1、真核基因表达调控真核基因表达调控叶棋浓叶棋浓军事医学科学院生物工程研究所军事医学科学院生物工程研究所医学分子生物学研究室医学分子生物学研究室真核基因表达真核基因表达DNA转录转录5端端加帽加帽m7Gppp切除切除3端和加尾端和加尾m7GpppAAAAAARNA拼接（拼接（GT-AG规则）规则）m7GpppAAAAAARNA运输到细胞质运输到细胞质m7GpppAAAAAA翻译（翻译（Kozak序列）序列）蛋白质蛋白质表型（细胞增殖、发育、分化、老化、机体稳定）表型（细胞增殖、发育、分化、老化、机体稳定）Pre-mRNA蛋白质加工及修饰蛋白质加工及修饰内含子内含子外显子外显子GT AG真核基因表达
2、调控层次真核基因表达调控层次*DNADNA水平上的调控水平上的调控*转录水平上的调控转录水平上的调控*转录后水平上的调控转录后水平上的调控*翻译水平上的调控翻译水平上的调控*翻译后水平上的调控翻译后水平上的调控DNA水平上的调控水平上的调控1.DNA的甲基化的甲基化3.基因缺失基因缺失4.基因扩增基因扩增5.基因重排基因重排2.DNA的点突变和多态性的点突变和多态性DNA水平上的调控水平上的调控1.DNA的甲基化的甲基化 常发生在常发生在5端的端的CpG序列处，一般与基因转录序列处，一般与基因转录抑制状态有关。抑制状态有关。3.基因缺失基因缺失 生理状态下，一般存在于进化程度较低的生物生理状态
3、下，一般存在于进化程度较低的生物中，如线虫在发育过程中存在着基因丢失现象。中，如线虫在发育过程中存在着基因丢失现象。病理状态下，如肿瘤发生时的基因缺失现象。病理状态下，如肿瘤发生时的基因缺失现象。2.DNA的点突变和多态性的点突变和多态性 发生在非编码区和编码区，影响基因的表达。发生在非编码区和编码区，影响基因的表达。甲甲基基化化与与肿肿瘤瘤p16 inactivation in primary tumorsHomozygous deletionMutationMethylation4.基因重排基因重排 包括基因间重排和基因内重排。如免疫球蛋白包括基因间重排和基因内重排。如免疫球蛋白结构基因的
4、表达调控，抗体重链和轻链中可变区、结构基因的表达调控，抗体重链和轻链中可变区、恒定区和连接区的重排，导致抗体的多样性。恒定区和连接区的重排，导致抗体的多样性。3.基因扩增基因扩增 基因数量（拷贝数）一时性增加的现象。生殖基因数量（拷贝数）一时性增加的现象。生殖细胞、体细胞、肿瘤细胞都存在基因扩增机制。细胞、体细胞、肿瘤细胞都存在基因扩增机制。DNA水平上的调控水平上的调控癌基因扩增癌基因扩增如：如：Her2、MyC、MyBHer2(IHC)Her2(FISH)染色体结构改变（易位）染色体结构改变（易位）转录水平上的调控转录水平上的调控*染色质结构与转录调控染色质结构与转录调控*顺式作用元件和反
5、式作用因子顺式作用元件和反式作用因子 的相互作用与转录调控的相互作用与转录调控染色质结构与转录调控染色质结构与转录调控染色质染色质(Chromatin)与染色体与染色体(Chromosome)的关系的关系*共同点共同点：基本组成成分相同，由：基本组成成分相同，由DNA和组蛋白和组蛋白组成组成*不同点不同点：构型不同，处于细胞周期不同阶段：构型不同，处于细胞周期不同阶段：（1）染色质：细胞周期间期）染色质：细胞周期间期（G1,S,G2)（2）染色体：细胞周期有丝分裂期（）染色体：细胞周期有丝分裂期（M）真核生物染色质在真核生物染色质在10 nm纤维、纤维、30 nm纤维和纤维和300 nm纤维纤
6、维3个水平上个水平上进行包装，最终形成致密的染色体。进行包装，最终形成致密的染色体。-10 nm-30 nm-300 nm染色质的组成成分染色质的组成成分*组成组成：DNA,组蛋白组蛋白,少量非组蛋白，少量少量非组蛋白，少量RNA 组蛋白：组蛋白：H1,H2A,H2B,H3和和H4五种组蛋白；五种组蛋白；富含碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸、组氨酸），富含碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸、组氨酸），与与DNA的磷酸根结合成键，抑制的磷酸根结合成键，抑制DNA转录。转录。染色质的基本结构单位染色质的基本结构单位：核小体（：核小体（nucleosome）核小体组成：核小体组成：核心组蛋白八聚体（核心组蛋白八聚
