1、1第二章第二章 微生物发酵制药工艺微生物发酵制药工艺2第一节第一节 概述概述3 发酵：通过微生物培养而获得产物的过程发酵：通过微生物培养而获得产物的过程 微生物发酵制药：微生物发酵制药：利用微生物技术，通过高度工程化利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用的新型综合技术，以利用微生物反应微生物反应过程为基础，依赖过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢生长繁殖及代谢过程过程来合成来合成一定产物，通过一定产物，通过分离纯化分离纯化进行提取精制，并最终制剂成进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产型来实现药物产品的生产一、发酵一、发酵发酵工
2、程的4个阶段 u第一阶段 1676年制成第一台显微镜 微生物的存在 1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起的 1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精酶u第二阶段 对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。u第三阶段 20世纪40年代初，第二次世界大战爆发，青霉素迅速工业大规摸生产。深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、核酸发酵成功。7发酵罐发酵8立式卧式摇床发酵9静置发酵10二、u初级代谢产物：与菌体生长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须的氨基酸、核苷酸、维生素、糖类等菌体对其合成反馈控制严密，一般不
3、过量积累u次级代谢产物：与菌体生长不相伴随，以初级代谢的中间产物为原料而合成抗生素、生物碱、毒素、色素、胞外多糖等结构常较复杂对环境条件敏感三、常见的制药用微生物 细菌 放线菌 真菌细菌之大肠杆菌属(Escherichia coli)生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等氨基酸类药物 基因工程的载体细菌之短杆菌属(Brevibacterium)维生素B12、氨基酸、核苷酸类药物生产中常用的菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。细菌之棒状杆菌属(Corynebacterium)生产氨基酸、核苷酸类药物，用于甾体转化 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌，如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542细菌之芽孢
4、杆菌属(Bacillus)生产氨基酸、核苷酸、抗生素类、维生素B12、用于甾体转化等。细菌之假单胞菌属(Pseudomonas)生产维生素B12、氨基酸、核苷酸类；进行类固醇（甾体）转化；有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。细菌之乳酸杆菌属(Lactobacillus)生产抗癌类药物放线菌 抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济价值大。放线菌之链霉菌属(Streptomyces)灰色链霉菌(Streptomyces griseus)产链霉素金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)产金霉素红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus)产红霉素龟裂链
5、霉菌(Streptomyces rimosus)产土霉素放线菌之诺卡氏菌属(Norcadia)生产利福霉素、蚊霉素等放线菌之小单胞菌属(Micromonospora)多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M.echinospora)产庆大霉素。放线菌之游动放线菌属（Actinoplanes）典型代表：济南游动放线菌(Actinoplanes tsinanesisn)产创新霉素(creatmycin；1964)真菌之根霉属(Rhizopus)生产甾体激素、延胡索酸及酶制剂等。真菌之曲霉属(Aspergillus)生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进行甾体转化。真菌之青霉属(Penicillum)
6、产黄青霉(Penicillum chrysogenum)生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸真菌之头孢霉菌属(Cephalosporium)产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogen)、顶孢头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)都生产头孢菌素C真菌之酵母菌属(Saccharomyces)u啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)：生产啤酒、酒精、药用酵母等；核酸、麦角固醇、细胞色素C、凝血质和辅酶A等。u红酵母(Rhodotorula)：-胡萝卜素u棉病针孢酵母(Nematspora gossypii)：
7、核黄素真菌之其它u牛肝菌属：含有人体必需的8种氨基酸，还含有腺膘呤、胆碱和腐胺等生物碱。u灵芝属：灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、16种氨基酸(其中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸（主含延胡索酸），以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。30 菌株选育、发酵和分离纯化或提炼是发酵制药菌株选育、发酵和分离纯化或提炼是发酵制药的三个主要工段。的三个主要工段。四、发酵制药的基本过程四、发酵制药的基本过程31发酵制药流程32发酵制药工艺33 菌体生长与产物合成的三个阶段：菌体生长与产物合成的三个阶段：发酵前期（发酵前期（fermentation propha
