1、现代制药工艺学现代制药工艺学-生物制药工艺研究生物制药工艺研究赵广荣赵广荣2014-10-22现代制药工艺学现代制药工艺学-生物制药部分的基本要求生物制药部分的基本要求(1)了解前沿进展了解前沿进展(2)掌握基本原理和技术掌握基本原理和技术(3)能设计相关工艺实验研究的技术方案能设计相关工艺实验研究的技术方案(4)重点掌握授课内容重点掌握授课内容(5)下载相关文献下载相关文献,掌握其中核心知识和技术掌握其中核心知识和技术主要内容主要内容第一讲第一讲 工程生物的构建原理与技术工程生物的构建原理与技术第二讲第二讲 青蒿素前体的合成生物技术青蒿素前体的合成生物技术第三讲第三讲 重组人干扰素产品创新与
2、工艺研究重组人干扰素产品创新与工艺研究工程生物 engineered organismsn通过基因工程、转基因、合成生物学等工通过基因工程、转基因、合成生物学等工程技术创造的生物程技术创造的生物n重组微生物，合成微生物重组微生物，合成微生物n转基因植物转基因植物n转基因动物转基因动物工程生物工程生物n1998-2002年，欧盟第五框架计划实施细胞工厂年，欧盟第五框架计划实施细胞工厂(cell factory)项目，其目的是全面了解应用微生物项目，其目的是全面了解应用微生物。n美国：生物学角度，美国：生物学角度，最小基因组最小基因组(minimized genome)是由一是由一套生物生存必需的
3、最小基因组成。套生物生存必需的最小基因组成。n日本：日本：2001年，年，从工业应用角度，具有最小基因组的工业微从工业应用角度，具有最小基因组的工业微生物就是最小基因组工厂（生物就是最小基因组工厂（minimized genome factory）。最）。最小基因组工厂是具有工业生产必需基因，而非必需基因和有小基因组工厂是具有工业生产必需基因，而非必需基因和有害基因已经被删除的微生物。它不仅简单，而且是又容易工害基因已经被删除的微生物。它不仅简单，而且是又容易工业过程控制。业过程控制。n2002年年创办创办国际国际刊物刊物Microbial Cell Factories，报道微，报道微生物细胞
4、作为重组蛋白、天然产物的生产者，或生物转化的生物细胞作为重组蛋白、天然产物的生产者，或生物转化的催化剂等方面的研究进展和论文。催化剂等方面的研究进展和论文。n中国：中国：2010年以后，人工细胞工厂，人工生物体系，人工生年以后，人工细胞工厂，人工生物体系，人工生物系统物系统最小基因组工厂最小基因组工厂继人类基因组研究之后，生物领域一热门学科，是继人类基因组研究之后，生物领域一热门学科，是整体系统论生物学思潮在工程学领域的再现。整体系统论生物学思潮在工程学领域的再现。合成生物学（synthetic biology）的概念合成生物学合成生物学按照人类的目的设计并创造新的生命元件器件，功按照人类的目
5、的设计并创造新的生命元件器件，功能模块乃至自然界不存在的生命系统能模块乃至自然界不存在的生命系统;对现有的生对现有的生命体进行有意义的工程改造，赋予其新的功能。命体进行有意义的工程改造，赋予其新的功能。合成生物学的核心思想是，认为生命的所有元件都合成生物学的核心思想是，认为生命的所有元件都能由化学方法来合成制造，并进而通过工程化方式能由化学方法来合成制造，并进而通过工程化方式组装成实用的生物体。组装成实用的生物体。19111911：柳叶刀柳叶刀，出现，出现“合成生物学合成生物学”20002000年以后，迅速发展，注意力转向该领域年以后，迅速发展，注意力转向该领域20042004年（年（MITM
6、IT）TechnologyTechnology ReviewReview，合成生物学评为，合成生物学评为“将改将改变世界的十大新技术变世界的十大新技术”之一之一20042004年开始，全球年开始，全球iGEMiGEM比赛（大学生遗传机器作品）比赛（大学生遗传机器作品）20042004年年6 6月：月：MITMIT，第，第1 1届合成生物学国际会议届合成生物学国际会议(SB 1.0)(SB 1.0)20052005年年5 5月：月：UCUC伯克利伯克利,SB 2.0,SB 2.0；20072007年年6 6月，瑞士，月，瑞士，SB 3.0SB 3.020082008年年1010月：香港，月：香港