7、体（H2A,H2B,H3 和和H4 各各2 2拷贝）、组蛋白拷贝）、组蛋白H1和和200 bp200 bp的的DNA DNA 核小体核心：核小体核心：八聚体蛋白（八聚体蛋白（H2A,H2B,H3H2A,H2B,H3和和H4H4各个拷贝）各个拷贝）和和 200 bp200 bp 长长DNADNA。组蛋白组蛋白H1H1：连接核小体核心的组蛋白连接核小体核心的组蛋白 染色质染色质(Chromatin)的分类的分类*常染色质常染色质（Euchromatin）:less condensed portions of chromatin.*异染色质异染色质（heterochromatin）:regions
8、of chromatin that remain highly condensed.常染色质和异染色质比较常染色质和异染色质比较 Euchromatin heterochromatinExtended microfibrils condensed massesActive RNA synthesis No RNA synthesisEarly DNA replication Late DNA replicationMany DNA helix openings No DNA helix openingsDNase I-sensitive sites No DNase I-sensitive s
9、ites Loose binding of histones to DNA Tight binding of histones to DNAReduced number of nucleosomes Full number of nucleosomesDecrease during cell differentiation Increase during cell differentiationDecrease during cell division Increase during cell divisionIncrease during cell neoplasia Decrease du
10、ring cell neoplasia染色质结构不同水平的调节染色质结构不同水平的调节（Chromatin remodelling）*核小体水平的调节核小体水平的调节(10-30 nm)*大规模染色质（大规模染色质（large-scale chromatin）水平的）水平的调节：大于核小体范围调节：大于核小体范围(30 nm)染色质重组装染色质重组装（chromatin remodelling）是指染）是指染色质或核小体的结构、成分变化，这些变化具有色质或核小体的结构、成分变化，这些变化具有转录调控等作用。有以下转录调控等作用。有以下2方面调节方式：方面调节方式：核小体抑制基因转录的多个步骤（
11、核小体抑制基因转录的多个步骤（nucleosomal repression）核小体水平调节的核小体水平调节的2个重要机制个重要机制一、核心组蛋白的翻译后修饰一、核心组蛋白的翻译后修饰（Post-translational modifications of core histones;ATP-independent）二、二、ATP水解依赖的染色质重组装复合物水解依赖的染色质重组装复合物 的作用的作用(ATP hydrolysis-dependent chromatin remodeling activities)一、一、ATPATP不依赖的不依赖的核心组蛋白的核心组蛋白的 翻译后修饰翻译后修饰G
12、enetic code:64个密码子、个密码子、20种氨基酸。种氨基酸。Histone code:由由Strahl和和Allis提出（提出（Nature 2000,403:41）。大意是：特定的组蛋白修饰能使与之）。大意是：特定的组蛋白修饰能使与之相接触的相接触的DNA结构改变，进而使染色质的结构改结构改变，进而使染色质的结构改变，影响与染色质结合的蛋白因子（包括转录因变，影响与染色质结合的蛋白因子（包括转录因子）的亲和性，从而与特定的基因激活或抑制状子）的亲和性，从而与特定的基因激活或抑制状态相联系。组蛋白的这种修饰类似于遗传信息传态相联系。组蛋白的这种修饰类似于遗传信息传递中的密码。递中的