8、se)fermentation prophase)菌体生长期（菌体生长期（cell growth phase)cell growth phase)发酵中期发酵中期(fermentation metphase)(fermentation metphase)产物合成期（产物合成期（product synthesis phase)product synthesis phase)发酵后期（发酵后期（fermentation anahase fermentation anahase）菌体自溶期（菌体自溶期（cell autolysis phase)cell autolysis phase)五、微生物发酵
9、基本过程特五、微生物发酵基本过程特征征34 从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延滞从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延滞期、对数生长期和减速期。期、对数生长期和减速期。代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗 生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。pHpH变化：先升后降以氨基酸为碳源，释放氨，后变化：先升后降以氨基酸为碳源，释放氨，后氨被利用。先降后升以糖为碳源，释放出丙酮酸氨被利用。先降后升以糖为碳源，释放出丙酮酸等
10、有机酸，后被利用。等有机酸，后被利用。发酵前期特征发酵前期特征35 以次级代谢产物或目标产物的生物合成为主的一以次级代谢产物或目标产物的生物合成为主的一段时间。段时间。菌体生长恒定就进入产物合成阶段。菌体生长恒定就进入产物合成阶段。呼吸强度：无明显变化，菌体数目不增加。呼吸强度：无明显变化，菌体数目不增加。产物量：逐渐增加，生产速率加快，至最高峰后产物量：逐渐增加，生产速率加快，至最高峰后合成能力衰退。合成能力衰退。对外界变化敏感对外界变化敏感:容易影响代谢过程，从而影响整容易影响代谢过程，从而影响整个发酵过程。个发酵过程。发酵中期特征发酵中期特征36 菌体衰老，细胞开始自溶的一段时间菌体衰老
11、，细胞开始自溶的一段时间 合成产物能力衰退，生产速率减慢合成产物能力衰退，生产速率减慢 氨基氮含量增加，氨基氮含量增加，pHpH上升上升 发酵必须结束，否则产物被破坏，菌体自发酵必须结束，否则产物被破坏，菌体自溶给过滤和提取带来困难溶给过滤和提取带来困难发酵后期特征发酵后期特征37第二节第二节 制药微生物与产物的生物合成制药微生物与产物的生物合成 制药微生物的选择制药微生物的选择 制药微生物的选育制药微生物的选育 微生物菌种的保藏微生物菌种的保藏 微生物代谢产物的生物合成微生物代谢产物的生物合成 微生物生物合成的调节微生物生物合成的调节38（1 1）所需培养基易得，价格低廉；）所需培养基易得，
12、价格低廉；（2 2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pHpH、溶解氧、溶解氧、渗透压等）渗透压等）（3 3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短）生长速度和反应速度较快，发酵周期短（4 4）单产高）单产高（5 5）抗病毒能力强）抗病毒能力强（6 6）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好（7 7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保证安全和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保证安全一、制药微生物的选择一、制药微生物的选择39 来源：大陆土壤、海
13、洋水体来源：大陆土壤、海洋水体 样品的采集：表层土壤样品的采集：表层土壤(0-10cm)(0-10cm)，海洋（，海洋（0-100m0-100m）预处理：根据分离目的和微生物的特性预处理：根据分离目的和微生物的特性 1 1）温度）温度 2 2）化学：）化学：SDSSDS酵母膏，酵母膏，CaCOCaCO3 3，NaOHNaOH处理，减少细菌，处理，减少细菌，有利于放线菌分离；乙酸乙酯、氯仿、苯处理，除去真有利于放线菌分离；乙酸乙酯、氯仿、苯处理，除去真菌。菌。3 3）离心、膜分离。）离心、膜分离。生产菌的自然分离生产菌的自然分离40 培养基：选择适宜的培养基，营养和培养基：选择适宜的培养基，营养
14、和pHpH，添加抑制剂如添加抑制剂如抗生素，制霉菌素等抗生素，制霉菌素等。分离方法：分离方法：1 1）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲溶液）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲溶液 2 2）滤膜法：）滤膜法：0.220.220.45um0.45um。细菌在膜上，。细菌在膜上，放线菌菌丝可穿透，进入培养基。放线菌菌丝可穿透，进入培养基。培养条件：放线菌培养条件：放线菌25-3025-30，32-3732-37，45-45-5050，7-147-14天至天至1 1月。月。41二、制药微生物菌种的选育二、制药微生物菌种的选育1 1、选育的目的、选育的目的 改善菌种的特性，使产量提高，改进质改善菌种的特性，使
15、产量提高，改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等合利用等2 2、选育的方法：、选育的方法：A A、自然选育；、自然选育；B B、诱变育种、诱变育种 C C、杂交育种、杂交育种42 定义：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变而进定义：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。行的菌种筛选过程。自然选育自然选育43菌种分离纯化1。稀释涂布2。平板划线纯化44斜面传代45防止菌株衰退的措施防止菌株衰退的措施 菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁殖能力降低、发酵产菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁殖能力降低、发酵产品的得率降低品的得率降低.