7、，SB 4.0SB 4.0；20112011年年6 6月月:Stanford U,SB:Stanford U,SB 5.05.020132013年年7 7月，英国伦敦，月，英国伦敦，SB 6.0SB 6.020122012年，年，ACS Synthetic BiologyACS Synthetic Biology合成生物学的学术交流合成生物学合成生物学 概述2002年年Cello 等合成脊髓灰质炎病毒的等合成脊髓灰质炎病毒的cDNA（Science,2002，297：1016-1018），），2005年年Endy等合成噬菌体等合成噬菌体T7基因组（基因组（Mol Systems Biology
8、，2005，1：1-10）2007年年Craig J.Venter研究所（研究所（CJVI）实现了基因组的物）实现了基因组的物种间人工移植（种间人工移植（Science，2007，317:632-638）2008年该所人工全合成了生殖衣原体细菌基因组（年该所人工全合成了生殖衣原体细菌基因组（Science,2008，319：1215-1220）2009年利用酵母对克隆的基因组进行工程化组装（年利用酵母对克隆的基因组进行工程化组装（Science,2009，325:1693-1696），），2010年年CJVI合成活细菌合成活细菌20112011年合成酵母染色体臂年合成酵母染色体臂2014201
9、4年，合成酵母年，合成酵母IIIIII号染色体号染色体基因组合成的技术发展从头合成DNA的里程碑事件n1955,二聚体 dTdT(2 nt)n1968,酵母丙氨酸转移RNA(77 nt)n1981,人干扰素a(514 bp)n2002,脊髓灰质炎病毒(7501 bp)n2004,6脱氧红霉素内酯B合成酶基因簇DEBS(31656 bp)n2008,支原体基因组(582 970 bp)n2010,支原体细菌n2014，酵母染色体基因组工程基因组合成基因合成合成生物学合成生物学合成生物的单元合成生物的单元合成生物的设计与优化合成生物的设计与优化生物元器件生物元器件类型类型计算机计算机生命生命系统系
10、统system全局全局全球网全球网生命体生命体局部局部局域网局域网组织或器官组织或器官个体个体单台单台细胞细胞器件器件devices芯片芯片基因组，复制基因组，复制/转录转录/翻译装置翻译装置功能单功能单元元模块模块代谢途径代谢途径元件元件parts电子元电子元件件生物元件生物元件合成生物学与计算机工程的层阶比较 合成生物学合成生物学1 1、基因、基因元件元件基因基因（生物）元件：具有某种特定的生物学功能的（生物）元件：具有某种特定的生物学功能的DNADNA，是设计和合成生物的基本单位。，是设计和合成生物的基本单位。n特性：信号接受和输入功能，信号发送和产物输出功特性：信号接受和输入功能，信号
11、发送和产物输出功能，调节信息流、代谢和生物合成的功能，和其他元能，调节信息流、代谢和生物合成的功能，和其他元件相互作用，具有特定的工作环境。件相互作用，具有特定的工作环境。n功能元件：编码功能元件：编码1 1个个/组生化反应酶功能基因组生化反应酶功能基因/基因簇基因簇；编码组成细胞组分蛋白质的基因；编码组成细胞组分蛋白质的基因n界面调控元件界面调控元件:包括功能基因转录、蛋白质翻译与修包括功能基因转录、蛋白质翻译与修饰、功能酶反应等的调控基因。饰、功能酶反应等的调控基因。合成生物的单元合成生物学合成生物学生物元器件基因元件的图形编码-制图复制子 启动子 阻遏子 诱导子 终止子 RBS 功能基因
12、 MCS 抗性 合成生物学合成生物学生物元器件基因（生物）元件：具有某种特定的生物学功能基因（生物）元件：具有某种特定的生物学功能的的DNADNA，是设计和合成生物的基本单位。，是设计和合成生物的基本单位。生物部件：由一个或多个基因元件组成生物部件：由一个或多个基因元件组成最简单的能行使催化功能的生物部件是完整的最简单的能行使催化功能的生物部件是完整的编码酶基因表达盒。编码酶基因表达盒。启动区启动区功能基因功能基因终止区终止区合成生物学合成生物学生物元器件生物模块是一组细胞内区域化的生物部件，由内在功生物模块是一组细胞内区域化的生物部件，由内在功能联系在一起，执行特定的复杂功能。能联系在一起，
13、执行特定的复杂功能。n如代谢途径、信号转导途径、调控途径等。如代谢途径、信号转导途径、调控途径等。n模块：通过某种（逻辑模块：通过某种（逻辑/功能）关系把生物元件连接功能）关系把生物元件连接而成而成与电子科学中的电路类似，在合成生物学，不同功能与电子科学中的电路类似，在合成生物学，不同功能的生物砖联接后，能像电路一样运行，形象地称为基的生物砖联接后，能像电路一样运行，形象地称为基因线路（因线路（genetic circuitgenetic circuit）。）。按功能分为按功能分为:代谢线路代谢线路,调控线路调控线路,信号线路等信号线路等生物模块与基因电路合成生物学合成生物学生物元器件nEnd
