫键，
30、另外，有的蛋白质辅基对蛋白质的圆二色性有影响。易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结构信息;NMR可获得分子内各核的化学环境、核间的耦合关系、空间构象等信息，但是当分子较大的时候，由于裂分谱线间的重叠，因此在测定了同一种核的一维谱之后，需要了解两种或三种不同核之间的联系关系，如C-H，N-H等就需要用到2DNMR，它是2个频率变量的函数，吸收峰对2个频率变量作图。X-射线晶体衍射法、核磁共振波谱的关系亨利布拉格(Henry Bragg)多对同晶型置换法(MIR)四个亚基间靠氢键和八个盐键维系着血红蛋白分子严密的空间构象。（1）批量结晶法（Batch crystallization）可以
31、直接获得分子的形貌信息，即使在较低分辨率下，电子显微学也可给出有意义的结构信息；射线衍射用于蛋白质结构的测定维特里希选择生物大分子中的质子(氢原子核)作为测量对象,连续测定所有相邻的2个质子之间的距离和方位,这些数据经计算机处理后就可形成生物大分子的三维结构图。发明了利用核磁共振(NMR)技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法获得了2002年度诺贝尔化学奖圆二色谱是利用不对称分子对左、右圆偏振光吸光率的不同来分析蛋白质的结构。20世纪70年代解析一个蛋白质结构则可成1912年Max von Laue发现X射线具有衍射的现象。（5）结晶新方法结晶新方法Nucleant 生物玻璃生物玻璃晶体初步鉴
32、定晶体初步鉴定偏光显微镜观察、染色、电泳等偏光显微镜观察、染色、电泳等3、衍射数据收集和处理、衍射数据收集和处理l第三代同步辐射光源的应用使得用第三代同步辐射光源的应用使得用2040 um大小的晶体解析高分辨率结构已经成为现大小的晶体解析高分辨率结构已经成为现实实l目前世界上比较著名的同步辐射工作站有目前世界上比较著名的同步辐射工作站有多个多个APS（USA）;ESRF（France）;SPring8（Japan）上海同步辐射中心上海同步辐射中心同步辐射光源同步辐射光源X射线通过红宝石晶体(a)和硅单晶体(b)所拍摄的劳厄斑1997年,核小体八组蛋白结构 2004年,菠菜捕光复合物LHC-II
33、 峰钝，一般可跨25个质量单位。衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子的堆积、有序或无序的排列等。浓度达到5mg/ml以上。因此，根据所测得蛋白质或多肽的远紫外CD谱，能反映出蛋白质或多肽链二级结构的信息，从而揭示蛋白质或多肽的二级结构。from：厦门大学生命科学学院X射线通过红宝石晶体(a)和硅单晶体(b)所拍摄的劳厄斑瑞士科学家库尔特维特里希则发明了“利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构法”。圆二色谱是利用不对称分子对左、右圆偏振光吸光率的不同来分析蛋白质的结构。（2）透析法(Dialysis)20世纪70年代解析一个蛋白质
34、结构则可成00510nm)、高能量(2.利用高灵敏底片进行成像记录1126/science.由于自旋裂分形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为自旋自旋耦合常数,用J表示。血红蛋白分子就是由二个由141个氨基酸残基组成的亚基和二个由146个氨基酸残基组成的亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子，每个亚基中各有一个含亚铁离子的血红素辅基。可以直接获得分子的形貌信息，即使在较低分辨率下，电子显微学也可给出有意义的结构信息；因在用X射线研究晶体结构方面所作出的杰出贡献,亨利布拉格（William Henry Bragg）和劳伦斯布拉格（William Lawrence Bragg）父子分享了1
35、915年的诺贝尔物理学奖。X-射线晶体衍射法：85.1H-1H COSY、1H-15N HSQCX射线晶体衍射技术和核磁共振技术是当前蛋白质空间结构测定的主要方法，但它们都存在一些不足。晶体收集和储存晶体收集和储存液氮气冷技术4、位相求解、位相求解 1.分子置换法分子置换法(MR)2.多对同晶型置换法多对同晶型置换法(MIR)3.多波长反常散射法多波长反常散射法(MAD)实验中经常联合使用实验中经常联合使用分子置换法分子置换法(MR)l分子置换法就是把已知结构的蛋白质分子分子置换法就是把已知结构的蛋白质分子放到待测蛋白质晶体的晶胞中建立起初始放到待测蛋白质晶体的晶胞中建立起初始结构模型并借助此
36、模型计算待测蛋白质晶结构模型并借助此模型计算待测蛋白质晶体各个衍射点的相角的方法。体各个衍射点的相角的方法。多对同晶型置换法多对同晶型置换法(MIR)l在蛋白质晶体中引入散射能力强的重金属在蛋白质晶体中引入散射能力强的重金属原子如原子如Pb和和Hg等作为标志原子，制备出重等作为标志原子，制备出重原子的衍生物，然后求出这些重原子在晶原子的衍生物，然后求出这些重原子在晶胞中的坐标，根据坐标计算出重原子散射胞中的坐标，根据坐标计算出重原子散射波在各个衍射点的相角，最后推测出蛋白波在各个衍射点的相角，最后推测出蛋白质分子在各个衍射中的位相。质分子在各个衍射中的位相。多波长反常散射法多波长反常散射法(M