16、1 1、衰退的可能原因、衰退的可能原因 （1 1）、基因突变）、基因突变 （2 2）、分离现象）、分离现象 2 2、防止菌种衰退的方法、防止菌种衰退的方法A A、从菌种选育方面考虑；、从菌种选育方面考虑；B B、尽量减少传代次数、尽量减少传代次数 C C、创造良好的培养条件；、创造良好的培养条件；D D、利用不易衰退的细胞传代、利用不易衰退的细胞传代;E E、采用有效的菌种保藏方法、采用有效的菌种保藏方法诱变育种诱变育种 定义：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种发生变异，筛选优良个体，淘汰劣质个体。物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。生物类：噬菌体，转座
17、子。特点：快速，简单，效益大。缺点：无定向性。诱变育种流程 出发菌种 单孢子悬液 诱变处理 高产菌株 单菌落初筛 稀释涂板 复筛 稳定性特性 中试放大 投入生产杂交育种杂交育种 概念：两个不同基因型的菌株，通过结合或原生质体融合，使遗传物质发生重新组合，从中分离筛选出具有优良性状的新菌株。特点：有一定的定向性。种类：准性生殖 接合 原生质体融合（1）准性生殖育种）准性生殖育种 概念：准性生殖 范围：放线菌，半知菌纲的真菌 过程：两条菌丝 相互结合 异核体 二倍体 重组单倍体 产黄青霉：提高青霉素产量 对氟苯丙氨酸 灰黄链霉菌：灰黄霉素产量 准性生殖是指异核体（单个生物个体中含有两种或两种以上基
18、因型）细胞中两个遗传物质不同地细胞核可以结合成杂合二倍体地细胞核。这种杂合二倍体的细胞核在有丝分裂过程中可以发生染色体和单倍体化,最后形成遗传物质重组的单倍体的过程。也就是不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程。（2）接合育种范围：细菌、放线菌过程：两种细胞混合培养 基因片段进入另一细胞 合子 重组单倍体 虽然有成功报导，但多数效果不显著（3）原生质体融合育种 概念 通过生物学、化学或物理学的方法，使两个不同种类的体细胞融合在一起，从而产生具有两个亲本遗传性状的新细胞.用去壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，在高渗条件下，用聚乙二醇（PEG）促进原生质体发生融合，再生细胞壁，从而获得异
19、核体或重组子，这一技术叫原生质体融合。55 原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，从而丧失生产能力甚至菌株死亡。从而丧失生产能力甚至菌株死亡。目的：保持菌种原有优良特性，延长生命时限，长期存目的：保持菌种原有优良特性，延长生命时限，长期存活、不退化。活、不退化。原理：根据菌种的生物生理、生化特点，人工地创造条原理：根据菌种的生物生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态，生长繁殖处于件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态，生长繁殖处于休眠状态。休眠状态。关键：保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠关键：保藏时首先
20、要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体（孢子、芽孢等），其次是要创造一个最有利于休眠体（孢子、芽孢等），其次是要创造一个最有利于休眠的环境，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，以达的环境，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，以达到降低其代谢活动，延长保存期的目的。到降低其代谢活动，延长保存期的目的。三、微生物菌种的保藏三、微生物菌种的保藏56菌种保藏的方法菌种保藏的方法斜面保藏法、矿物油保藏法、斜面保藏法、矿物油保藏法、砂土保管保藏法、真空冷冻干燥法、砂土保管保藏法、真空冷冻干燥法、冷冻法、液态真空干燥法、冷冻法、液态真空干燥法、琼脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、琼脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、麦粒保藏