13、密码。核心组蛋白的翻译后修饰核心组蛋白的翻译后修饰修饰形式：修饰形式：组蛋白的酰基化组蛋白的酰基化(acetylation)、甲基化、甲基化(methylation)、磷酸化、磷酸化(phosphorylation)、泛素化、泛素化(ubiquitination)、ADP-核糖基化核糖基化(ADP-ribosylation)、类泛素化类泛素化(sumoylation)。酰基化：一般激活基因转录酰基化：一般激活基因转录甲基化：激活或抑制基因转录甲基化：激活或抑制基因转录磷酸化：一般磷酸化：一般激活基因转录激活基因转录泛素化：一般泛素化：一般激活基因转录激活基因转录类泛素化：一般抑制基因转录类泛素
14、化：一般抑制基因转录(1)(1)酰基化、甲基化、泛素化和类泛素化：酰基化、甲基化、泛素化和类泛素化：常在核小常在核小体表面的核心组蛋白的体表面的核心组蛋白的N N端尾部碱性氨基酸（赖氨酸端尾部碱性氨基酸（赖氨酸K K和精氨酸和精氨酸R R，以，以K K居多），少数在居多），少数在C C端和核小体内部。端和核小体内部。修饰位置修饰位置:(2)(2)磷酸化：磷酸化：常在组蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基处常在组蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基处Posttranslational modifications on histones组蛋白酰基化转移酶组蛋白酰基化转移酶(Histone AcetylTransferas
15、es，HATs)：Histone acetylation is catalyzed by HATs.如：哺乳类中如：哺乳类中p300/CBP、SRC-1、ATF2 组蛋白去酰基化酶组蛋白去酰基化酶（Histone deacetylases(HDACs)如：如：HDAC1-8核心组蛋白酰基化调节酶核心组蛋白酰基化调节酶组蛋白酰基化与去酰基化影响基因转录组蛋白酰基化与去酰基化影响基因转录组蛋白酰基化激活基因转录机理组蛋白酰基化激活基因转录机理 组蛋白酰基化使组蛋白携带正电荷量减少，组蛋白酰基化使组蛋白携带正电荷量减少，降低其与带负电荷降低其与带负电荷DNADNA链的亲和性，促使参与链的亲和性，促使
16、参与转录调控的各种蛋白因子与转录调控的各种蛋白因子与DNADNA结合，进而发结合，进而发挥转录调控作用。挥转录调控作用。组蛋白甲基化酶组蛋白甲基化酶 如：如：MLL家族成员使家族成员使H3K4甲基化，激活基因转录；甲基化，激活基因转录；SETDB1或或SUv39h使使H3K9甲基化，抑制基因转录甲基化，抑制基因转录 组蛋白去甲基化酶组蛋白去甲基化酶 如：如：LSD1使使H3K4去甲基化去甲基化组蛋白甲基化调节酶组蛋白甲基化调节酶组蛋白磷酸化酶组蛋白磷酸化酶 如：如：Aurora-B kinase、MSK1/2等使等使H3(Ser10)磷酸磷酸化，促进基因转录；化，促进基因转录；MSK1使使H2
17、A(Ser1)磷酸化，抑制磷酸化，抑制基因转录基因转录 组蛋白去磷酸化酶（磷酸酯酶）组蛋白去磷酸化酶（磷酸酯酶）组蛋白磷酸化调节酶组蛋白磷酸化调节酶组蛋白泛素化酶组蛋白泛素化酶 如：如：Rad6使使H2B-K123泛素化，促进基因转录泛素化，促进基因转录组蛋白去泛素化酶组蛋白去泛素化酶 组蛋白泛素化调节酶组蛋白泛素化调节酶泛素泛素-蛋白酶体通路蛋白酶体通路（Ubiquitin-proteosomeUbiquitin-proteosome pathway pathway）Ubiquitin system for protein degradation 2004 Nobel Prize in Ch
18、emistry The small protein ubiquitin plays a central role.Ubiquitin attached to obsolete proteins to dissemble.Ubiquitin is found in all eukaryotic cells and in cells throughout your body.The Nobel Prize in Chemistry 2004 was awarded to the Aaron Ciechanover,Avram Hershko,Irwin Rose who discovered it