14、y DEndy D提出了合成生物学设计的工程策略：标准化、提出了合成生物学设计的工程策略：标准化、解耦联和抽提。解耦联和抽提。n标准化：确立基本生物元件的方法、对生物功能的定标准化：确立基本生物元件的方法、对生物功能的定义和特征描述。义和特征描述。n解耦联：复杂系统解分成具有独立功能的简单组分。解耦联：复杂系统解分成具有独立功能的简单组分。n抽提：建立元件和模块的层阶。抽提：建立元件和模块的层阶。合成生物的设计与优化合成生物学合成生物学生物元器件n抽提：一个反应对应一个酶，一个酶对应一个基因。抽提：一个反应对应一个酶，一个酶对应一个基因。n功能模式：基因表达调控的操纵子模型。功能模式：基因表达
15、调控的操纵子模型。n优化：功能基因密码子、启动子、核糖体结合位点。优化：功能基因密码子、启动子、核糖体结合位点。n适合于不同宿主表达的生物元件。适合于不同宿主表达的生物元件。1、生物元件的设计与优化合成生物学合成生物学生物元器件n生物砖构建基因电路的困难是，把相同功能的不同生物砖构建基因电路的困难是，把相同功能的不同生物来源的生物砖集成基因电路后，不一定具有功生物来源的生物砖集成基因电路后，不一定具有功能。能。n优化方法可以是基于数学模拟的理性设计，也可以优化方法可以是基于数学模拟的理性设计，也可以是生物元件的直接进化。是生物元件的直接进化。2.基因电路的设计与优化合成生物学合成生物学生物元器
16、件iGEM（International Genetically Engineered Machine）竞赛，在美国麻省工学院（）竞赛，在美国麻省工学院（MIT）收集）收集每年参赛者贡献的生物元器件，建立了标准生物元每年参赛者贡献的生物元器件，建立了标准生物元件库（件库（Registry of Standard Biological Parts）(http:/parts.igem.org)。经过经过10年的收集，该文库的元器件以年的收集，该文库的元器件以BBa为字头，为字头，容量已达到约容量已达到约2万个。万个。生物元件库生物元件库合成与装配数据库数据库RegulonDB中，大肠杆菌天然操纵基因
17、中有中，大肠杆菌天然操纵基因中有1000余个启动子，及其他功能元件序列。余个启动子，及其他功能元件序列。数据库数据库BIOFAB（International Open Facility Advancing Biotechnology，http:/biofab.org/data）有）有数千个人工合成并表征的启动子、核糖体结合位点等数千个人工合成并表征的启动子、核糖体结合位点等元件。元件。天津大学生物信息学中心建有必需基因数据库（天津大学生物信息学中心建有必需基因数据库（http:/ AB BC CD DE EF FG G抽提抽提工程生物构建的基本过程基因元件设计基因元件设计基因线路合成基因线路合
18、成制药工程生物制药工程生物功能底盘细胞功能底盘细胞遗传转化遗传转化底盘细胞设计底盘细胞设计基因组编辑基因组编辑基因元件合成基因元件合成适配性筛选适配性筛选氨基酸，维生素，抗生素，抗癌药物，聚酮，萜类等氨基酸，维生素，抗生素，抗癌药物，聚酮，萜类等第一讲第一讲 工程生物的构建原理与技术工程生物的构建原理与技术DNADNA体外重组技术体外重组技术/基因工程基因工程生物元件的组装技术生物元件的组装技术/元件工程元件工程基因组的编辑技术基因组的编辑技术/基因组工程基因组工程体外重组是把不同来源的体外重组是把不同来源的DNADNA分子用特异性酶切分子用特异性酶切割，然后将两者连接成杂合分子。割，然后将两
19、者连接成杂合分子。体外重组的两大工具体外重组的两大工具:核酸限制性内切酶和连接酶，如同剪刀和胶水。核酸限制性内切酶和连接酶，如同剪刀和胶水。DNA 片段1DNA 片段2 酶切酶切可连接的片段可连接的片段 载体载体重组重组DNA分子分子 连接酶连接酶DNA元件的体外重组元件的体外重组基因的体外重组基因的体外重组基基因因重重组组示示意意图图载体载体/质粒质粒酶：限制性内切酶，连接酶，聚合酶酶：限制性内切酶，连接酶，聚合酶DNA体外重组工具基因元件载体基因元件载体载体载体kb容量容量kb宿主宿主导入方式导入方式复制子复制子质粒载体质粒载体 3-55-10Ec转化转化ColE1噬菌体噬菌体30-447