21、法、无水硅胶保藏法。麦粒保藏法、无水硅胶保藏法。57（1 1）斜面保藏法：）斜面保藏法：在在44左右的冰箱保藏，每隔一定时间进行移植左右的冰箱保藏，每隔一定时间进行移植培养后再继续保藏，如此反复。培养后再继续保藏，如此反复。优点：方法简单、存活率高，具有一定的保藏优点：方法简单、存活率高，具有一定的保藏效果。效果。缺点：菌种仍有一定的强度的代谢活动条件，缺点：菌种仍有一定的强度的代谢活动条件，保存时间不长（保存时间不长（1 16 6个月），传代多，菌种容易变异。个月），传代多，菌种容易变异。适用菌种：细菌、酵母、防线菌、霉菌适用菌种：细菌、酵母、防线菌、霉菌58（2 2）矿物油保藏法）矿物油保
22、藏法 将生长好的斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石将生长好的斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石蜡，油层高于斜面末端蜡，油层高于斜面末端1cm1cm，然后放于冰箱中保存。，然后放于冰箱中保存。适用菌种：适用于除细菌外的其它菌种适用菌种：适用于除细菌外的其它菌种（3 3）砂土管保藏法）砂土管保藏法 利用土壤颗粒对微生物起保护作用，提高微生物的利用土壤颗粒对微生物起保护作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制备和真空抽干两步。存活率。其包括砂土制备和真空抽干两步。适用菌种：产孢子的微生物，对于一些对干燥敏感适用菌种：产孢子的微生物，对于一些对干燥敏感的细菌（奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌）以及酵母不的细菌
23、（奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌）以及酵母不适用。适用。59 （4 4）真空冷冻干燥法）真空冷冻干燥法 先在菌悬液加入保护剂（如：脱脂牛奶、血清先在菌悬液加入保护剂（如：脱脂牛奶、血清等）然后在较低温度下使成冻结状态，最后减压抽等）然后在较低温度下使成冻结状态，最后减压抽干。干。特点：特点：它是菌种保藏中最有效的一种方法。它是菌种保藏中最有效的一种方法。保保存期可达一年至数十年之久，并且存活率高，变异存期可达一年至数十年之久，并且存活率高，变异率低。但是手续麻烦，需要一定的设备。率低。但是手续麻烦，需要一定的设备。适用菌种：对于不长孢子或长的很少孢子的真适用菌种：对于不长孢子或长的很少孢子的真菌保
24、藏效果不佳。菌保藏效果不佳。60（5 5）其他保藏方法）其他保藏方法 冷冻法：分低温冷冻（冷冻法：分低温冷冻（20 20）与超低）与超低温冷冻（温冷冻（196 196）两种。适用于细菌、）两种。适用于细菌、真菌、病毒等的保藏真菌、病毒等的保藏 液态真空干燥法：菌体在恒温液态条件下液态真空干燥法：菌体在恒温液态条件下进行真空干燥。适用于包括细菌、病毒，进行真空干燥。适用于包括细菌、病毒，特别适用于冷冻干燥保藏效果不佳的菌种。特别适用于冷冻干燥保藏效果不佳的菌种。琼脂穿刺封口保藏法：适用于不产孢子细琼脂穿刺封口保藏法：适用于不产孢子细菌的保藏菌的保藏61 曲法保藏：曲法保藏：将麸皮与水按比例混合，
25、灭菌后接入将麸皮与水按比例混合，灭菌后接入菌种，待孢子长成后即为成曲。将试管放入盛有氯化菌种，待孢子长成后即为成曲。将试管放入盛有氯化钙的干燥器中，干燥后低温保藏。适用于有大量孢子钙的干燥器中，干燥后低温保藏。适用于有大量孢子的霉菌和某些放线菌的保藏。的霉菌和某些放线菌的保藏。麦粒保藏法：麦粒保藏法：麦粒灭菌后接入菌液，培养有菌麦粒灭菌后接入菌液，培养有菌丝或孢子时，置通风、避光、干燥处保藏。适用于一丝或孢子时，置通风、避光、干燥处保藏。适用于一些放线菌、芽孢杆菌、酵母的保藏。些放线菌、芽孢杆菌、酵母的保藏。无水硅胶保藏法：无水硅胶保藏法：将细胞悬浮液和等体积的将细胞悬浮液和等体积的脱脂灭菌牛
26、奶混匀，加入装有无水硅胶的试管中，然脱脂灭菌牛奶混匀，加入装有无水硅胶的试管中，然后将试管放于干燥器内，室温或后将试管放于干燥器内，室温或4 4 保藏。对于细菌保藏。对于细菌和真菌效果都较好。和真菌效果都较好。62国内外菌种保藏机国内外菌种保藏机构构 菌种是一个国家的重要资源，世界各国对菌种是一个国家的重要资源，世界各国对菌种的保藏都极为重视。世界上有菌种的保藏都极为重视。世界上有700700多多家菌菌种保藏机构，其中国际知识产权组家菌菌种保藏机构，其中国际知识产权组织承认的法定的保藏机构仅有织承认的法定的保藏机构仅有2828家。家。63 1 1、我国的微生物菌种保藏机构、我国的微生物菌种保藏