19、s essential function in 1980.组蛋白类泛素化酶组蛋白类泛素化酶 如：如：Ubc9使使H2A-K126类泛素化，抑制基因转录类泛素化，抑制基因转录组蛋白去类泛素化酶组蛋白去类泛素化酶 组蛋白类泛素化组蛋白类泛素化(Sumoylation(Sumoylation)调节酶调节酶SUMO(Small Ubiquitin-like Modifier)SUMO is member of ubiquitin and ubiquitin-like superfamily Most SUMO proteins contain tetrapeptide motif B-K-x-D/E(
20、B:a hydrophobic residue,K:lysine and D/E:an acidic residue)Substrate specificity is derived from ubc9 and the respective substrate motifSUMO and Ubiquitin Alignments of ubiquitin and SUMO-1 indicate only 18%identical in amino acid sequence These two proteins have remarkably similar secondary and ter
21、tiary structures Unlike the ubiquitin system,which primarily targets substrate proteins to the proteasome,SUMO-1 conjugation has diverse cellular functions SUMO and Ubiquitin Unlike ubiquitin modification which targets proteins for degradation,SUMOylation 1.increases a proteins lifetime.2.change a p
22、roteins location in the cell SUMO modification of proteins has many functions.Among the most frequent and best studied are protein stability,nuclear-cytosolic transport,transcriptional regulation(mostly transcriptional repression).顺式作用：如顺式作用：如H3-K4 methylation影响影响H3-K9 methylation反式作用：如反式作用：如H2B-ubi
23、quitin影响影响H3-k4 methylation.It is the first time that the modification on one histones tail has been seen to affect what occurs on another histone tail.Defects in the ubiquitin pathway in mice already have been generally connected to male infertility.Sun Z et al.Nature 2002组蛋白修饰形式间的相互作用组蛋白修饰形式间的相互作用
24、*影响基因表达影响基因表达*影响生物学表型影响生物学表型组蛋白修饰的意义组蛋白修饰的意义表观遗传调控异常与肿瘤表观遗传调控异常与肿瘤Nature Reviews Genetics,2007,8:286-298Nature 2004,429:457-463利用组蛋白酰基化进行肿瘤治疗利用组蛋白酰基化进行肿瘤治疗由组蛋白去酰基化酶介导的由组蛋白去酰基化酶介导的重要基因表达的异常抑制重要基因表达的异常抑制细胞恶性转化细胞恶性转化重要基因表达恢复重要基因表达恢复表型逆转表型逆转组蛋白去酰基化酶抑制剂组蛋白去酰基化酶抑制剂（HDAC inhibitors）细胞生长停滞、凋亡、分化细胞生长停滞、凋亡、分化