20、-23Ec转导转导ColE1黏粒黏粒5-830-45Ec转导转导ColE1P13070-100Ec转导转导P1PAC20130-150Ec电转化电转化P1BAC7-9120-300Ec电转化电转化FYAC10-15250-2000Yeast转化转化ARS载体载体/质粒质粒VectorVector：基因的携带者：基因的携带者复制起始点复制起始点选择标记选择标记多克隆位点多克隆位点质粒载体质粒载体基因元件的载体基因元件的载体1.1.结构结构自主复制性自主复制性:复制起始点以及控制复制频率的调控基因。复制起始点以及控制复制频率的调控基因。不相容性不相容性:具有相同或相似复制子结构及特征的的质粒不具有
21、相同或相似复制子结构及特征的的质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内。能稳定地存在于同一受体细胞内。转移性：转移性：从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞。从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞。选择标记：选择标记：抗生素抗性基因等。抗生素抗性基因等。表达功能表达功能:能转录、翻译合成外源基因的产物。能转录、翻译合成外源基因的产物。基因元件的载体基因元件的载体2.质粒的特性质粒的特性克隆质粒：克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。用于克隆和扩增外源基因。测序质粒：测序质粒：用于基因测序。用于基因测序。整合质粒：整合质粒：用于外源基因与宿主染色体用于外源基因与宿主染色体整合。整合。穿梭质粒：穿梭质粒：能在两种宿
22、主细胞存在能在两种宿主细胞存在。表达质粒：表达质粒：能表达基因产物。能表达基因产物。基因元件的载体基因元件的载体3.质粒的类型质粒的类型v噬菌粒载体：噬菌粒载体：由丝状噬菌体由丝状噬菌体DNADNA复制起始位点序复制起始位点序列与质粒组成的杂合分子。列与质粒组成的杂合分子。vM13M13噬菌体间隔区克隆到质粒上，形成噬菌粒。噬菌体间隔区克隆到质粒上，形成噬菌粒。v特点特点：象质粒一样，自主复制而稳定遗传。象质粒一样，自主复制而稳定遗传。象噬菌体一样，包装成颗粒，分泌胞外。象噬菌体一样，包装成颗粒，分泌胞外。基因在基因在M13M13载体和质粒载体之间的转移。载体和质粒载体之间的转移。v激活过程激
23、活过程：辅助丝状噬菌体感染带有噬菌粒的：辅助丝状噬菌体感染带有噬菌粒的受体细胞，反式激活噬菌粒上的间隔区位点，启受体细胞，反式激活噬菌粒上的间隔区位点，启动噬菌粒以丝状噬菌体动噬菌粒以丝状噬菌体DNADNA的复制模式进行复制。的复制模式进行复制。分别包装成颗粒并分泌到受体细胞外。分别包装成颗粒并分泌到受体细胞外。基因元件的载体基因元件的载体噬菌粒载体噬菌粒载体含有噬菌体含有噬菌体f1f1间隔区的载体：间隔区的载体：pBS，pGEM 11Zf，pBluescript。基因元件的载体基因元件的载体由由 DNA DNA的的coscos区与质粒区与质粒DNADNA重组而成，重组而成，主要用于基因文库的
24、构建。主要用于基因文库的构建。DNA cosDNA cos位点及其位点及其附近区域的附近区域的DNADNA片段片段为为1.7 kb1.7 kb质粒质粒DNADNA为为3.3 kb3.3 kb构成的黏粒总共构成的黏粒总共5 kb5 kb最大装载量达最大装载量达45 kb45 kb基因元件的载体基因元件的载体黏粒载体，考斯质粒黏粒载体，考斯质粒大肠杆菌-哺乳动物细胞 穿梭载体pUC复制子，C31 整合酶，位点特异性整合在链霉菌基因组的 att位点 oriT 大肠杆菌与链霉菌接合转移aac3(IV)安普抗性基因，大肠杆菌和链霉菌中筛选标记BamHI 克隆位点：天然产物生物合成基因簇大肠杆菌-链霉菌穿
25、梭载体pRS313,大肠杆菌-酵母穿梭载体酵母复制子酵母复制子大肠杆菌筛选标记大肠杆菌筛选标记大肠杆菌复制子大肠杆菌复制子酵母筛选标记酵母筛选标记多克隆位点多克隆位点大肠杆菌-链霉菌-酵母穿梭载体大肠杆菌-棒杆菌穿梭载体KanR，可移动整合表达载体整合表达载体游离表达载体游离表达载体概念：概念：在特异位点上催化双链在特异位点上催化双链DNADNA分子的断裂，分子的断裂，产生相应的限制性片段。产生相应的限制性片段。种类：种类：I I类限制性内切酶：类限制性内切酶：识别位点和切点不同，切断识别位点和切点不同，切断部位不定。部位不定。IIII类限制性内切酶：严格识别类限制性内切酶：严格识别,特异性切