27、机构1 1）普通微生物菌种保藏管理中心（）普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMCCCGMC）中科院微生物所，北京，中科院微生物所，北京，中科院武汉病毒研究所中科院武汉病毒研究所2 2）农业微生物菌种保藏管理中心（）农业微生物菌种保藏管理中心（ACCCACCC）中国农业科学院土壤肥料研究所，北京中国农业科学院土壤肥料研究所，北京 （ISFISF）3 3）工业微生物菌种保藏管理中心（）工业微生物菌种保藏管理中心（CICCCICC）中国食品发酵工业科学研究院，北京，（中国食品发酵工业科学研究院，北京，（IFFIIFFI）4 4）医学微生物菌种保藏管理中心（）医学微生物菌种保藏管理中心（CMCCCMC
28、C）中国医学科学院皮肤病研究所，南京中国医学科学院皮肤病研究所，南京卫生部药品生物制品检定所，北京卫生部药品生物制品检定所，北京中国医学科学院病毒研究所中国医学科学院病毒研究所5 5）抗生素菌种保藏管理中心（）抗生素菌种保藏管理中心（CACCCACC）中国医学科学学院抗生素研究所，北京中国医学科学学院抗生素研究所，北京四川抗生素工业研究所，成都四川抗生素工业研究所，成都华北制药厂抗生素研究所，石家庄华北制药厂抗生素研究所，石家庄6 6）兽医微生物菌种保藏管理中心（）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCCCVCC）农业部兽医药品检察所，北京农业部兽医药品检察所，北京642 2、国外主要的微生物菌种
29、保藏机构、国外主要的微生物菌种保藏机构 1 1）美国标准菌种收藏所（）美国标准菌种收藏所（ATCCATCC）2 2）美国冷泉港研究所（）美国冷泉港研究所（CSHCSH）3 3）日本东京大学应用微生物研究所（）日本东京大学应用微生物研究所（IAMIAM）4 4）日本东京科研化学有限公司（）日本东京科研化学有限公司（KCCKCC）5 5）日本大阪发酵研究所（）日本大阪发酵研究所（IFOIFO）6 6）英国国立标准菌种收藏所（）英国国立标准菌种收藏所（NCTCNCTC）7 7）美国国立卫生研究所（）美国国立卫生研究所（NIHNIH）8 8）美国农业部北方开发利用研究部（）美国农业部北方开发利用研究部
30、（NRRLNRRL）四、代谢产物的生物合成四、代谢产物的生物合成 代谢（metabolism）是生物体内进行的生理生化反应的统称。代谢分为分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabolism)，前者是指把大分子降解为小分子的过程，为合成代谢提供能量和原料；而后者是指把小分子合成为复杂大分子的过程，满足细胞生长和分化的需要。初级代谢是营养物质转变为细胞结构物质和对细胞具有生理活性作用的物质，为细胞提供能量、合成中间体及其生物大分子的代谢网络。在初级代谢过程中形成的产物为初级代谢产物（primary metabolite），包括各种小分子前体、单体和多糖、蛋白质、脂肪、核酸等。几乎所有生
31、物的初级代谢基本相同。次级代谢存在于某些生物中，并在一定时期表达。次级代谢对正常的生长可能不必要，但对抵抗逆境、分解毒素、生殖等具有重要意义。次级代谢产物生物合成的基本特征 （1）次级代谢产物种类繁多，结构特殊，含有不常见的化合物和化学键。如氨基糖、苯醌、香豆素、环氧化合物、生物碱、内酯、核苷、杂环等基团，聚乙烯不饱和键、大环、环肽等键。（2）具有种属特异性，与种属分类学无关。分类学上相同的菌种能产生不同结构的抗生素，如灰色链霉菌既可以产生氨基环醇类抗生素，又可以产生大环内酯类抗生素。分类学上不同的菌种能产生相同结构的抗生素，如霉菌和链霉菌均可产生头孢菌素C。一种微生物的不同菌株产生结构不同的
32、多种次级代谢物，而同一菌株会产生一组结构类似的化合物。（3）生长期转向生产期，形态与生理发生变化。次级代谢产物是在细胞生长后期开始形成，当生长受限制时被启动。完成菌体营养生长期（trophophase）之后，出现次级代谢物合成期（idiophase），其生物合成比生长对环境更敏感，要求更高。次级代谢产物是以初级代谢产物为前体，受到初级代谢的调节。可能是缺乏某种营养成分，菌体生长抑制，启动了次级代谢物合成。菌体内中间代谢物积累，抑制了初级代谢酶，使之消失或活性下降，诱导了新酶的出现，转入生产期。芽孢杆菌形成芽孢，放线菌和真菌形成孢子，抗生素合成可能是细胞分化的伴随现象。（4）次级代谢产物是结构相