25、Genes that are affected by HDAC inhibitors Upregulated genes substance p21,p27,TGF-b b1 TSAp21 Butyratep21,gelsolin,cyclin E Oxamflatinp21,gelsolin MS-27-275 组蛋白修饰的检测技术组蛋白修饰的检测技术*组蛋白与底物的作用组蛋白与底物的作用*修饰后组蛋白的免疫染色修饰后组蛋白的免疫染色*修饰后组蛋白的免疫沉淀修饰后组蛋白的免疫沉淀组蛋白与底物的作组蛋白与底物的作用用histones+(3H)acetyl-CoA (3H)acetyl-hist
26、onesproteins of interesthistones+(methyl-14C)-methionine (methyl-14C)-histonesproteins of interestpurified proteins of interest*histones修饰后组蛋白的免疫染色修饰后组蛋白的免疫染色修饰后组蛋白的免疫印迹修饰后组蛋白的免疫印迹Western blot检测核蛋白检测核蛋白二、二、ATP水解依赖的染色质重组装复合物的作用水解依赖的染色质重组装复合物的作用 转录水平上的调控转录水平上的调控-顺式作用元件和反式作顺式作用元件和反式作 用因子的相互作用与转录调控用因子的相
27、互作用与转录调控Minimal promoterSilencersenhancers真核基因转录装置真核基因转录装置geneCofactorsRNApolIIGTFsTFsTFsCofactorsCofactors转录起始的基本装置（转录起始的基本装置（basal apparatus/basal machinery）：）：由由RNA聚合酶和通用转录因子（聚合酶和通用转录因子（general transcription factors,GTFs）组成。）组成。Minimal promoterSilencersenhancersgeneRNApolIIGTFs转录起始的基本装置转录起始的基本装置不
28、同基因的转录由不同蛋白因子调节不同基因的转录由不同蛋白因子调节转录调控转录调控（转录起始、延伸和终止）（转录起始、延伸和终止）1 顺式作用元件顺式作用元件(cis-acting elements):promoters,enhancers,silencers2 反式作用因子反式作用因子(trans-acting factors):DNA-binding transcription factors and RNA polymerases 顺式作用元件顺式作用元件1.启动子启动子是指与RNA聚合酶结合并启动转录的 DNA序列。真核启动子一般包括转录起始位点及 其上游约100200bp的DNA序列，包
29、含有若干具有 独立功能的DNA序列元件，每个元件约长730bp。哺乳类哺乳类RNA聚合酶聚合酶启动子中常见的元件启动子中常见的元件:TATA box:TATAAAA 10 bp(TBP,30 kD)GC box:GGGCGG 20bp(SP-1,105 kD)CAAT box:GGCCAATCT 22bp(CTF/NF1,60 kD)启动子中的元件可以分为两种：启动子中的元件可以分为两种：核心启动子元件核心启动子元件(core promoter element)指指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，包括转序列，包括转录起始位点及其上游录起始位点及其上游2
30、5/30bp处的处的TATA盒。核心元盒。核心元件单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平件单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录。的转录。上游启动子元件上游启动子元件(upstream promoter element)包括通常位于包括通常位于70bp附近的附近的CAAT盒和盒和GC盒、以及距盒、以及距转录起始点更远的上游元件。这些元件与相应的蛋白因转录起始点更远的上游元件。这些元件与相应的蛋白因子结合能改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子结合能改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件，其位置也不相同，这使得不同的基因表达分别子元件，其位置也不相同，这使得不同