26、割。特异性切割。IIIIII类限制性内切酶：特异性切割，识别部位和类限制性内切酶：特异性切割，识别部位和切点不同。切点不同。1.概念与种类概念与种类限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶基本名称基本名称：生物拉丁文名称属名的第一个大写字母和种：生物拉丁文名称属名的第一个大写字母和种名的前两各小写字母缩写构成（斜体）。名的前两各小写字母缩写构成（斜体）。如果酶存在于一种菌株中，加株名的一个大写字母。如果酶存在于一种菌株中，加株名的一个大写字母。如果酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，用如果酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，用一个大写字母表示这些非染色体的遗传物质。一个大写字母表示这些非染色体
27、的遗传物质。酶名称的最后部分为罗马数字，表示该生物体中发现酶名称的最后部分为罗马数字，表示该生物体中发现此酶的先后次序。此酶的先后次序。举例：举例：HinHind d，Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae d d 株中发株中发现第三个酶。现第三个酶。2.2.类限制性核酸内切酶的命名规则类限制性核酸内切酶的命名规则基因的体外重组基因的体外重组4 4、5 5或或6 6个碱基对，而且具有个碱基对，而且具有180180旋转对旋转对称的回文结构。称的回文结构。Eco RIEco RI的识别序列为：的识别序列为：55 GAATTC GAATTC 3 33
28、3 CTTAAG CTTAAG 5 5 有些酶切割后产生平末端有些酶切割后产生平末端,大部分酶切割大部分酶切割后产生黏末端，后产生黏末端，55或或33突出末端。突出末端。3.3.内切酶的识别序列内切酶的识别序列基因的体外重组基因的体外重组EcoR酶切后形成酶切后形成5 突出端突出端 EcoR酶切后形成平末端酶切后形成平末端 Pst酶切后形成酶切后形成3 突出端突出端 基因的体外重组基因的体外重组活性单位（活性单位（1U1U）定义：为）定义：为50 l50 l反应体系中，特定温反应体系中，特定温度下经过度下经过1 1小时反应，完全分解小时反应，完全分解1 g DNA1 g DNA所需酶量。所需酶
29、量。甲基化：从带有甲基化：从带有DNADNA甲基化酶基因的宿主中分离制备甲基化酶基因的宿主中分离制备DNADNA，其碱基一部分被甲基化，影响酶识别和切割能力，其碱基一部分被甲基化，影响酶识别和切割能力，甚至不能切割。甚至不能切割。星号活性：限制性酶对底物的特异性降低，导致切割星号活性：限制性酶对底物的特异性降低，导致切割非特异识别位点，电泳弥散（非特异识别位点，电泳弥散（smearsmear）。尽可能降低甘）。尽可能降低甘油浓度，在中性油浓度，在中性pHpH和高盐离子浓度下进行酶切反应和高盐离子浓度下进行酶切反应。4.4.影响酶切的因素影响酶切的因素基因的体外重组基因的体外重组缓冲液与温度：每
30、种酶都有最适反应缓冲液，应在缓冲液与温度：每种酶都有最适反应缓冲液，应在最佳工作温度下和反应缓冲液中进行。最佳工作温度下和反应缓冲液中进行。酶量与反应时间：增加酶量，相应缩短时间。酶量与反应时间：增加酶量，相应缩短时间。质粒纯度不很高，酶切反应通常在数倍过量酶的条质粒纯度不很高，酶切反应通常在数倍过量酶的条件下进行。件下进行。基因的体外重组基因的体外重组4.4.影响酶切的因素影响酶切的因素DNADNA连接酶催化的基本反应连接酶催化的基本反应:DNA:DNA 双链上相邻的双链上相邻的 33羟羟基和基和 55磷酸基因共价结合形成磷酸基因共价结合形成 3355磷酸二酯磷酸二酯键，使原来断开的键，使原
31、来断开的DNADNA缺口重新连接起来。缺口重新连接起来。T4T4噬菌体的噬菌体的DNADNA连接酶连接酶:以以ATPATP作为辅助因子，它在与作为辅助因子，它在与酶形成复合物的同时释放出焦磷酸基团。酶形成复合物的同时释放出焦磷酸基团。大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶:以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADNAD+）作为辅助因子。活化后的酶复合物结合在作为辅助因子。活化后的酶复合物结合在DNADNA的缺口的缺口处，修复磷酸二酯键，并释放处，修复磷酸二酯键，并释放AMPAMP。T4-DNA T4-DNA 连接酶比大肠杆菌连接酶具有更广泛底物适连接酶比大肠杆菌连接酶具有更广泛
