1、蜡样芽孢杆菌检测GB/T 4789.14-2003 GB 4789.14-征求意见稿 检测程序 错误纠正及细节修改 形态观察 生化试验 主要修改如下：修改标准的中英文名称 增加第二法MPN法 更改MYP培养条件 增加根状生长实验 增加溶菌酶实验 增加附录A、附录BGB/T 4789.14-2003 检验程序：与6.1操作步骤不一致，此处稀释液培养不执行。内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD菌数测定将原来5个稀释度调整为2-3个稀释度。内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DA
2、IRY(GROUP)CO.,LTDGB 4789.14-XXXX内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD附加试剂异常问题 甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）培养基异常 正常 50%卵黄生产时污染微生物，平板培养后变黄，同时有异味。联系厂家换货。自行配置50%卵黄。（无菌操作，卵黄与等量灭菌生理盐水混合）内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD标准菌株蜡样芽孢杆菌标准菌株ATCC11778ATCC菌株不需要配置活化液，复溶后可直接涂抹平板。生长温度范围
3、为20-45，最适生长温度为30-37。内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD在一定条件下，生长发育后期细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.不建议将过氧化氢直接滴加于平皿上内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司原理：碘+淀粉-蓝色INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.取室温放置3 d4 d的营养琼脂培内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司明胶观察结果时，需放4,30min,而后观察结果，呈
4、液体状态为阳性，固态为阴性。滴加鲁格氏碘液，阳性培养基蓝色，菌落周围有透明圈。内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P试验反应、明胶液胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）+0.3%过氧化氢溶液，临用前配置，用水稀释内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司柠（枸）动 硝 VP 木 明 葡（厌氧）甘原理：蜡样芽孢杆菌代谢产生碱性蛋白酶，可水解酪蛋白成为小分子肽段，使菌落周围的培养基变透明。菌落形态ATCC 11778产生卵磷脂酶不发
5、酵甘露醇发酵甘露醇内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD蜡样芽孢杆菌显色培养基（海博）蜡样芽孢杆菌呈现蓝绿色，菌落较大。苏云金芽孢杆菌呈现蓝绿色。单增李斯特菌呈现深蓝色。其他菌呈现黄色或无色。G-菌抑制。内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD形态观察芽孢（隐藏的生命）营养体条件合适内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD芽孢染色 染液：孔雀绿孔雀绿+沙黄沙黄内蒙古蒙
6、牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD 芽孢 在一定条件下，生长发育后期细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。芽孢所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形（前孢子）。有些细菌中，芽孢的直径小于菌体直径，称芽孢杆菌。另一些细菌中，芽孢的直径大于菌体直径，使整个菌体呈梭形或鼓槌状，这些细菌称为梭状芽孢杆菌，为厌氧菌。2，6-吡啶二羧酸（DPA）内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD培养
7、特性内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD生化性状内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD生化鉴定套装 可使用陆桥或海博生化鉴定套装内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD生化试验(陆桥)柠（枸）动 硝 VP 木 明 葡（厌氧）甘-+-+-明胶、硝酸盐穿刺接种，其他滴加菌液内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GRO
8、UP)CO.,LTD生化试验(海博)1.揭开盖板2.撕开封口膜3.标记4.制备菌液，加入试剂孔5.盖上盖板，培养后填写结果表并报告。内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD明胶液化实验 注意事项：注意事项：1.明胶观察结果时，需放4,30min,而后观察结果，呈液体状态为阳性，固态为阴性。2.葡萄糖利用试验，需厌氧条件培养，变为黄色为阳性。内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTDINNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP
9、)CO.INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深采用点种的方式接种，可以清晰的看到透明环。阳性菌落周围培养基出现澄清透明区，INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.滴加鲁格氏碘液，阳性培养基蓝色，菌落周围有透明圈。蜡样芽胞杆菌菌株不具形成根状生长的特征。INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GRO
10、UP)CO.INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.14-2003 GB 4789.蜡样芽胞杆菌生化特征与其它芽胞杆菌的区别自然干燥，微火固定，甲醇作用30s，挑取单个菌落置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2ml，观察结果内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.在一定条件下，生长发育后期细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.过氧化氢酶实验 3%过氧化氢溶液，临用前配置，用水稀释 挑取单个菌落置
11、于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2ml，观察结果 阳性半分钟内产生气泡 阴性不产生气泡 原理：过氧化氢 水+氧气 载玻片接触酶实验 不建议将过氧化氢直接滴加于平皿上过氧化氢酶内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD溶血实验 胰酪胨大豆养血（TSSB）琼脂 陆桥CM136（TSSB基础）+P62（无菌脱纤维羊血）301培养242h，菌落浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环。内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD根状生长实