33、似的一组混合物，但活性差异较大。参与反应的酶的底物特异性不强。产生菌利用一种或两种以上的初级代谢产物合成一种主要的次级代谢产物，并继续对该产物进行修饰生成多种衍生物。一种次级代谢产物可由两种或两种以上代谢途径合成。（5）次级代谢产物的合成受多基因控制。往往以基因簇形式存在。除染色体外，还有细胞质遗传物质，可能存在于质粒、线粒体基因。遗传物质的变异和丢失是导致菌种退化和生产不稳定的重要因素，所以具有代谢不稳定性。次级代谢产物的构建单位 微生物合成的次级代谢产物是由微生物代谢产生的一些中间产物，如由碳水化合物降解生成的五碳（C5）、四碳（C4）、三碳（C3）、二碳（C2）化合物和初级代谢产物合成。
34、把构成次级代谢产物的基本结构单位称为生源（biogen）。生源直接或间接来源于次级代谢过程的中间产物或初级代谢产物。构建单位包括聚酮体、甲羟戊酸、糖类、不常见的氨基酸（如D氨基酸、氨基酸等）、环多醇和氨基环多醇等。次级代谢产物的生物合成的基本过程次级代谢产物的生物合成的基本过程 次级代谢产物的合成基本过程包括构建单位的聚合再修饰装配。在此过程中，次级代谢产物的累积受合成途径中某些酶活性的限制，这些关键酶活性大小与产量正相关。（1）前体聚合）前体聚合 微生物合成生源后，通过缩合反应形成聚酮体、寡肽、聚乙烯等。各种聚酮体的合成过程相似，只是起始单位和延长单位不同。聚酮体是26个二碳单位的聚合反应的
35、结果，酮基被保留，或只是还原为羟基。聚酮体可直接形成环，如四环素类和大环内酯类。进而被修饰，与相应基团如氨基糖、糖胺等结合，形成结构和生理活性不同的化合物。乙酰CoA羧化形成丙二酰CoA，再与8个丙二酰单位缩合形成9酮化合物，再转化为中间体三环化合物。甲基化、还原、脱水、加氢、氧化形成4氧脱水四环素，加氯形成4氧脱水氯四环素，转氨形成4氨基脱水氯四环素，再甲基化形成脱水氯四环素，脱氢氯四环素，最后形成氯四环素。大环内酯是24碳单位缩合而成。氨基酸的聚合有三种形式：氨基酸活化成磷酸酯，再被酶催化缩合，如谷胱甘肽；蛋白质的核糖体模板合成途径；多酶复合物将氨基酸活化后，按硫模板或非核糖体机理缩合，形
36、成肽链。氨基酸与ATP反应，在羧基上形成腺苷单磷酸酯被激活。氨基酸被转移到酶的巯基上，形成硫酯键。硫酯键断裂，提高能量，使2个氨基酸之间形成肽键（羧基与氨基结合）。依次，形成多肽链。如短杆菌肽S是由2条5肽首尾连接而成。74（2）结构修饰 包括糖基化、酰基化、甲基化、羟基化、氨基化、氧化还原等，使抗生素产生了共存的系列类似物。在聚酮体链延长的过程中，伴随许多基团的化学修饰，如引入氧、氯原子、甲基等，再以糖苷键与糖类物质连接，酰胺键与氨基酸连接，形成各种抗生素。如四环素类，先形成聚酮体，在C7位发生氯化则是金霉素，在C5位上先氧化后还原则是土霉素。（3）装配 合成各个组分后，需要按一定顺序在特异
37、酶作用下组装，才能形成有活性的药物。77第三节第三节 发酵工艺条件的确定发酵工艺条件的确定 培养基及其制备培养基及其制备 灭菌操作技术灭菌操作技术 微生物发酵的微生物发酵的3 3种主要操作方式种主要操作方式 发酵工艺条件的确定及主要控制参数发酵工艺条件的确定及主要控制参数78 培养基（培养基（medium)medium)：供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需：供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物 按微生物的主要类群来说，它们所需要的培养基成分也不同。按微生物的主要类群来说，它们所需要的培养基成分也不同。细菌：细
38、菌：牛肉膏蛋白胨培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、LBLB (Luria-BertaniLuria-Bertani)放线菌：放线菌：高氏一号培养基高氏一号培养基 真菌：真菌：查氏合成培养基、查氏合成培养基、PDA(Potato-Dextrose-Agar)PDA(Potato-Dextrose-Agar)酵母菌；酵母菌；麦芽汁麦芽汁 培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。和工艺选择、产品质量和产量。一一 培养基培养基79 碳源碳源 氮源氮源 无机盐无机盐 水水 生长因子生长因子 前体与促进剂前体与促进剂