37、AD)l利用同步辐射波长连续可变的特点，使用利用同步辐射波长连续可变的特点，使用一个重原子衍生物作为母体，用一个晶体一个重原子衍生物作为母体，用一个晶体就可以收集到重原子反常散射吸收边两侧就可以收集到重原子反常散射吸收边两侧的多套数据，并解出结构。的多套数据，并解出结构。5、模型建立和修正、模型建立和修正l晶体学晶体学R因子一般要求达到因子一般要求达到0.2以下以下l键长偏差大约为键长偏差大约为0.015l键角偏差约为键角偏差约为3l二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角构象是随机的外，其他残基的二面角构象构象是随机的外，其他残基的二面角构象分布受到立体化学的
38、限制分布受到立体化学的限制1985年,维特里希等人公布了第一次利用NMR 法测定的溶液中蛋白质蛋白酶抑制剂IIA(proteinase inhibitor IIA)的结构蛋白质或多肽是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子，主要的光学活性生色基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫键，另外，有的蛋白质辅基对蛋白质的圆二色性有影响。20世纪90年代解析一个蛋白质结构通常可以获得博士学位；蛋白质质谱分析原理为通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子,然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的M/Z值，
39、分析鉴定未知蛋白质。1永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。蛋白质三维结构解析方法X射线晶体衍射技术和核磁共振技术是当前蛋白质空间结构测定的主要方法，但它们都存在一些不足。伦琴最终获得了第一次诺贝尔物理学奖金然后利用冷冻电镜和低剂量成像技术对样品进行电子成像由于自旋裂分形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为自旋自旋耦合常数,用J表示。利用同步辐射波长连续可变的特点，使用一个重原子衍生物作为母体，用一个晶体就可以收集到重原子反常散射吸收边两侧的多套数据，并解出结构。核与核之间以价电子为媒介相互耦合引起谱线分裂的现象称为自旋裂分。1H-1H COSY、1H-15N H
40、SQC通过在待测结晶蛋白质溶液的体积、浓度和组成固定的条件下，直接将不同量的饱和沉淀剂加入未饱和的蛋白质溶液以产生一个浓度梯度而使蛋白质在不同的过饱和溶液中结晶。质谱分析目前主要测定一级结构，包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。晶体学R因子一般要求达到0.5nm的原子核时，如果用双共振法照射其中一个核，使干扰场的强度增加到刚使被干扰的谱线达到饱和，则另一个靠近的原子核的共振信号就会增加，这种现象称核欧沃豪斯效应（NOE）。1928年，印度物理学家拉曼(Raman)发现了拉曼光谱，同时期的苏联物理学家兰斯伯格(G.NMR法测定蛋白质结构的基本实验步骤:m/e一般不是整数，与母离子
41、和子离子有下述关系m*m22/m 1 值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出现在低场；l XRay晶体衍射目前仍然是蛋白质三维结构测定的主要方法l 优点分辨率高，能精确确定生物大分子中各原子的坐标、键长、键角,给出生物大分子的分子结构和构型,确定活性中心的位置和结构 l 缺点只能测定单晶，反映静态结构信息，无法测定溶液中的信息v 成为推广速度和发展速度都居首位的一种结构分析方法。成为推广速度和发展速度都居首位的一种结构分析方法。v 核磁共振可以方便地在溶液中研究分子结构并且是核磁共振可以方便地在溶液中研究分子结构并且是唯一唯一可以使试样不经受任何破坏的结构分析方法可以使试样不经受任何破坏的结构分析
42、方法。v目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数，成成为一种引人注目的癌症早期诊断技术。为一种引人注目的癌症早期诊断技术。NMRNMR核磁共振技术（核磁共振技术（NMR）v1946年美国年美国斯坦福大学斯坦福大学的的F.Bloch和哈佛大学的和哈佛大学的两个研究两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象，为此他们两人获小组首次独立观察到核磁共振现象，为此他们两人获1952年诺贝尔物理奖。年诺贝尔物理奖。v1983年年，瑞士科学家，瑞士科学家Kurt W
43、Kurt Wthrichthrich教授实验室首次运用教授实验室首次运用核磁共振方法解析了胰高血糖素（核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagonglucagon）多肽的溶液构多肽的溶液构象象.发明了利用核磁共振发明了利用核磁共振(NMR)NMR)技术测定溶液中生物大分子三维技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法获得了结构的方法获得了20022002年度诺贝尔化学奖年度诺贝尔化学奖 v74岁的美国科学家保罗岁的美国科学家保罗劳特布尔和劳特布尔和70岁的英国科学家彼岁的英国科学家彼得得曼斯菲尔德为曼斯菲尔德为2003诺贝尔医学奖的得主诺贝尔医学奖的得主（4）气相扩散法（Vapour diffu