31、的基因表达分别有不同的调控。有不同的调控。2.增强子是一种能够提高转录效率的顺式调控元件增强子是一种能够提高转录效率的顺式调控元件 增强子提高同一条增强子提高同一条DNADNA链上基因转录效率，可以远链上基因转录效率，可以远距距 离作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。离作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。增强子作用与其序列的正反方向无关，将增强子方增强子作用与其序列的正反方向无关，将增强子方 向倒置依然能起作用。向倒置依然能起作用。增强子要有启动子才能发挥作用，但增强子对启动增强子要有启动子才能发挥作用，但增强子对启动 子没有严格的专一性。子没有严格的专一性。增强子一般具有组织或细胞特
32、异性，是由这些细胞增强子一般具有组织或细胞特异性，是由这些细胞 或组织中具有的特异性蛋白质因子所决定的。与其或组织中具有的特异性蛋白质因子所决定的。与其 他顺式调控元件一样，必须与特定的蛋白质因子结他顺式调控元件一样，必须与特定的蛋白质因子结 合后才能发挥增强转录的作用。合后才能发挥增强转录的作用。3.沉寂子（沉寂子（Silencers）是一种能够降低转录效率的顺式调控元件是一种能够降低转录效率的顺式调控元件 当这些当这些DNA位点被抑制性蛋白因子占据时，位点被抑制性蛋白因子占据时，可以使其附近的启动子活性降低甚至失活。这种可以使其附近的启动子活性降低甚至失活。这种作用也可不受沉寂子序列方向的
33、影响，也能远距作用也可不受沉寂子序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。顺式调控元件活性的测定顺式调控元件活性的测定报告基因法（报告基因法（reporter gene assay）:荧光素酶（荧光素酶（Luciferase）氯霉素乙酰转移酶（氯霉素乙酰转移酶（Chloramphenicol Acetyltransferase）b b-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（b-galactosidase）顺式调控元件顺式调控元件报告基因报告基因（Luc、CAT、b b-gal）顺式作用元件的活性测定顺式作用元件的活性测定 -萤光素酶报告基因的利用
34、萤光素酶报告基因的利用无无SV40 启动子和增强子序列启动子和增强子序列萤光素酶萤光素酶（luciferase）无无SV40 启动子但有增强子序列启动子但有增强子序列萤光素酶萤光素酶（luciferase）增强子增强子无无SV40增强子但有启动子序列增强子但有启动子序列萤光素酶萤光素酶（luciferase）启动子启动子既有既有SV40启动子又有增强子序列启动子又有增强子序列The putative regulatory elements组织特异性启动子：组织特异性启动子：如肝细胞特异性启动如肝细胞特异性启动子元件子元件HP1。诱导性启动子：诱导性启动子：如如cAMP反应元件等，介导反应元件等
35、，介导对对cAMP等信号的反应。等信号的反应。反式作用因子反式作用因子 指与指与DNA调控序列（顺式调控元件）结合的蛋白调控序列（顺式调控元件）结合的蛋白质因子。包括转录因子质因子。包括转录因子(transcription factors,TF)和和RNA聚合酶。聚合酶。在真核细胞中在真核细胞中RNA聚合酶通常不能单独发挥转录聚合酶通常不能单独发挥转录作用，而需要与其他转录因子共同协作。与作用，而需要与其他转录因子共同协作。与RNA聚合聚合酶酶、相应的转录因子分别称为相应的转录因子分别称为TF、TF、TF，对，对TF研究最多，用于研究最多，用于mRNA的产生。的产生。转录因子的分类（根据功能特
36、性）转录因子的分类（根据功能特性）能与能与DNA调控序列结合，改变调控序列结合，改变DNA的构象，影的构象，影响基因转录的因子。包括转录激活因子和转录抑制响基因转录的因子。包括转录激活因子和转录抑制因子。因子。转录激活因子（转录激活因子（Activator）:与与DNA调控序列结合并调控序列结合并 激活基因转录的因子。激活基因转录的因子。转录抑制因子（转录抑制因子（Repressor）:与与DNA调控序列结合并调控序列结合并 抑制基因转录的因子。抑制基因转录的因子。转录因子的分类（根据作用方式）转录因子的分类（根据作用方式）1 通用转录因子（通用转录因子（general transcripti