39、 消泡剂消泡剂培养基的成分培养基的成分80 概念：概念：构成微生物细胞和代谢产物中碳的营养物质。构成微生物细胞和代谢产物中碳的营养物质。作用：作用：为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物质和为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物质和代谢产物合成提供碳骨架。代谢产物合成提供碳骨架。碳源碳源81 糖类：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜糖类：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜 脂肪：豆油、棉籽油、猪油脂肪：豆油、棉籽油、猪油 醇类：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇醇类：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇 蛋白类：蛋白胨、酵母膏蛋白类：蛋白胨、酵母膏 速效碳源：糖类、有机酸速效碳源：糖类、有机酸 迟效碳源迟效碳源
40、:酪蛋白水解产生的脂肪酸酪蛋白水解产生的脂肪酸碳源的种类碳源的种类82 概念：概念：构成微生物和代谢产物中氮素的营养物质构成微生物和代谢产物中氮素的营养物质 作用作用:为生长和代谢提供氮源为生长和代谢提供氮源 种类：无机氮源、有机氮源种类：无机氮源、有机氮源氮源氮源83 几乎所有微生物都能利用有机氮源几乎所有微生物都能利用有机氮源 黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、尿素酵母粉、尿素有机氮源有机氮源84 氨水、铵盐和硝酸盐等。铵盐比硝酸盐更快利用。氨水、铵盐和硝酸盐等。铵盐比硝酸盐更快利用。工业应用：主要氮源和辅助氮源；调节工业应
41、用：主要氮源和辅助氮源；调节pHpH值值 生理酸性物质：代谢后能产生酸性残留物质，如生理酸性物质：代谢后能产生酸性残留物质，如（NHNH4 4)2 2SOSO4 4利用后，产生硫酸利用后，产生硫酸 生理碱性物质：代谢后能产生碱性残留物质。如生理碱性物质：代谢后能产生碱性残留物质。如NaNONaNO3 3利用后，产生氢氧化钠。利用后，产生氢氧化钠。无机氮源无机氮源85 概念：组成生理活性物质或具有生理调节作用的矿物质。概念：组成生理活性物质或具有生理调节作用的矿物质。作用方式：低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用作用方式：低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用 种类：种类：P P、S S、K K、Na
42、Na、MgMg、Ca Ca 常常添加常常添加Fe Fe、Zn Zn、Cu Cu、MoMo、CoCo、MnMn、ClCl，一般不加，一般不加无机盐与微量元素无机盐与微量元素86水水 营养传递的介质营养传递的介质 参与细胞内一系列化学反应参与细胞内一系列化学反应 维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象 良好导体，调节细胞生长环境温度良好导体，调节细胞生长环境温度 菌体细胞的主要成分菌体细胞的主要成分 微生物通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组成微生物通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组成的结构。的结构。87 概念：概念：加入到发酵培养基中的某些化合物，
43、被直接结合到加入到发酵培养基中的某些化合物，被直接结合到目标产物分子中，而自身的结构无多大变化。目标产物分子中，而自身的结构无多大变化。使用：使用：添加前体是提高抗生素产量的重要措施添加前体是提高抗生素产量的重要措施 多次少量添加多次少量添加前体（前体（precurtsorprecurtsor）88 概念：概念：维持微生物生长所必需的微量有机物，不起碳源维持微生物生长所必需的微量有机物，不起碳源和氮源作用。和氮源作用。种类：种类：维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。酸等。天然成分中含有：一般无需添加。天然成分中含有：一般无需添加。生长因子（
44、生长因子（growth factorgrowth factor）89 概念：概念：促进产物生成的物质，但不是营养物，促进产物生成的物质，但不是营养物，也不是前体的一类化合物。也不是前体的一类化合物。种类：种类：氯化物有利于灰黄霉素、金霉素合成。氯化物有利于灰黄霉素、金霉素合成。表面活性剂吐温、清洗剂，脂溶性小分表面活性剂吐温、清洗剂，脂溶性小分子化合物等，起诱导作用。子化合物等，起诱导作用。促进剂（促进剂（accelerantaccelerant）90 概念：降低泡沫的液膜强度和表面粘度，概念：降低泡沫的液膜强度和表面粘度，使泡沫破裂的化合物。使泡沫破裂的化合物。种类：种类：油脂类、酯类、硅油
