1、炭疽的病原学与实验室检测炭疽的病原学与实验室检测自治区疾控中心应急办自治区疾控中心应急办赛娜瓦尔赛娜瓦尔1内容内容l病原学 l培养特性与生化反应l抗原结构l致病性l毒力l变异性l抵抗力l军事医学意义l实验室检测l鉴定方法2病原学病原学形态与染色形态与染色 炭疽芽孢杆菌是病原菌中最大的杆菌之一，大小为（35）um（11.2）um，革兰氏染色阳性，无鞭毛，无动力，有荚膜，能形成芽孢。镜检两端平切，在动物和人体标本中，常呈单个或短链排列，在人工培养基中常形成竹节状长链，有的链长达数百个菌体，菌体相连处有胞间链丝。3456形态与染色形态与染色 炭疽杆菌在机体内或含血清或碳酸氢钠特殊培养基中可形成荚膜。
2、荚膜抗腐败能力大于菌体，因此在腐尸检片中可见到称为菌影的无内容物的荚膜。荚膜是由质粒DNA编码，无毒菌株不产生荚膜。荚膜成分为D-多聚谷氨酸，由荚膜质粒控制，与炭疽杆菌治病力有关，在体内能抑制白细胞的吞噬和消化，在体外能阻断菌体胞壁上的噬菌体受体，有助于病菌在体内繁殖扩散和建立感染。病原学病原学7 芽孢芽孢 炭疽杆菌是需氧芽孢杆菌属（Bacillus）中最重要的致病菌，在有氧、温度适宜（25-30）的外界环境或人工培养基上，易形成芽孢。芽孢位于菌体中央，呈椭圆形，孢子囊不膨大。芽孢又称内生孢子，带有完整的核质、酶系统，合成菌体的机构，保存细菌的全部生命活性。病原学病原学8图1 在血琼脂平板上炭
3、疽杆菌 G（X1000）图2 带芽胞炭疽杆菌，G（1000）9芽孢芽孢在适宜的条件下，芽孢通过激活、发芽、生长3个阶段又可成为新的繁殖体，继续分裂、增殖、活跃生长，所以芽孢是处于休眠状态的细菌，广泛存在于空气、尘埃、地表、水源、土壤和腐烂物体中。每种细菌的芽孢形态、大小和在菌体中所处部位相当稳定，这在细菌鉴别上重要意义。病原学病原学10芽孢芽孢芽孢具有多层厚膜结构，其中芽孢壳由一种类似角蛋白的疏水蛋白组成，非常致密、不具渗透性，对外界抵抗力强，能抵抗表面火性剂、化学药物的渗透和常用物理灭菌法。病原学病原学11芽孢芽孢炭疽芽孢污染点难以彻底消除，往往成为顽固疫点，是炭疽的自然疫源地，也是炭疽在畜
4、间、人间暴发流行的源头。芽孢是炭疽杆菌在自然条件下存在的主要形式；在宿主体内和完整尸体内，炭疽杆菌保持繁殖体形态，不形成芽孢。所以，炭疽病死尸体严禁解剖、屠宰、剥皮，以防止炭疽芽孢污染环境。病原学病原学12芽孢芽孢由于炭疽芽孢可大量制备、长期存放，并适宜于气溶胶施放，其在军事医学上有特殊意义。人吸入极微量的炭疽芽孢即可造成致死性感染。美国国会报告中称，于大都市在适宜的气象条件下施放1Kg的炭疽芽孢，可造成数十万人员死亡，其威力可见一斑。病原学病原学13 培养特性与生化反应培养特性与生化反应 炭疽杆菌营养要求不高，一般营养肉汤和普通琼脂均可生长，需氧菌或蒹性厌氧菌，最适pH7.2-7.4，最适温
5、度34-37，低于12或高于45则不能生长。菌落灰白色粗糙型，表面稍隆起，干燥无光泽不透明，边缘不整齐，常有小尾突起，放大镜观察菌落呈卷发状，边缘有菌丝射出的典型菌落形态。14 培养特性与生化反应培养特性与生化反应 培养3天后，菌落表面有小泡状颗粒即所谓仔集落。在血琼脂平板上，早期无溶血环，培养24h后有轻微溶血。有毒株在含动物血清培养基或0.9%NaHCO3培养基，置于20%CO2、37条件下培养24-48h可形成粘液性菌落，用接种针挑取时可见拉丝状，此粘液物质为炭疽菌的荚膜，主要成分为D-多聚谷氨酸：无毒株不形成荚膜，菌落仍保持粗糙型。15 培养特性与生化反应培养特性与生化反应 炭疽杆菌在