44、sion）00510nm)、高能量(2.二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角构象是随机的外，其他残基的二面角构象分布受到立体化学的限制由于自旋裂分形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为自旋自旋耦合常数,用J表示。目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数，成为一种引人注目的癌症早期诊断技术。通过计算得到不同波长的()，得出计算曲线。然而由于拉曼光谱技术强度很弱，时间较长，测定有色物质和发光样品存在困难等缺陷,给其应用带来了很大困难,故在后来很长一段时间内发展比较缓慢，曾一度有被红外光谱取代的趋势。由于蛋白质在不同溶液中的溶解度不同，把待结晶蛋
45、白质溶液缓慢加入溶解性差异大的溶剂中，在界面处形成沉淀剂浓度梯度在局部达到瞬间过饱和，从而促使晶核形成。当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。1永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。因此，根据所测得蛋白质或多肽的远紫外CD谱，能反映出蛋白质或多肽链二级结构的信息，从而揭示蛋白质或多肽的二级结构。因在用X射线研究晶体结构方面所作出的杰出贡献,亨利布拉格（William Henry Bragg）和劳伦斯布拉格（William Lawrence Bragg）父子分享了1915年的诺贝尔物理学奖。核磁共振(N
46、uclear Magnetic Resonance)，X-射线晶体衍射法：85.2，证实裂解过程为m/z123 m/z108 m/z80螺旋结构在靠近192nm有一正的谱带，在222和208nm处表现出两个负的特征肩峰谱带；作用反映分子的结构信息。1985年,维特里希等人公布了第一次利用NMR 法测定的溶液中蛋白质蛋白酶抑制剂IIA(proteinase inhibitor IIA)的结构from：厦门大学生命科学学院质谱分析法在研究生物大分子特别是蛋白质方面已发展成为主要的技术手段之一，在蛋白质结构的研究中占据着十分重要的地位。X-射线晶体衍射法：85.除传统的紫外可见差光谱法和荧光光谱法外
47、，圆二色谱、激光拉曼光谱以及质谱也在测定蛋白质溶液构象方面发挥着重要的作用。NMR基本原理基本原理核 磁 共 振核 磁 共 振(N u c l e a r N u c l e a r Magnetic Resonance)Magnetic Resonance)，就是处于某个静磁场中的就是处于某个静磁场中的自旋核系统受到相应频率自旋核系统受到相应频率的射频磁场作用时的射频磁场作用时,共振共振吸收某一特定频率的射频吸收某一特定频率的射频辐射的物理过程。辐射的物理过程。核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪核磁共振波谱是测量原子核对核磁共振波谱是测量原子核对射频辐射射频辐射(约约4 4 600MHz)600M
48、Hz)的吸收，的吸收，这种吸收只有在高磁场中才能这种吸收只有在高磁场中才能产生。产生。15X-射线晶体衍射法：85.多对同晶型置换法(MIR)然后利用冷冻电镜和低剂量成像技术对样品进行电子成像XRay晶体衍射目前仍然是蛋白质三维结构测定的主要方法其中，z为电荷数，e为电子电荷，U为加速电压，m为碎片质量，v为电子运动速度。与小分子结晶一样，蛋白质在溶液中处于过饱和状态时，分子间可以规则的方式堆积起来形成晶体析出通过计算得到不同波长的()，得出计算曲线。NMR可获得分子内各核的化学环境、核间的耦合关系、空间构象等信息，但是当分子较大的时候，由于裂分谱线间的重叠，因此在测定了同一种核的一维谱之后，
49、需要了解两种或三种不同核之间的联系关系，如C-H，N-H等就需要用到2DNMR，它是2个频率变量的函数，吸收峰对2个频率变量作图。（2）透析法(Dialysis)紫外可见光CD主要用于辅基的偶合分析。椭圆偏振光振幅不等的左、右圆偏振光合成第二节 NMR测定蛋白质结构第三节 蛋白质结构测定的其他方法2，证实裂解过程为m/z123 m/z108 m/z80优点分辨率高，能精确确定生物大分子中各原子的坐标、键长、键角,给出生物大分子的分子结构和构型,确定活性中心的位置和结构X射线是一种短波长(0.这种方法的优点是可对溶液中的蛋白质进行分析,进而可对活细胞中的蛋白质进行分析,能获得“活”蛋白质的结构,
50、其意义非常重大。蛋白质晶体生长的影响因素6 nm分辨率的蛋白质晶体结构MS用于多肽和蛋白质测序可分为三种方法00510nm)、高能量(2.核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪根据电子跃迁能级能量的大小，蛋白质的CD光谱分为三个波长范围:蛋白质晶体生长的影响因素第一种方法称为蛋白图谱(protein mapping),它是使用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽的分子量,将所得肽谱数据输入数据库,搜索与之相对应的已知蛋白,从而获取待测蛋白序列；1）250nm以下的远紫外光谱区，圆二色性主要由肽键的n*电子跃迁引起；核磁共振技术能测出溶液状态下分子量较小蛋白质的结构，但对
