1、第十章发光免疫技术优选第十章发光免疫技术第一节第一节 概概 述述 发光发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:光照发光、生物发光、化学发光等。光照发光、生物发光、化学发光等。光照发光光照发光（photoluminescence）是指发光是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收
2、能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。发射出较长波长的可见光（荧光）。生物发光生物发光（bioluminescence）是指发生在生物是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATPATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。多余的能量以光子的形式释放出来。化学发光化学发光（chemiluminescence）是指伴随
3、化学反是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。一、化学发光一、化学发光 一些化学反应能释放足够一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激的能量把参加反应的物质激发到能发射光的
4、电子激发态，发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下：接化学发光。反应过程可简单地描述如下：A A十十B CB C*C C*C C hh其中其中为光子，为光子，C C*表示表示C C处于单线激发态。处于单线激发态。若激发能传递到另一个未参加化学反应若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子的分子D D上，使上，使D D分子激发到电子激发态，分子激发到电子激发态，D D分子从激发态回到基态时发光，这种过分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下：程叫间接
5、化学发光。反应过程可表示如下：A A十十B CB C*C C*十十D CD C十十D D*D D*D D十十hh化学发光免疫分析目前分类的能量把参加反应的物质激 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析1鲁米诺及其衍生物抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析其中为光子，C*表示C处于单线激发态。化学发光免疫分析目前分类化学发光效率（CL）决定于生成激发态产物分子的化学激发效率（CE）和激发态分子的发射效率（EM）。8m，表面的凸凹使包被面积放大。电化学发光剂反应原理一些化学反应能释放足够一些化学反应能释放足够其化学发光常是氧化反应的结果；电化学发光免疫分析（e
6、lectrochemiluminescence immunoassay，鲁米诺增强发光反应原理是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底标记磁颗粒在电场中发光工作示意图 化学发光效率（化学发光效率（CL）决定于生成激发态产物）决定于生成激发态产物分子的化学激发效率（分子的化学激发效率（CE）和激发态分子的发）和激发态分子的发射效率（射效率（EM）。）。化学发光反应的发光效率、光化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效
7、率。的化学发光光谱和不同的化学发光效率。二、化学发光效率二、化学发光效率化学发光免疫分析化学发光免疫分析目前分类目前分类 按发光剂不同分为按发光剂不同分为 1.1.发光酶免疫测定技术（发光酶免疫测定技术（CLEIACLEIA）2.2.化学发光免疫测定技术化学发光免疫测定技术(CLIA)(CLIA)3.3.电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定技术(ECLIA)(ECLIA)第二节第二节 化学发光剂和标记技术化学发光剂和标记技术 在化学发光反应中参与能量转移并最终在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。
8、化学发光剂或发光底物。一、化学发光剂一、化学发光剂能作为化学发光剂的条件：能作为化学发光剂的条件：发光的量子产率高；发光的量子产率高；它的物理它的物理-化学特性要与被标记或测定的化学特性要与被标记或测定的 物质相匹配；物质相匹配；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；其化学发光常是氧化反应的结果；其化学发光常是氧化反应的结果；在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。直接化学发光剂直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们需酶的催化作用，直接参
9、与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。接标记抗原或抗体。1.1.吖啶酯吖啶酯 在碱性条件下被在碱性条件下被H H2 2O O2 2氧化氧化时时,发出波长为发出波长为470nm470nm的光，具有很高的发的光，具有很高的发光效率，其激发态产物光效率，其激发态产物N-N-甲基吖啶酮是甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。该发光反应体系的发光体。电化学发光免疫测定示意图化学发光效率（CL）决定于生成激发态产物分子的化学激发效率（CE）和激发态分子的发射效率（EM）。直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反
10、应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷碳二亚胺（EDC）缩合法2三联吡啶钌 三联吡啶钌 RU(bpy)32+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。的能量把参加反应的物质激C*十D C十D*若激发能传递到另一个未参加化学反应抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底电化学发光免疫测定示意图电化学发光免疫分析示意图D分子从激发态回到基态时发光，这种过发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能
11、级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。发到能发射光的电子激发态，1鲁米诺及其衍生物 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析其中为光子，C*表示C处于单线激发态。抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，2 2三联吡啶钌三联吡啶钌 三联吡啶钌三联吡啶钌 RU(bpy)3RU(bpy)32+2+是是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPATPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。反应。三联吡啶钌三联吡啶钌电化学发光剂反应原理电化学发光剂反应原理 酶促反应发光剂：酶促反应发光剂：是利用标记酶
12、的催化作用，使发光剂（底是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底 物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂 称为酶促反应发光剂。称为酶促反应发光剂。1鲁米诺及其衍生物鲁米诺及其衍生物 2AMPPD1 1鲁米诺鲁米诺鲁米诺发光原理鲁米诺发光原理鲁米诺增强发光反应原理鲁米诺增强发光反应原理 2AMPPD3-(2-3-(2-螺旋金刚烷螺旋金刚烷)-4-)-4-甲氧基甲氧基-4-(3“-4-(3“-磷酰氧基磷酰氧基)苯苯-1,2-1,2-二氧杂环丁烷二氧杂环丁烷1.1.碳二亚胺（碳二亚胺（EDCEDC）缩合法）缩合法 二、发光剂的标记技术二、发光剂的标记技术C-O2.2