6、适当浓度青霉素溶液作用下，菌体形态发生肿胀，成为均匀链状串珠，称为串珠试验，对本菌有鉴别意义，其他需氧芽孢杆菌无此现象。16 培养特性与生化反应培养特性与生化反应在肉汤培养时由于形成长链，呈絮状发育，管底有絮状、卷绕成团的沉淀，液体透明，摇之均匀浑浊，不形成菌膜或壁环。炭疽杆菌能分解葡萄糖、麦芽糖、果糖，产酸不产气，不分解乳糖、阿伯拉糖、甘露醇、水杨素，不产生H2S。在明胶培养基中经3724h培养，可使表面液化呈漏斗状，由于细菌沿穿刺线向四周扩散成倒松树状生长。17 在某些培养基上，炭疽杆菌在培养6h开始产生紫红色色素，在碱性条件下为红色，24h达高峰，色素的生物学功能不详，据认为与培养基的硫
7、酸亚铁含量有关。培养特性与生化反应培养特性与生化反应18抗原结构抗原结构 炭疽芽孢杆菌的抗原组成主要包括荚膜抗原、菌体抗原、芽孢抗原及保护性抗原等四种成分。19抗原结构抗原结构 荚膜多肽抗原：仅见于有毒菌株，是由D-谷氨酸多肽组成的一种半抗原，可由腐败破坏而失去抗原性，具抗吞噬作用。与细菌毒力有关。由质粒DNA（pOX2）编码，质粒丢失，形成荚膜能力也消失。荚膜抗原所产生的抗体对动物无保护作用。若以高效价抗荚膜多肽血清作荚膜肿胀试验及免疫荧光抗体试验，对鉴定本菌有一定意义。20 抗原结构抗原结构菌体多糖抗原：由N-乙酰葡萄胺、D-半乳糖组成，与毒力无关。由于耐热、耐腐败，在病畜皮毛和腐败脏器中
8、的此抗原虽经长时间煮沸仍可与相应抗体（特异免疫血清）发生沉淀反应，称Ascoli热沉淀反应，对追溯炭疽芽孢杆菌病源方面有用。但由于此抗原特异性不高，与其他需氧芽孢杆菌、14型肺炎链球菌，甚至人类A血型抗原之间发生交叉反应，故Ascoli反应目前已很少使用。21 抗原结构抗原结构 芽孢抗原：由芽孢的外膜、芽孢壳等组成的芽孢特异性抗原，具有免疫原性和血清学诊断价值。最新研究发现炭疽芽孢抗原在炭疽芽孢感染、致病和免疫上也起作用。芽孢外膜的胶原样糖蛋白是免疫显性抗原，能刺激机体产生强烈免疫应答。22 抗原结构抗原结构保护性抗原（PA）：是一种胞外蛋白质抗原成分，在人工培养条件下亦可产生，为炭疽毒素的组
9、成成分之一，具有免疫原性，能使机体产生抗炭疽杆菌的保护力。23 庄汗澜、牟兆钦等探讨了保护性抗原（PA）的免疫机制，发现：1、PA免疫后，动物产生抗PA抗体、血中吞噬细胞被激活，抗PA抗体除中和作用外，在体内能直接杀灭炭疽芽孢杆菌；2、PA免疫动物抑制入侵的炭疽芽孢出芽，在炭疽强毒芽孢攻击后1-3天内，PA免疫兔的肝、脾、淋巴结切片中只见少量芽孢而无繁殖体，而对照兔组织内细菌以繁殖体为主；抗原结构抗原结构243、PA能非特异性的激活小鼠腹腔吞噬细胞，增强对入侵炭疽芽孢和金葡菌的吞噬和杀灭；4、被动转移PA免疫小鼠的血清和T细胞均可提高受体小鼠对炭疽芽孢的攻击保护，细胞免疫反应较弱，起着辅助B细
