1、免疫学技术及应用2第一节第一节 抗原或抗体的检测抗原或抗体的检测n抗原和相应抗体，无论在体内或体外相遇，均抗原和相应抗体，无论在体内或体外相遇，均可发生各种各样的反应，统称为抗原抗体反应。可发生各种各样的反应，统称为抗原抗体反应。n抗原抗原-抗体反应包括沉淀反应、凝集反应、溶解抗体反应包括沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体结合反应和中和反应等。反应、补体结合反应和中和反应等。抗原抗原-抗抗体反应可体反应可 用已知的特异性抗体检测未知的抗原；用已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。也可用已知的抗原检测未知的抗体。n免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技术、免疫荧光技术、
2、免疫酶技术、同位素标记技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原抗体发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原抗体反应的敏感性。反应的敏感性。3抗原抗体反应的规律和特点抗原抗体反应的规律和特点 n抗原与抗体能够特异性结合是基于两种分子间的结抗原与抗体能够特异性结合是基于两种分子间的结构互补性与亲和性，这两种特性是由抗原与抗体分构互补性与亲和性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的。子的一级结构决定的。1、特异性：一种抗原只能和由它刺激产生的抗体相结合，不能跟与它无关的抗体发生反应。这种特性是由抗原的决定簇基于抗体可变的的化学组成、空间立体构型所决定的。2、定比性：抗原一般都是多价的，而抗体（
3、IgG）则是二价的，只有二者比例适合时，抗原抗体才能结合得最充分，形成的抗原抗体复合物最多，反应最明显，结果出现最快，此称为等价带。43、可逆性：抗原与抗体的结合虽具有稳定性，但由于二可逆性：抗原与抗体的结合虽具有稳定性，但由于二者之间是非共价键结合，因此又是可逆的，在一定条者之间是非共价键结合，因此又是可逆的，在一定条件下可解离，且解离后各自生物活性不变。件下可解离，且解离后各自生物活性不变。4 4、分阶段反应、分阶段反应 ：第一为抗原与抗体发生特异性结合的：第一为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。
4、第二为可见反应阶段，此阶段反应慢，往可见反应。第二为可见反应阶段，此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。往需要数分钟至数小时。5 5、敏感性、敏感性 ：不仅可用于定性，还可用于检测极微量的：不仅可用于定性，还可用于检测极微量的抗原抗体，其灵敏程度大大超过当前应用的常规化学抗原抗体，其灵敏程度大大超过当前应用的常规化学方法。方法。56抗原抗体的检测方法抗原抗体的检测方法n凝集反应凝集反应n沉淀反应沉淀反应n补体溶血反应补体溶血反应 和补体结合反应和补体结合反应n中和反应中和反应n用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应7凝集反应凝集反应(Agglutination)n
5、 细菌、红细胞等细菌、红细胞等颗粒性抗原颗粒性抗原与相应抗体结与相应抗体结合后形成凝集合后形成凝集 现象，称为凝集反应。现象，称为凝集反应。n 1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。现象。又分为玻片法和试管法。n 2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。粒凝集现象。8910血血 球球 凝凝 集集11沉淀反应沉淀反应（Precipitation)
6、血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等液等可溶性抗原可溶性抗原与相应抗体结合后出现与相应抗体结合后出现沉淀物，这一类反应称为沉淀反应。沉沉淀物，这一类反应称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀。淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀。大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。12单向免疫扩散单向免疫扩散(Single Immunodiffusion)n是将一定量已知抗体混是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，于琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗在适当位置打孔后将抗原
7、加入孔中扩散。抗原原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量成环的直径与抗原含量成正比相关。本法常用于正比相关。本法常用于测定血清测定血清IgG、IgM、IgA 和和 C 3等的含量。等的含量。含抗体的凝胶含抗体的凝胶沉淀环沉淀环13双向免疫扩散双向免疫扩散（Double Immunodiffusion)n位于凝胶不同小孔中的抗原和抗体，当两者相对扩散时，经位于凝胶不同小孔中的抗原和抗体，当两者相对扩散时，经一定时间后，若两者相对应，会在琼脂小孔间、两者最恰当一定时间后，若两者相
8、对应，会在琼脂小孔间、两者最恰当的比例处形成白色沉淀线。观察沉淀线的位置、数量、形状的比例处形成白色沉淀线。观察沉淀线的位置、数量、形状以及对比各沉淀线之间的关系，可对抗原或抗体进行定性分以及对比各沉淀线之间的关系，可对抗原或抗体进行定性分析。析。n此方法可应用于以下方面：此方法可应用于以下方面：n（1）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行初步估）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行初步估算。算。n（2）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗体）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗体）n（3）抗原或抗体相对分子量的估计）抗原或抗体相对分子量的估计n双向琼脂扩散常见孔型有三孔型、双
9、孔型、双排孔型、梅花双向琼脂扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排孔型、梅花孔型孔型14双向免疫扩散15双向免疫琼脂扩散孔型 三孔型双孔型梅花孔型16n是将抗原与抗体分别加是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体本法常用于抗原或抗体的定性的定性、组成和两种抗、组成和两种抗原相关性分析的检测。原相关性分析的检测。17免疫