32、底物适应性。应性。连接反应与连接酶连接反应与连接酶基因的体外重组基因的体外重组基因的体外重组基因的体外重组DNA连接酶的各种特性连接酶的各种特性连接酶连接酶平端平端/突端突端/切口补平切口补平/T4 DNA连接连接酶酶15-254 37大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶10-15 37热稳定性热稳定性DNA连接酶连接酶24-3765-72DNA/RNADNA/RNA聚合酶：催化合成聚合酶：催化合成DNA/RNADNA/RNA分子的酶。体外进行聚合反分子的酶。体外进行聚合反应与体内相似，一般需要模板，合成产物为模板的互补序列。应与体内相似，一般需要模板，合成产物为模板的互补序列。根据聚合酶依赖的
33、模板，可分为：根据聚合酶依赖的模板，可分为：依赖于依赖于DNADNA的的DNADNA聚合酶：大肠杆菌聚合酶：大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I及其大片段、及其大片段、T4T4和和T7 DNAT7 DNA聚合酶及热稳定性聚合酶及热稳定性DNADNA聚合酶；用于聚合酶；用于DNADNA复制和扩增复制和扩增依赖于依赖于DNADNA的的RNARNA聚合酶：转录酶，基因的转录聚合酶：转录酶，基因的转录依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶：反转录酶，病毒的复制聚合酶：反转录酶，病毒的复制不依赖于模板的聚合酶：把核苷酸加到不依赖于模板的聚合酶：把核苷酸加到DNADNA分子的末端，即末分子的末端
34、，即末端转移酶。端转移酶。四、四、DNADNA聚合反应与聚合酶聚合反应与聚合酶基因的体外重组基因的体外重组各种聚合酶特性各种聚合酶特性基因的体外重组基因的体外重组酶酶温度温度 模板模板聚合活性聚合活性外切活性外切活性大肠杆菌大肠杆菌DNA聚聚合酶合酶16-22ssDNA,ssRNA535335Klenow片段片段16-22ssDNA,ssRNA5335T4 DNA聚合酶聚合酶37ssDNA5335末端转移酶末端转移酶37dsDNA53无无多核苷酸聚合酶多核苷酸聚合酶 37ssRNA53无无T7 RNA聚合酶聚合酶37dsDNA53无无SP6 RNA聚合酶聚合酶 40dsDNA53无无5 3 外
35、切活性外切活性3 5 外切活性外切活性5 3 聚合活性聚合活性5 3 5 3 聚合活聚合活性性3 5 外切活性外切活性 5 3 5 3 外切外切活性活性基因的体外重组基因的体外重组聚合酶活性大肠杆菌大肠杆菌DNA DNA 聚合酶聚合酶I I的大片段的大片段Klenow Klenow 酶用途：酶用途：1 1）3 3凹端补平，使之成为平末端；凹端补平，使之成为平末端；2 2）对）对DNADNA片段进行标记，合成探针；片段进行标记，合成探针；3 3）用于催化）用于催化cDNAcDNA第二链的合成；第二链的合成；4 4）用于双脱氧末端终止法测定）用于双脱氧末端终止法测定DNADNA的序列。的序列。T4
36、-DNA T4-DNA 聚合酶：聚合酶：修平非平头的修平非平头的cDNAcDNA分子以及由某些限制性核酸内分子以及由某些限制性核酸内切酶水解产生的切酶水解产生的3 3突出末端。突出末端。基因的体外重组基因的体外重组聚合酶的用途聚合酶的用途KlenowKlenow酶酶末端转移酶：转移活性比其他聚合酶高，用于末端转移酶：转移活性比其他聚合酶高，用于RTRT和和PCRPCR反应物、载体末端加同聚物和反应物、载体末端加同聚物和3 3末端标记反应。末端标记反应。多核苷酸聚合酶：用于多核苷酸聚合酶：用于RNA 3RNA 3标记和加标记和加poly(A)poly(A)。RNARNA聚合酶：可用于合成聚合酶：
37、可用于合成RNARNA探针、体外翻译，可用探针、体外翻译，可用T7T7转录系统在大肠杆菌、酵母中表达外源基因。转录系统在大肠杆菌、酵母中表达外源基因。基因的体外重组基因的体外重组聚合酶的用途末端转移酶聚合酶的用途末端转移酶碱性磷酸酶来源于大肠杆菌和牛小肠。细菌碱性碱性磷酸酶来源于大肠杆菌和牛小肠。细菌碱性磷酸单酯酶和牛小肠碱性磷酸单酯酶（磷酸单酯酶和牛小肠碱性磷酸单酯酶（CIAPCIAP）均）均能催化能催化DNADNA、RNARNA核苷酸的核苷酸的55端单酯水解，除去磷端单酯水解，除去磷酸，需要辅基酸，需要辅基ZnZn2 2，但不能催化磷酸二酯和三酯，但不能催化磷酸二酯和三酯的水解。的水解。在