10、胞的作用；抗原结构抗原结构255、抗PA抗体水平与保护力之间并不绝对呈平行关系、如粗制PA免疫，抗体滴度不很高攻击后动物存活，而用纯化PA免疫，抗体滴度很高攻击后却有动物死亡，提示除抗PA抗体外，吞噬细胞及其他防御因素也参与抗炭疽保护力的形成。抗原结构抗原结构26 致病性致病性炭疽杆菌对绵羊、山羊致病力最强，牛、马、驴、骡、驼、鹿等草食动物皆很易感，猪、犬、猫等杂食动物亦可感染；虎、狮、豹、狼等肉食动物，误食炭疽病畜肉，亦可引起感染而死亡。猪常无症状，仅在宰后肉检时才被发现。或仅局部出现淋巴结炎、咽峡炎，个别出现肺炎及败血症。27 前苏联一家动物园因喂食病马肉，使一些豺、獾、貂、黄鼬、美洲豹、
11、山猫、豹死亡，白熊感染发病。家畜改良品种较土种易感，幼龄家畜较老龄家畜易感。人对炭疽杆菌中等敏感、介于草食和肉食动物之间。实验动物猴、兔、羊、豚鼠、大鼠、小鼠对炭疽人工感染皆相对敏感，其中猴、兔、羊、较豚鼠、大鼠、小鼠敏感。在感染濒死阶段（临死前10-14h），血中菌数倍增时间：小鼠、豚鼠为50min，羊95min，大鼠115min。致病性致病性28炭疽毒株芽孢皮下感染兔后，芽孢出芽、增殖，全身扩散，血、肝、脾、肺、淋巴结等组织都可找到炭疽杆菌和芽孢，当菌数达108/ml时，实验兔死亡。肺中菌数约比其他脏器高10倍；组织切片可见吞噬细胞内有芽孢和大量短链菌体位于细胞间隙。按照猴数据推算，人LD
12、50计量为吸入2500-55000个炭疽芽孢。F-344大鼠是炭疽毒素试验的模型动物。致病性致病性29在自然界，野鼠中鼬鼠特别敏感，曾从自然条件中的大沙土鼠、黄胸鼠体内分离出炭疽杆菌。鸟类在自然条件下是不感染的，只有马达加斯加和南部非洲的鸵鸟较常患病。曾有报告，青蛙和鱼也能感染炭疽，国内也曾有从鱼体内分离出炭疽杆菌的报道。致病性致病性30 毒力毒力炭疽的毒力依赖于荚膜和毒素两种成分，这两种成分是由不同质粒编码的。荚膜物质在体内可防御吞噬消化，在体外可掩盖噬菌体受体，免于被噬菌体裂解。毒素含有三个因子，即水肿因子（EF）、致死因子（LF）和保护性抗原（PA）。其中水肿因子（EF）能使血管渗透压增
13、加，大量浆液渗出，红细胞大量溶解引起血红蛋白和氧结合不全，可产生缺氧性休克；31致死因子（LF）是非常强大的毒素，只要一分子进入细胞，就可以导致细胞死亡。致死因子作用于中枢神经，可以引起中枢麻痹，导致呼吸衰竭而死亡。这两种毒素的作用都需要保护性抗原的协同才能发挥作用。毒素作用是死亡的主要原因，但毒素产生的本身并不能使炭疽菌具有完全毒力，该菌需要在一个地方繁殖并从那里扩散，从而在体内产生致死量的毒素，这就需要荚膜的抗吞噬作用。所以完全毒力的炭疽杆菌至少有两个特点：有荚膜、能产毒。毒力毒力32 变异性变异性 在自然条件下，炭疽杆菌易受物理、化学、生理因素影响而发生变异。实验时会出现形状不一的光滑型
14、或黏液型菌落、无明显卷发状边菌落、显示色素的菌落、不产生荚膜的菌株、毒力减弱或消失的菌株。33 变异性变异性巴斯德（Pasteur1881年）通过42.5高温连续培育研制出兽用菌苗即炭疽杆菌减毒疫苗。Vodkin和Leppla(1983年)首先发现了炭疽杆菌毒素质粒，Green等（1985年）又发现了炭疽杆菌荚膜质粒，后分别命名为Pxo1和Pxo2。34 变异性变异性 两个质粒的相继发现，证明了炭疽杆菌的自然毒力处决定于染色体基因外，还与两个编码质粒有关，从而对培养传代减毒、通过机体减毒、强烈理化因素作用等人工获得减毒菌株的方法中的分子机制和有关炭疽毒素产生的遗传学提供了合理的解释。35 梁旭