12、验 间隔0.5cm左右距离划平行直线于营养琼脂平板上，301 培养24h2h。蕈状芽胞杆菌形成根状生长的特征。蜡样芽胞杆菌菌株不具形成根状生长的特征。蜡样芽胞杆菌蕈状芽胞杆菌内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD酪蛋白酶实验 酪蛋白琼脂 培养基成分中酪蛋白不会溶解 接种可以菌落，361 培养482h 阳性菌落周围培养基出现澄清透明区，表示产生酪蛋白酶。阴性反应继续培养72h观察 原理：蜡样芽孢杆菌代谢产生碱性蛋白酶，可水解酪蛋白成为小分子肽段，使菌落周围的培养基变透明。采用点种的方式接种，可以清晰的看到透明环。内蒙古
13、蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD蛋白质毒素结晶试验 步骤：步骤：1.取室温放置3 d4 d的营养琼脂培养物少许涂于载玻片。2.自然干燥，微火固定，甲醇作用30s，火焰干燥.3.滴0.5碱性复红，火焰加热（微见蒸气，勿使染液沸腾)持续1 min2 min，移去火焰。更换染色液加温30 s，水清洗、晾干后镜检。结果观察：结果观察：观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深红色的菱形、正方形或其它形状的蛋白结晶体（伴孢晶体）。芽孢芽孢蛋白结晶体蛋白结晶体内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU
14、DAIRY(GROUP)CO.,LTD溶菌酶耐性试验 用接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，361培养24 h。蜡样芽胞杆菌在本培养基(含0.001 溶菌酶)中能生长。如出现阴性反应，应继续培养24h。结果观察：混浊现象 培养基：溶菌酶肉汤基础+溶菌酶溶液内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD蜡样芽胞杆菌生化特征与其它芽胞杆菌的区别内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD生化分型（选作）根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P试
15、验反应、明胶液化试验，将蜡样芽胞杆菌分成不同生化型别。内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTD淀粉酶实验 培养基：培养基：胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）+0.2%可溶性淀粉，灭菌倒板。步骤步骤：1.接种平板，361培养18-24h；2.滴加鲁格氏碘液，阳性培养基蓝色，菌落周围有透明圈。原理：原理：碘+淀粉-蓝色内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.,LTDThank You!内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU D
16、AIRY(GROUP)CO.,LTD蜡样芽胞杆菌菌株不具形成根状生长的特征。内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司Thank You!内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.如出现阴性反应，应继续培养24h。INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.异常 正常取室温放置3 d4 d的营养琼脂培原理：蜡样芽孢杆菌代谢产生碱性蛋白酶，可水解酪蛋白成为小分子肽段，使
17、菌落周围的培养基变透明。养后变黄，同时有异味。采用点种的方式接种，可以清晰的看到透明环。蜡样芽孢杆菌呈现蓝绿色，菌落较大。INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.蜡样芽胞杆菌生化特征与其它芽胞杆菌的区别内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司化试验，将蜡样芽胞杆菌分成不同生化型别。INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.可使用陆桥或海博生化鉴定套装蜡样芽孢杆菌
18、呈现蓝绿色，菌落较大。在一定条件下，生长发育后期细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。2%可溶性淀粉，灭菌倒板。结晶体（伴孢晶体）。INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P试验反应、明胶液在一定条件下，生长发
19、育后期细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.过氧化氢 水+氧气INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.明胶观察结果时，需放4,30min,而后观察结果，呈液体状态为阳性，固态为阴性。INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GRO
20、UP)CO.用接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，361培养24 h。观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）+0.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司柠（枸）动 硝 VP 木 明 葡（厌氧）甘结晶体（伴孢晶体）。内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.过氧化氢 水+氧气陆桥CM136（TSSB基础）+P62（无菌脱纤维羊血）内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.INNER MONGLIA MENGN
21、IU DAIRY(GROUP)CO.采用点种的方式接种，可以清晰的看到透明环。内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.蜡样芽胞杆菌菌株不具形成根状生长的特征。301培养242h，菌落浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环。明胶观察结果时，需放4,30min,而后观察结果，呈液体状态为阳性，固态为阴性。在一定条件下，生长发育后期细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P试验反应、明胶液INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY(GROUP)CO.培养基：溶菌酶肉汤基础+溶菌酶溶液过氧化氢 水+氧气内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司葡萄糖利用试验，需厌氧条件培养，变为黄色为阳性。（无菌操作，卵黄与等量灭菌生理盐水混合）胰酪胨大豆养血（TSSB）琼脂培养基成分中酪蛋白不会溶解采用点种的方式接种，可以清晰的看到透明环。蜡样芽胞杆菌菌株不具形成根状生长的特征。自然干燥，微火固定，甲醇作用30s，2%可溶性淀粉，灭菌倒板。观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）+0.谢谢观看！