38、在DNADNA重组实验中，该酶用于载体重组实验中，该酶用于载体DNADNA的的55末端除末端除磷操作，以提高重组效率。外源磷操作，以提高重组效率。外源DNADNA片段的片段的55端端除磷磷酸基，则可有效防止外源除磷磷酸基，则可有效防止外源DNADNA片段之间的连片段之间的连接，提高重组效率。在核酸接，提高重组效率。在核酸55末端标记前，用碱末端标记前，用碱性磷酸酶除去磷酸，可得到较高的标记效率。性磷酸酶除去磷酸，可得到较高的标记效率。基因的体外重组基因的体外重组聚合酶的用途碱性磷酸酶聚合酶的用途碱性磷酸酶基因的体外重组基因的体外重组聚合酶的用途聚合酶的用途其他酶其他酶核酸酶模板用途核糖核酸酶H
39、DNA/RNAcDNA克隆、除去mRNA poly(A)末端。核糖核酸酶ARNA除去质粒或DAN-RNA、RNA-RNA杂合体中未杂交的单链RNA，突变检测S1核酸酶ssRNA,ssDNAS1作图，dsDNA末端平化，除去DNADNA和RNADNA杂交体中的单链部分绿豆核酸酶ssRNA/ssDNA杂交作图，双链DNA末端平化外切酶IIIdsDNA测序，DNA缺失，DNA蛋白质相互作用分析脱氧核糖核酸酶IssDNAdsDNA体外转录后除去模板DNA，切口平移反应，DNA蛋白质相互作用分析，降解RNA中的DNAPCR(Polymerase chain reaction,PCR)PCR(Polyme
40、rase chain reaction,PCR)：聚合酶链式反应，是由聚合酶链式反应，是由DNADNA聚合酶催化下，对特定的聚合酶催化下，对特定的DNA DNA 序列进行的复制反应。序列进行的复制反应。本质：本质：根据生物体的根据生物体的DNADNA复制原理在体外合成基因。复制原理在体外合成基因。发明者：发明者：MullisMullis，19831983年，生物技术革命性象征。年，生物技术革命性象征。PCR及其衍生技术及其衍生技术-目标基因组装一、一、PCRPCR技术技术目标基因组装目标基因组装(2)退火（退火（55）(4)完成一个循环完成一个循环(3)延伸（延伸（72）目标基因扩增目标基因扩
41、增(1)变性（变性（94）1.PCR1.PCR单反应原理与过程单反应原理与过程产物计算：产物计算：Y Yn nY Y0 0（1 1X X）n n其中其中Y Yn n为为n n循环后的拷贝数，循环后的拷贝数，Y Y0 0为起始拷贝数，为起始拷贝数，X X为扩增效率，为扩增效率，n n为循环数。为循环数。2.PCR2.PCR循环循环目标基因扩增目标基因扩增模板模板 DNADNA：目标序列目标序列,100,10010 000bp,pg10 000bp,pg引物：引物：两条寡核苷酸。两条寡核苷酸。脱氧核苷酸：脱氧核苷酸：4 4种种dNTP,dNTP,即即dATP,dCTP,dGTP,dTTPdATP,
42、dCTP,dGTP,dTTPDNADNA聚合酶聚合酶:Taq Taq聚合酶，耐高温聚合酶，耐高温缓冲溶液：缓冲溶液：50 mM KCl50 mM KCl、10 mM Tris10 mM TrisHCl,1.5 HCl,1.5 mM MgClmM MgCl2 2 3.PCR3.PCR扩增的反应体系组成扩增的反应体系组成目标基因组装目标基因组装长度：长度：2030 bp，与模板配对长度与模板配对长度1825 bp。GC含量含量:4060，4种碱基分布均匀。种碱基分布均匀。Tm值计算值计算:151520 bp20 bp，TmTm2 2（A AT T）4 4（C CG G）。）。141440 bp40
43、 bp：TmTm81.581.516.6(lgK16.6(lgK+)0.41(G+C%)0.41(G+C%)引物引物TmTm之差之差不能大于不能大于55，产物，产物TmTm值与引物值与引物TmTm值之差不值之差不能低于能低于1010。一般在一般在50506565之间，温度越高特异性越强。之间，温度越高特异性越强。4.PCR4.PCR操作指南操作指南引物设计引物设计目标基因扩增目标基因扩增酶识别序列碱基对数0123Apa IGGGCCCBamH IGGATCCCla IATCGATEco R IGAATTCEcoR VGATTACHind IIIAAGCTTNot I GCGGCCGCPst I
44、CTGCAGSacI GAGCTCSal IGTCGACSma ICCCGGGSpe IACTAGT Xba ITCTAGAXho ICTCGAG4.PCR操作指南操作指南酶切位点设计酶切位点设计目标基因扩增目标基因扩增聚合酶外 切 活性温度稳定性错误率106Taq 53758097.5,9 min20100rTth53758097.5,20 min20Tbr 53758096,150 minPwo 356065100,2 hrDeep Vent357080100,480 min2045Pfu 35727895,240 min1.6Tli 357080100,100 min2045Tfl 07