15、东等（1994年）对我国不同时期、不同地区、不同来源所收集的炭疽杆菌进行了质粒电泳图分析谱分析，强毒株含有两个质粒，弱毒株因表现型不同，所含质粒各异，但只能单一存在。我国杨叔雅等通过新生霉素、紫外线等理化因子诱变、筛选，或无荚膜减毒株。现已清楚，这些都是由于编码荚膜和毒素的质粒丢失而引起的变异。变异性变异性36 变异性变异性Boehm用DNA-DNA杂交技术检测多株炭疽杆菌和蜡状杆菌发现，10株炭疽杆菌强、弱毒株的DNA同源性为90%-99%，与17株蜡状杆菌的DNA同源性为32%-59%。根据伯杰氏鉴定细菌学手册，种内同源性为70%，亚种间同源性为60%-70%。炭疽杆菌与其他需氧芽孢杆菌的
16、同源性未高于59%，因此炭疽杆菌应视为独立种。37 变异性变异性大家公认全球的炭疽杆菌菌株间无多大差异，最近Smith等用重复序列可变数法分析从非洲Kruger国家公园分离的98株炭疽菌存在A、B2个基本型。全球引起炭疽暴发流行的菌株皆属A型。仅非洲存在A、B2个型菌株。分离出B型菌株土壤的钙含量和pH值高于A型，提示基因型与泥土的化学特性相关。38 抵抗力抵抗力 炭疽杆菌繁殖体在562h、6015min、75 1min即可灭之。常用的消毒方法也能迅速杀灭。繁殖体在干燥的血液中能生存1个月以上，对低温抵抗力较强，保存于-15 鲜肉中能存活两周以上。39 抵抗力抵抗力芽孢对外界因素的抵抗力很强，
17、气溶胶的衰亡率0.1%/min。炭疽芽孢在学块和动物粪粒中可存活40年以上，在干燥明胶或琼脂中保存55年仍能发芽和有毒力，染色标本中的芽孢仍可引起实验感染，在皮革中也能生存数年。40 抵抗力抵抗力Peeler证明，在堆肥中，温度达72-76.5，4天内可杀死芽孢。腌渍一个半月可杀死肉中菌体，但芽孢仍有存活。经石灰水处理的皮革在125天后芽孢仍有存活。所以在自然条件下，炭疽芽孢在引发炭疽感染和传播上起着主要作用。据报告煮沸10min、140干热2h、湿热121需30min和2h，紫外线照射需4h才能将芽孢杀死。41 抵抗力抵抗力化学消毒剂以强氧化剂效果为好，如过氧乙酸、氯亚明、环氧乙烷。炭疽芽孢
18、对碘敏感，1：2500碘液10min即可破坏芽孢，如有污秽物不宜使用。新配制的20%石灰乳、20%漂白粉需浸泡48h，可杀死芽孢。甲醛杀灭力强，在有大量有机物存在时，采用10%甲醛溶液较1%碘液好。42 抵抗力抵抗力因此对炭疽杆菌消毒效果的评价，应以芽孢是否被消灭为标准，即使残存几个芽孢也会引起严重后患。1964年Wilson报道在干燥土壤中的炭疽芽孢40年后仍能发芽、致死动物。1959年我国因挖掘64年前埋葬的墓地引发炭疽疫情。43 1970年，在某一国家公园，考古学家在考古时挖掘出一些骨骼，根据碳原子测定，估计约有200年左右，该骨骼经培养后分离出炭疽杆菌。被炭疽芽孢污染的地表自然疫源地，