37、on factors,GTFs）2 组织特异性转录因子组织特异性转录因子 3 诱导性转录因子诱导性转录因子 在大多数细胞中普遍存在的一类通用的转录因在大多数细胞中普遍存在的一类通用的转录因子。是子。是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子，决定三种因子，决定三种RNA(mRNA、tRNA及及rRNA)转录转录的类别。的类别。RNA聚合酶聚合酶的基本转录因子：如的基本转录因子：如 TBP（TFII D）与与TATA盒结合盒结合 SP1 与与GC盒结合盒结合通用转录因子通用转录因子组织特异性转录因子组织特异性转录因子 如：淋巴细胞特异性转录因子如：淋巴细胞特异性
38、转录因子OCT2，仅在淋，仅在淋巴细胞中特异性表达，识别巴细胞中特异性表达，识别Ig基因启动子和增强子基因启动子和增强子中的中的ATTTGCAT序列。序列。诱导性转录因子诱导性转录因子 如：如：cAMP结合转录因子结合转录因子CREB、热休克转录、热休克转录因子因子HSTF、类固醇激素受体。、类固醇激素受体。转录因子的结构转录因子的结构 DNA-binding domain(DNA结合结构域）结合结构域）transactivation domain（转录激活结构域）（转录激活结构域）多由多由60100个氨基酸残基组成，可能含有以个氨基酸残基组成，可能含有以下某一结构域：下某一结构域：真核真核D
39、NA结合结构域结合结构域 1 螺旋螺旋-转角转角-螺旋螺旋(Helix Turn Helix,HTH)2 锌指结构：锌指结构：半胱氨酸半胱氨酸-组氨酸锌指、半胱氨酸锌指组氨酸锌指、半胱氨酸锌指3 碱性连接结构域：碱性连接结构域：碱性亮氨酸拉链、碱性螺旋碱性亮氨酸拉链、碱性螺旋-环环-螺旋螺旋(Helix Loop Helix,HLH)4 组蛋白样结构域组蛋白样结构域螺旋螺旋-转角转角-螺旋螺旋(HTH)：2个个a a螺旋，螺旋，a a螺旋间为一螺旋间为一b b转角转角常结合常结合CAAT盒盒 锌指结构：主要在真核生物锌指结构：主要在真核生物 半胱氨酸半胱氨酸-组氨酸锌指、半胱氨酸锌指组氨酸锌指
40、、半胱氨酸锌指 常结合常结合GC盒盒如如TFIIIA、SP1如如GAL4如类固醇激素核受体家族如类固醇激素核受体家族 碱性连接结构域：碱性连接结构域：碱性亮氨酸拉链、碱性螺旋碱性亮氨酸拉链、碱性螺旋-环环-螺旋螺旋(HLH)组蛋白样结构域：组蛋白样结构域：许多转录因子与不同的核心组蛋白同源，如人许多转录因子与不同的核心组蛋白同源，如人 TAFII31与与H3同源，同源，TAFII80与与H4同源。同源。按每间隔按每间隔6个氨基酸残基一个亮氨酸的规律排列个氨基酸残基一个亮氨酸的规律排列如如LEEKVKTLKAQNSEL，如，如AP-1家族、家族、CREB。HLH:如如Myc 常由常由30100个
41、氨基酸残基组成，可能含个氨基酸残基组成，可能含有以下某一结构域：有以下某一结构域：1 酸性酸性a a-螺旋结构域：如酵母转录因子螺旋结构域：如酵母转录因子GAL42 富含谷氨酰胺结构域：如富含谷氨酰胺结构域：如SP13 富含脯氨酸结构域富含脯氨酸结构域:如如AP1转录激活结构域转录激活结构域 转录因子大多以二聚体形式起作用转录因子大多以二聚体形式起作用Minimal promoterSilencersenhancersgeneCofactorsRNApolIIGTFsTFsTFsCofactorsCofactors 转录调控的实质在于蛋白质与转录调控的实质在于蛋白质与DNADNA、蛋白质、蛋白
42、质与蛋白质之间的相互作用。与蛋白质之间的相互作用。mRNAmRNA的的 转录起始转录起始polTFHTAFTFFTAFTAFTFATFBTBP真核真核RNA聚合酶聚合酶在转录因子帮在转录因子帮助下，形成的转录起始复合物助下，形成的转录起始复合物TATA DNATBP相关因子相关因子EBP转录因子转录活性的测定转录因子转录活性的测定1 与异源与异源DNA结合结构域融合结合结构域融合2 利用含转录因子应答元件利用含转录因子应答元件（responsive elements）的报告基因）的报告基因应答元件应答元件(responsive elements)(responsive elements)一组受