45、及聚氧乙烯油脂类、酯类、硅油及聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚聚氧丙烯甘油醚。天然动植物油脂类、高分子化合物（高碳天然动植物油脂类、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯类、聚醚类、硅酮类）醇脂肪酸和酯类、聚醚类、硅酮类）作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。消沫剂消沫剂(defoaming agent)(defoaming agent)91 按用途：选择性、鉴别性、富营养培养基按用途：选择性、鉴别性、富营养培养基等等 按物理性质按物理性质:固体、半固体、液体培养基固体、半固体、液体培养基 按化学组成：合成、半合成、天然培养基按化学组成：合成、半合成、天然培养基 按发酵过程中所处位置和
46、作用：斜面或平按发酵过程中所处位置和作用：斜面或平板固体、种子、发酵和补料培养基。板固体、种子、发酵和补料培养基。培养基种类培养基种类92 概念：概念：细菌和酵母的固体斜面或平板培养基，细菌和酵母的固体斜面或平板培养基，链霉素和丝状真菌的孢子培养基。链霉素和丝状真菌的孢子培养基。制备：制备：液体培养基添加液体培养基添加1.0-2.01.0-2.0琼脂粉。琼脂粉。作用：提供菌体的生长繁殖，形成孢子作用：提供菌体的生长繁殖，形成孢子固体培养基固体培养基93 单细胞培养基：营养丰富，满足菌体生长迅速，单细胞培养基：营养丰富，满足菌体生长迅速，不能引起变异。不能引起变异。孢子培养基：基质浓度较低，无机
47、盐浓度适量，孢子培养基：基质浓度较低，无机盐浓度适量，以利于孢子形成。营养不宜太丰富，否则不易以利于孢子形成。营养不宜太丰富，否则不易产生孢子。产生孢子。固体培养基要求固体培养基要求94 概念概念：供孢子发芽和菌体生长繁殖，摇瓶和种子罐培养基，供孢子发芽和菌体生长繁殖，摇瓶和种子罐培养基，液体。液体。作用：作用：使种子扩大培养，增加细胞数目，生长形成强壮、使种子扩大培养，增加细胞数目，生长形成强壮、健康和高活性的种子健康和高活性的种子种子培养基种子培养基（seed mediumseed medium）95 培养基成分必需完全，营养丰富。培养基成分必需完全，营养丰富。用速效性、容易利用的碳、氮源
48、和无机盐用速效性、容易利用的碳、氮源和无机盐等物质，但浓度不宜高。等物质，但浓度不宜高。种子培养基要与发酵培养基相适应，主要种子培养基要与发酵培养基相适应，主要成分接近，不能差异太大。成分接近，不能差异太大。缩短发酵的延滞期。缩短发酵的延滞期。种子培养基要求种子培养基要求96 概念：概念：提供微生物生长、目标产物生成的生产用培养基提供微生物生长、目标产物生成的生产用培养基 作用：不仅要满足菌体的生长和繁殖，还要满足菌体作用：不仅要满足菌体的生长和繁殖，还要满足菌体合成目标产物，是发酵生产中最关键和最重要的培养合成目标产物，是发酵生产中最关键和最重要的培养基。基。发酵培养基的要求：发酵培养基的要
49、求：营养物质浓度和粘度适中，组成上丰富完整。营养物质浓度和粘度适中，组成上丰富完整。不同菌种和不同产物，对培养基的要求差异很不同菌种和不同产物，对培养基的要求差异很 大，组成和配方需要优化。大，组成和配方需要优化。发酵培养基（发酵培养基（fermentation fermentation medium)medium)97 概念：发酵过程中添加补充的培养基。概念：发酵过程中添加补充的培养基。作用：稳定工艺条件，延长发酵周期，提高目标产物作用：稳定工艺条件，延长发酵周期，提高目标产物产量。产量。组成：各种必要的营养物质，碳源、氮源、前体组成：各种必要的营养物质，碳源、氮源、前体 制备：按单一成分配
50、制，各自独立控制，或按一定比制备：按单一成分配制，各自独立控制，或按一定比例制成复合补料培养基例制成复合补料培养基补料培养基补料培养基98控制发酵培养基的质量控制发酵培养基的质量99100101102培养基设计一般原则培养基设计一般原则103二、灭菌操作工艺104 由于各种发酵过程所用的微生物菌种、培养基以及发由于各种发酵过程所用的微生物菌种、培养基以及发酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危害程度也酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危害程度也不同。不同。不管是对于哪种发酵过程，一旦发生染菌，都会由于不管是对于哪种发酵过程，一旦发生染菌，都会由于培养基中的营养成分被消耗或代谢产物被分解，严重