19、土壤中的病原体虽在阳光等环境因素作用下存在生物衰亡，但30年后仍可检测出相当数量有感染力的芽孢，可引起炭疽暴发流行。抵抗力抵抗力44 抵抗力抵抗力 牧场一旦被污染，传染性往往达30年以上。1941-1942年，英国在苏格兰实验炭疽芽孢炸弹，估计约41014个芽孢被扩散，安置于起爆点下风向的羊在几天内死于炭疽，说明炭疽芽孢可通过爆炸分散成气溶胶，使牲畜吸入感染死亡。第二次世界大战后的20多年中，每年皆查出活芽孢。，1979年（污染后37年）从约6cm的深的土层中仍检出活芽孢。45抵抗力抵抗力为了消除污染，1986年英国国防部多次使用表面喷洒、钻孔注入甲醛液，历时一年多才洗消结束，共用去280吨福
20、尔马林和2000吨海水。由此可见，在泥土中炭疽芽孢可存活至少37年以上，杀灭它非常困难。炭疽菌对青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、环丙沙星多种抗生素皆敏感，美国报道存在含有青霉素酶菌株，将减低青霉素的疗效46军事医学意义军事医学意义 炭疽芽孢长期被日、美、英、伊拉克和前苏联等国家作为致死性战剂加以研究和储备，美军将炭疽杆菌列为制式生物战剂。WHO 顾问组将炭疽杆菌列为可能的生物战剂。1940年设在哈尔滨郊区的“731”细菌部队每月以能生产炭疽杆菌500-600公斤。1952年侵朝战争中，美国飞机在辽宁投掷带有炭疽杆菌的羽毛、杂物，曾使5人患吸入性炭疽和炭疽脑膜炎致死。47军事医学意义军事医学意义
21、据国外报道，1979年前苏联的Sverdlovsk事件，曾发生吸入性炭疽，至少79人感染，68人死亡。1985-1991年，伊拉克秘密研制炭疽战剂，至海湾战争前夕以完成生物战剂导弹的装填，所幸战争期间并未使用。美国“9.11”事件以后，又发生无数起炭疽粉末相关生物恐怖事件，更加深了全世界对本病原体的重视和研究48实验室检测实验室检测检验程序实验室检测的要求是快速检出、分离病原菌和正确鉴定，以利早期确诊、查清疫源、及时治疗和采取正确合理的防治对策。炭疽杆菌的检验操作应按炭疽细菌学检查要求（）进行。49实验室检测实验室检测检验方法1、标本采集和处理样品采集的原则是在治疗、消毒处理前，尽量无菌、多部
22、位、采足量，注意个人、环境防护，妥善运送。对疑似炭疽污染样品推荐用多黏菌素-溶菌酶-EDTA-醋酸佗选择性琼脂培养基；对细菌含量较少的样品采用血清肉汤增菌和感染豚鼠、小鼠法提高检出率。50实验室检测实验室检测标本采集：患者 皮肤炭疽以无菌手续采取局部病灶渗出物、水疱内容物；肺炭疽采取血液和痰；肠炭疽采取血液、呕吐物及血样便；败血症型炭疽采取血液；脑膜性炭疽采集脑脊液。51病畜死畜、实验动物炭疽感染尸体严禁屠宰解剖，以防芽孢形成，一般割取耳朵、舌尖组织供检；实验动物静脉或心脏采血和肋部切开检查病变,无菌手续取脾一块.病、死猪切开咽喉部采取淋巴结和出血性浸液。外界现场标本根据污染情况采取空气、土壤
23、、水、食品、物件表面等标本实验室检测实验室检测52 实验室检测实验室检测标本处理患者、病畜标本：血液直接检查。脏器经研磨制成1：10至1：20悬液，供检。外界现场标本：炭疽芽孢杆菌沾染的外界现场，天然的基本是芽孢；人为的也是用芽孢作为生物战剂。芽孢气溶胶沾染的外界标本中混有杂菌和杂质，应先将标本经过稀释、洗脱（振荡10-15min，静置5-10min，吸出上清液）、加温处理：60-65，30min，不要超过65，以防止炭疽芽孢被杀死，吸出上清液。53实验室检测实验室检测分离培养 分泌液、血液、脑脊液等可直接分离接种于血琼脂平板、普通琼脂平板和碳酸氢钠平板。血标本应先增菌培养。皮毛等检材杂菌污染