43、共同转录因子调控的基因，各基因都一组受共同转录因子调控的基因，各基因都有一个相同的序列元件，该元件是转录因子识别有一个相同的序列元件，该元件是转录因子识别靶基因的位点。靶基因的位点。如：雌激素应答元件（如：雌激素应答元件（ERE）、热休克应答）、热休克应答元件（元件（HSE）、血清应答元件（）、血清应答元件（SRE）。）。特点：特点：是启动子的上游元件或增强子，都含有短是启动子的上游元件或增强子，都含有短的共有（一致）序列，但不一定完全相同。的共有（一致）序列，但不一定完全相同。例如：例如：ERE:5-GGTCAnnnTGACC是是ER结合的序列，结合的基因有结合的序列，结合的基因有PR、pS
44、2、CatD等等与异源与异源DNA结合结构域融合结合结构域融合TranscriptionGAL UASGAL UASminimal promoterreporter genesDBDDBDADAD(LUC,CAT)GAL4 binding sites利用含转录因子应答元件的报告基因利用含转录因子应答元件的报告基因TranscriptionXREsXREsminimal promoterreporter genesDBDDBDADAD(LUC,CAT)TF responsive elements转录相关蛋白因子转录相关蛋白因子转录共激活子转录共激活子（Co-activator）:不与不与DNA调
45、控序列结合调控序列结合 但与转录激活因子结合并激活基因转录的因子。但与转录激活因子结合并激活基因转录的因子。转录共抑制子转录共抑制子（Co-repressor）:不与不与DNA调控序列结合调控序列结合 但与转录因子结合并抑制基因转录的因子。但与转录因子结合并抑制基因转录的因子。转录激活因子（转录激活因子（Activator）:与与DNA调控序列结合并调控序列结合并 激活基因转录的因子。激活基因转录的因子。转录抑制因子（转录抑制因子（Repressor）:与与DNA调控序列结合调控序列结合 并并 抑制基因转录的因子。抑制基因转录的因子。不需知道精确结合位点的蛋白质结合不需知道精确结合位点的蛋白质
46、结合DNADNA的检测的检测凝胶迁移试验（凝胶迁移试验（gel shift assay;electrophoretic mobility shift assay,EMSA）蛋白质与蛋白质与DNADNA结合反应的检测结合反应的检测蛋白质结合蛋白质结合DNADNA的结合位点的检测的结合位点的检测2 甲基化干扰试验（甲基化干扰试验（methylation interference assay）1 DNA足迹试验（足迹试验（DNA footprint analysis）3 染色质免疫沉淀（染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation）*DNAProtein*凝凝胶胶迁迁移
47、移试试验验蛋白质结合蛋白质结合DNADNA的结合位点的检测的结合位点的检测2 甲基化干扰试验（甲基化干扰试验（methylation interference assay）1 DNaseI足迹试验（足迹试验（DNaseI footprinting analysis）:广泛使用广泛使用DNaseIDNaseI足迹法足迹法 体外鉴定体外鉴定DNA结合蛋白在结合蛋白在DNA分子上的结合分子上的结合位点的方法位点的方法基本原理：基本原理：DNA分子上的特定序列与分子上的特定序列与DNA结合蛋结合蛋白结合后，该特定白结合后，该特定DNA序列受到保护而将不被序列受到保护而将不被DNaseI消化。消化。*32P*DNase I不完全不完全消化消化DNA变性变性电泳电泳*有有无无 结合结合*32P+DNaseIDNaseI足迹法足迹法染色质免疫沉淀染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation）染色质交联染色质交联超声断裂染色质超声断裂染色质免疫沉淀免疫沉淀Anti-histone,TF解除交联解除交联纯化纯化DNAPCRMicroarray，Seq