10、电泳免疫电泳（Immunoelectrophoresis)n免疫电泳为区带电泳与免疫电泳为区带电泳与双向免疫扩散的结合。双向免疫扩散的结合。先利用区带电泳技术将先利用区带电泳技术将不同电荷和分子量的蛋不同电荷和分子量的蛋白抗原在琼脂内分离，白抗原在琼脂内分离，然后在与电泳方向平行然后在与电泳方向平行的方向上开槽，加入抗的方向上开槽，加入抗血清。血清。37下使两者扩下使两者扩散，各区带蛋白在相应散，各区带蛋白在相应的位置与抗体反应形成的位置与抗体反应形成弧形沉淀线。弧形沉淀线。18火箭电泳火箭电泳（Rocket Electrophoresis)1920双向免疫电泳（two dimentional
11、 immuno-electrophoresis）n是一种将火箭电泳与血清免疫电泳相结合是一种将火箭电泳与血清免疫电泳相结合的方法。先将血清用电泳分离出各成分，的方法。先将血清用电泳分离出各成分，然后切下凝胶板转移至另一已加有抗血清然后切下凝胶板转移至另一已加有抗血清的凝胶上，进入垂直方向的第二次电泳，的凝胶上，进入垂直方向的第二次电泳，形成呈连续火箭样的沉淀线。形成呈连续火箭样的沉淀线。21补体结合反应补体结合反应（Complement Fixation,CFT)Complement Fixation,CFT)22免疫标记技术免疫标记技术n 用荧光素、同位素或酶等示踪物质用荧光素、同位素或酶等
12、示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大同时标记物的性质依然存在，因而极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。技术、免疫酶技术和同位素标记技术。23免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术(I
13、mmunofluorescence Technique)n 是用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素，是用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素，FITC)与抗体连接成荧光抗体，再与待与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。此对标本中的抗原作鉴定和定位。n 包括直接荧光法、间接荧光法和补体包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。法。24n直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作标本染直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作标本染色。该法的优点是特异性强，但其缺点是每检色。该法
14、的优点是特异性强，但其缺点是每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。n间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，再间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。该法的优点是敏感用荧光素标记的二抗染色。该法的优点是敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光亦会增用于多种抗原的检测，但非特异性荧光亦会增加。加。n补体结合免疫荧光法：此法是在间接法的第一补体结合免疫荧光法：此法是在间接法的第一步抗原步抗原抗体反应时加入补体，使之与抗原抗体反应时加入补体，使之与抗原抗体复合物结合；
15、再用荧光素标记的抗抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗C3抗体进行示踪。抗体进行示踪。2526间接免疫荧光法示意图间接免疫荧光法示意图27酶免疫测定酶免疫测定(Enzyme Immunoassay,EIA)n 是用酶（常用的有辣根过氧化物酶，是用酶（常用的有辣根过氧化物酶，HRP和碱性磷酸酶，和碱性磷酸酶，AP)标记的抗体进行的抗原标记的抗体进行的抗原抗体反应。抗体反应。EIA将抗原抗体反应的特异性与将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。常用的方法有酶联底物后显色来判定结果。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组
16、化法，前者测定可免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，溶性抗原或抗体，后者测定组织中或细胞后者测定组织中或细胞表面的抗原。表面的抗原。28酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)n是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、间接法心法、间接法BAS-ELISA等。等。29EL
17、ISA30放射免疫测定法放射免疫测定法(Radioimmunoassay,RIA)n是用放射性核素标记抗原进行的免疫学是用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。它将放射性核素显示的高灵检测技术。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使检测的敏感性达检测的敏感性达ng水平。常用于标记的水平。常用于标记的放射性核素有放射性核素有I125和和I131。常用于胰岛素、。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。生长激素、药物等微量物质的测定。31 Ag*Ab Ag 标记抗原 特异性抗体 待测抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗体复合物分离
18、Ag*-Ab 和游离Ag*从标准曲线上读知含量测定Ag*-Ab和/或游离Ag*放射性 放射免疫测定法放射免疫测定法(RIA)示意图示意图32RIA法原理及标准曲线法原理及标准曲线 7550 30 100110100 1000未标记抗原浓度（ng/ml)结合/未结合的放射活性（%）33免疫印迹法免疫印迹法(Immunoblotting)n是将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先是将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体，把电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。该再用酶免疫、放射免疫等技术测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量。常用于检测多种病毒其分子量。常用于检测多种病毒 如如HIV 的抗体或抗原。的抗体或抗原。34