24、严重时可加热60-65，30min以杀死无芽孢杂菌。54实验室检测实验室检测分泌物体液或洗涤掖等临床标本可直接分离接种，每份至少分离接种5%血琼脂平板各一个。接种前血琼脂平板应置37 孵箱内将表面烘干。脏器组织标本应切成几个不同的断面，压印琼脂平板表面，或滴加组织悬液（1：20）稀释）0.05ml，然后用L形玻棒均匀涂布。55 外界现场标本经加温处理后，每份标本分别接种5%血琼脂平板与戊烷脒选择性血琼脂平板各一个。接种量视不同标本的杂菌污染程度而定。如皮毛、土壤等污染程度较严重的标本，每个血琼脂平板接种0.010.02ml，必要时稀释后再接种，戊烷脒琼脂平板因能抑制大部分杂菌，一般接种0.1m
25、l。实验室检测实验室检测56实验室检测实验室检测 接种后，琼脂平板孵育于37。血琼脂平板培养12h，取出观察早期菌落特征和溶血性的观察。最迟不得超过15h，因培养时间过长，炭疽芽孢杆菌菌落过大，会影响菌落特征与溶血性的观察。57 戊烷脒血琼脂平板培养1524h，对多数其他需氧芽孢杆菌有抑制其出芽与繁殖的作用，而炭疽芽孢杆菌能适应出芽繁殖，其生长仍受到轻度抑制，菌落生长较慢、较小，但仍可保持狮子头状和不溶血的特征。但戊烷脒血琼脂平板对某些溶血性蜡样杆菌的抑制仍嫌不足。实验室检测实验室检测58 根据菌落特征和溶血反应，挑选可疑炭疽芽孢杆菌菌落，接种于增菌肉汤中，用37氺浴箱孵育34h，观察肉汤生长
26、情况及时做动力等检查，再将分离得到的纯菌进行鉴定。实验室检测实验室检测59鉴定方法鉴定方法如培养后发现可疑菌落，可根据形态特征、青霉素串珠试验、动物实验等鉴定，操作方法:一、直接涂片镜检（荚膜检查）：渗出液、血液可直接涂片，新鲜器官组织切面制成压印片。自然干燥后，通过火焰固定，在10%福尔马林中浸泡1015min或1：1000升汞中固定5min以杀死芽孢。晾干后革兰氏染色，若见有荚膜的典型竹节状革兰氏阳性大杆菌，可作为初步判定的依据之一，并结合临床症状即可做初步诊断。60二、菌落形状：观察37培养1215h的血琼脂平板上菌落形状，炭疽芽孢杆菌典型菌落呈狮子头状，常有小尾突起，大小23mm，表面
27、粗糙，呈毛玻璃样色调，边缘不整，低倍镜检菌落边缘呈“卷发状”。用接种针挑取时有黏性，呈“拉丝状”，这些特征在其他需氧芽孢杆菌则少见。鉴定方法鉴定方法61三、肉汤串珠试验：炭疽杆菌在含有适当浓度的青霉素培养基中，可发生生态变异，菌体肿大而呈均匀的圆球，呈串珠状。先制备琼脂板，将营养琼脂溶化后倾注平皿，待凝固后用手术刀切取琼脂片，大小为长、宽、厚相当（3cm0.5cm 0.3cm）,置玻片中央，接种待检菌均匀涂满再取灭菌的滤纸条（1.5cm 0.5cm），浸渍新配制的青霉素溶液（10100U/ml），不宜太湿紧贴于接种菌琼脂片之一端，置平皿中于37培养46h。取出载玻片，与低倍镜下观察，在有菌生长