45、070,120 min100Taq stoffel0758097.5,21 min504.PCR4.PCR操作指南操作指南DNADNA聚合酶的选择聚合酶的选择目标基因扩增目标基因扩增Mg离子浓度：离子浓度：1.55.0 mM。退火温度：退火温度：根据产物基因的根据产物基因的Tm值和长度计算。值和长度计算。退火时间：一般退火时间：一般30秒至秒至2分钟，根据长度计算。分钟，根据长度计算。延伸时间：一般延伸时间：一般13分钟。分钟。循环次数：循环次数：2540次，根据模板含量。次，根据模板含量。PCRPCR反应应该包括正、负对照，无模板、无引物、反应应该包括正、负对照，无模板、无引物、无聚合酶等对
46、照，以便检测无聚合酶等对照，以便检测PCRPCR的进行和结果分析。的进行和结果分析。整个过程在整个过程在PCRPCR仪内，编程后自动完成。仪内，编程后自动完成。4.PCR4.PCR操作指南操作指南循环参数设计循环参数设计目标基因扩增目标基因扩增常规操作：冷启动，在冰上把反应物混合后，设计常规操作：冷启动，在冰上把反应物混合后，设计最佳程序，直接进行。最佳程序，直接进行。热启动操作：先把引物和模板混合并加热到高于非热启动操作：先把引物和模板混合并加热到高于非特异性结合温度，加入聚合酶，启动特异性结合温度，加入聚合酶，启动PCRPCR。降序操作：降序操作：PCRPCR过程优化的最佳选择。前两个扩增
47、过程优化的最佳选择。前两个扩增循环的复性温度比富含循环的复性温度比富含GCGC引物与模板完全配对的熔链引物与模板完全配对的熔链温度高温度高33。随后的循环中，复性温度逐渐降低。随后的循环中，复性温度逐渐降低11。总有一个温度点是特异性扩增的温度。总有一个温度点是特异性扩增的温度。用于兼并引物、模板用于兼并引物、模板DNADNA序列复杂和进行多重序列复杂和进行多重PCRPCR。降低非特异性扩增。降低非特异性扩增。5.PCR5.PCR操作方式操作方式目标基因扩增目标基因扩增反转录反转录PCRPCR（Reverse Transcription PCR,Reverse Transcription PC
48、R,RTRT PCRPCR）:以以mRNAmRNA为起始材料，通过反转录酶合成为起始材料，通过反转录酶合成cDNAcDNA，再以，再以cDNAcDNA为模板，扩增合成为模板，扩增合成DNADNA片段。片段。应用：克隆基因的末端序列、表达的功能区段应用：克隆基因的末端序列、表达的功能区段 检测基因表达和诊断遗传病和感染的病毒等检测基因表达和诊断遗传病和感染的病毒等二、反转录二、反转录PCRPCR技术技术目标基因扩增目标基因扩增第一步第一步:反转录反应反转录反应第二步第二步:PCR:PCR扩增反应扩增反应1.RT1.RTPCRPCR原理与过程原理与过程目标基因扩增目标基因扩增2.RT反应体系的组成
49、反应体系的组成目标基因扩增目标基因扩增成分成分浓度浓度用量用量mRNA1pg100ng缓冲液缓冲液102 l4种种dNTPs混合液混合液20 mmol/L1 l引物引物520 pmol/L1 lRNase 抑制剂抑制剂20 U1 lMgCl250 mmol/L1 l反转录酶反转录酶100200 U1 lH2O13 l总体积总体积20 l3.3.反转录酶特性与选择反转录酶特性与选择目标基因扩增目标基因扩增酶酶温度温度 模板模板聚合活聚合活性性RNase H产物产物AMV41-45ssRNA,ssDNA53强强短短MMLV37ssRNA,ssDNA53弱或无弱或无长长（1 1）样品变性。）样品变性
50、。7575变性变性RNA 5RNA 5分钟，冰上冷却。分钟，冰上冷却。（2 2）反转录。加入其他成分，混合。在）反转录。加入其他成分，混合。在4242或或3737下，合成下，合成cDNAcDNA第一链，一般第一链，一般1 1小时。小时。（3 3）终止反应。）终止反应。9595加热加热5 5分钟，使反转录酶失活。分钟，使反转录酶失活。设置相关的正负对照，便于监测反应过程和分析反应设置相关的正负对照，便于监测反应过程和分析反应结果。结果。反转录之后，对产物稀释至一定倍数，然后作为模板，反转录之后，对产物稀释至一定倍数，然后作为模板，建立建立PCRPCR反应体系，进行反应体系，进行PCRPCR扩增。