13、.过碘酸钠氧化法过碘酸钠氧化法 3 3重氮盐偶联法重氮盐偶联法 4.N-4.N-羟基琥珀酰亚胺活化法羟基琥珀酰亚胺活化法 1 1发光剂的选择发光剂的选择 2 2被标记蛋白质的性质被标记蛋白质的性质 3 3标记方法的选择标记方法的选择 4 4原料比原料比 5 5标记率标记率 6 6温度温度 7 7纯化与保存纯化与保存 影响标记的因素影响标记的因素第三节第三节 化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析的类型 用吖啶酯直接标记抗体用吖啶酯直接标记抗体(抗原抗原)，与待测标本中相应的抗，与待测标本中相应的抗原原(抗体抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原待测抗原
14、-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H H2 2O O2 2）和）和NaOHNaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光发光 。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。标准曲线上计算出待测抗原的含量。一、直接化学发光免疫分析一、直接化学发光免疫分析电化学发光免疫测定示意图2三联吡啶钌 三联吡啶钌 RU
15、(bpy)32+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫测定示意图其中为光子，C*表示C处于单线激发态。光照发光（photoluminescence）是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。在电场中因电子转移而发生特异性化学发光根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析在阳极表面 Ru(bpy)3 2+和TPA同时失去电子发生氧化反应。生物发光（bioluminescence）是指发
16、生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。TPA 将一个电子递给Ru(bpy)33+，而TPA被氧化。化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。C*十D C十D*碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图在阳极表面 Ru(bpy)3 2+和TPA同时失去电子发生氧化反应。3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,
17、2-二氧杂环丁烷的能量把参加反应的物质激它的物理-化学特性要与被标记或测定的的能量把参加反应的物质激发光发光Y YY磁微粒磁微粒被测抗原被测抗原+抗体抗体+带丫啶酯带丫啶酯标记物抗标记物抗体体YYYYYYYYYYY冲洗后冲洗后（1 1）加入加入H H2 2O O2 2（pH10）直接化学发光的机理直接化学发光的机理磁微粒模式图磁微粒模式图Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y特点特点 抗原和抗体结合与未结抗原和抗体结合与未结
18、合部分的易分离合部分的易分离磁微粒技术磁微粒技术 化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶或碱性磷酸酶(ALP)(ALP)来标记抗原或抗来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原体，在与待测标本中相应的抗原(抗体抗体)发生免疫反应后，形成发生免疫反应后，形成固相包被抗体固相包被抗体-待测抗原待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物底物(发光剂发光剂)，酶
19、催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。二、化学发光酶免疫分析二、化学发光酶免疫分析该分析系统采用辣根过氧化物酶（该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标）标记抗体记抗体(或抗原或抗原)，在与反应体系中的待测标，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体被抗体-待测抗原待测抗原-酶（酶（HRP）标
20、记抗体复合）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发和化学发光增强剂使产生化学发光。光增强剂使产生化学发光。辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图 该分析系统以碱性磷酸酶该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体标记抗体(或抗原或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原待测抗原-酶酶标记抗体复合物，这时加入标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光
21、剂，发光剂，碱性磷酸酶使碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。脱去磷酸根基团而发光。碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图 分配样品分配样品,磁颗粒磁颗粒和试剂和试剂孵育孵育使反应物使反应物结合结合在磁场中在磁场中清洗去除清洗去除未结合物质未结合物质加入加入底物底物产生产生信号信号孵育孵育,促使信号促使信号的产生的产生信号信号检测检测电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记是以电
22、化学发光剂三联吡啶钌标记 抗体抗体(抗原抗原)，以三丙胺，以三丙胺(TPA)(TPA)为电子供体，为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光在电场中因电子转移而发生特异性化学发光 反应，它包括电化学和化学发光两个过程。反应，它包括电化学和化学发光两个过程。三、电化学发光免疫分析三、电化学发光免疫分析v 电化学指电化学指在阳极表面在阳极表面 Ru(bpy)Ru(bpy)3 3 2+2+和和TPATPA同时失去同时失去电子发生氧化反应。电子发生氧化反应。自由基自由基TPATPA+失去一个质子（失去一个质子（H H+），成为），成为 自由基自由基TPATPA，这是一个强还原剂。，这是一个强还
23、原剂。TPATPA 将一个电子递给将一个电子递给Ru(bpy)Ru(bpy)3 33+3+，而，而TPATPA被被氧化。氧化。激发态的激发态的Ru(bpy)Ru(bpy)3 32+2+*在衰减时发射一个波在衰减时发射一个波长为长为620nm620nm的光子。的光子。化学发光包括化学发光包括电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫分析示意图反应过程可简单地描述如下：辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图3标记方法的选择其中为光子，C*表示C处于单线激发态。电化学发光剂反应原理是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底ECLIA检测流程图一（双抗体夹心的形成）的分子D上，使D分子激发到电子激发态，3-(
24、2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷激发态的Ru(bpy)32+*在衰减时发射一个波长为620nm的光子。能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；的能量把参加反应的物质激反应过程可简单地描述如下：3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷D*D十h抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，化学发光免疫测定技术(CLIA)TPA 将一个电子递给Ru(bpy)33+，而TPA被氧化。磁性微粒直径磁性微粒直径2.8m，表面的凸凹使包被面积放大。磁性微，表面的凸凹使包被面积放大。磁性微粒体积小，悬浮于反应体系中，形成均一稳定的液相，在磁粒体积小，悬浮于反应体系中，形成均一稳定的液相，在磁场中易于分离。场中易于分离。电化学发光免疫测定示意图电化学发光免疫测定示意图 电化学发光免疫测定示意图电化学发光免疫测定示意图标记磁颗粒在电场中发光工作示意图标记磁颗粒在电场中发光工作示意图ECLIA体系结构图体系结构图ECLIA检测流程图一检测流程图一（双抗体夹心的形成）（双抗体夹心的形成）ECLIA检测流程图二检测流程图二 （生物素与亲和素结合）（生物素与亲和素结合）