28、和抑菌区的临界线处，应有明显典型串珠形态。鉴定方法鉴定方法62 四、噬菌体裂解试验：取一接种环被检新鲜菌液，均匀涂布于烘干的普通琼脂平板表面，干后，在涂菌区中心滴加诊断噬菌体1滴，干后，置37培养8h，观察有无噬菌斑；必要时，孵育18h再观察一次。最好同时用人用炭疽芽孢杆菌疫苗株作为阳性对照。鉴定方法鉴定方法63五、溶血性：观察37培养1215h血琼脂平板上菌落的溶血性。炭疽芽孢杆菌多不容血，或仅少数菌株微溶血；其他需氧芽孢杆菌大多迅速溶血，而且强烈。鉴定方法鉴定方法64 六、肉汤生长：将可疑菌落纯培养物种于增菌肉汤中，37水浴中培养，4h，观察生长情况，必要时培养1218h再观察一次。炭疽芽
29、孢杆菌在肉汤中生长的特点为絮状沉淀生长、上液澄清，而其他需氧芽孢杆菌则为颗粒状沉淀、均匀混浊，有的形成菌膜。鉴定方法鉴定方法65 七、动力检查：取37水浴培养4h的新鲜肉汤培养物一滴，置于盖玻片上，做悬滴标本，镜检。炭疽芽孢杆菌无动力，而其他需氧芽孢杆菌大多有动力。八、青霉素抑制试验：取一接种环肉汤培养物接种与10U/ml青霉素琼脂平板上，培养18h，观察有无细菌生长。炭疽芽孢杆菌一般不生长，或仅微生长；而大多数蜡样芽孢杆菌等则生长良好。鉴定方法鉴定方法66 九、动物致病力试验：注射18h肉汤培养物0.2ml于家兔皮下。若局部注射处有胶样水肿，24天死亡，肝脾肿大呈暗褐色，则为炭疽杆菌有毒株。
30、动物试验亦可用于污染标本中炭疽杆菌的检出，可将检材用皮肤擦入法接种小鼠或豚鼠，如炭疽杆菌，动物多在23天内死亡，除局部有特殊病变、肝脾肿大外内脏及血液中有大量具有荚膜的炭疽杆菌存在。鉴定方法鉴定方法67 鉴定方法鉴定方法十、分子生物学鉴定：近年来，DNA-DNA杂交、基因探针、脉冲电场凝胶电泳（PFGE）、PCR、ISR（基因间区）测序等分子生物学方法已用于炭疽杆菌的检验和基因鉴定。美Carl、Beyer、Makino等分别建立针对质粒pXO1 的EF、PA基因和质粒pXO2 的cap基因的PCR和巢式PCR法，检测炭疽感染动物的血、皮或鞣革厂污染环境标本，结果表明样品中仅含1个炭疽芽孢或10
31、0g泥土中10个靶拷贝即可被检出；此方法特异性强、时间短（416h）。68鉴定方法鉴定方法 Henderson（1994年）用18种限制性内切酶切割细菌，再以任意引物和序列特异引物PCR分析40株炭疽杆菌、7株蜡样杆菌。炭疽杆菌PCR图形独特且一致，而其他种存在株间差异，结果提示炭疽杆菌属于几乎完全同源性的单一克隆谱系。Harrell（1995年）用PFGE和16S、23SDNA测序发现来自不同地区的炭疽杆菌的DNA序列一致，与蜡样杆菌有差别，可作鉴别诊断。他认为作为种，炭疽杆菌具有很高的同质性。69 鉴定方法鉴定方法十一、碳酸氢钠琼脂平板CO2培养试验：取大量细菌菌苔种于活性碳酸氢钠琼脂平板上，在25%CO2环境中，37培养1622h，观察菌落形状。若生长粘液性菌落，为形成荚膜的炭疽芽孢杆菌强毒菌株；若生长粘液一粗糙型菌落，为不形成荚膜的炭疽芽孢杆菌弱毒菌株；生长粗糙型菌落，为不形成荚膜的炭疽芽孢杆菌无毒菌株。进一步挑取粘液型菌落荚膜染色，镜检可找见荚膜，帮助鉴别。70炭疽杆菌实验室记录炭疽杆菌实验室记录菌株编号原标本编号来源分 离日 期菌 落形 态革兰氏染色动力肉汤生长溶血试验噬菌体裂解串珠试验青霉素抑菌CO2培 养荚膜检查炭疽细菌学记录（地区）市712007-11-2772
