1、第八讲第八讲 猪链球菌病诊断猪链球菌病诊断猪链球菌病：猪链球菌病：是由致病性猪源链球菌感染引起的猪疫病的是由致病性猪源链球菌感染引起的猪疫病的总称。猪链球菌病的临床表现主要是败血症、总称。猪链球菌病的临床表现主要是败血症、化脓性淋巴结炎、脑膜炎以及关节炎。化脓性淋巴结炎、脑膜炎以及关节炎。OIE列为列为B类传染病类传染病病原：病原：1 猪链球菌猪链球菌2型（型（Streptococcus suis 2）2 2 马链球菌兽疫亚种（马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi subsp zooepidemicus)，旧称兽疫链球菌旧称兽疫链球菌3 3 D D、E E、L L、S S群链
2、球菌群链球菌(Lancefield)(Lancefield)兰氏血清学分群，链球菌分为兰氏血清学分群，链球菌分为2020个血清群（个血清群（A A、B B、C.V,IC.V,I、J J除外）除外）一、病原分离一、病原分离1 采样采样活猪：采样用灭菌棉拭子擦拭扁桃体活猪：采样用灭菌棉拭子擦拭扁桃体病死猪：扁桃体、肺、肝、血液，有脑炎症病死猪：扁桃体、肺、肝、血液，有脑炎症状取脑组织，关节炎可取关节囊液状取脑组织，关节炎可取关节囊液2 分离培养分离培养（1）培养基：）培养基：THB培养基、绵羊血或马血平板培养基、绵羊血或马血平板（2）培养条件：需氧兼性厌氧、）培养条件：需氧兼性厌氧、37、pH7.
3、2 猪链球菌猪链球菌2性营养要求比马链球菌兽疫亚种低，性营养要求比马链球菌兽疫亚种低，后者需加后者需加3-5%的犊牛血清的犊牛血清二、临床诊断二、临床诊断 主要表现为主要表现为败血症、化脓性淋巴结炎、败血症、化脓性淋巴结炎、脑膜炎、心内膜炎、关节炎等。脑膜炎、心内膜炎、关节炎等。但不同链球但不同链球菌病原引起的症状类似，故该诊断不能用于菌病原引起的症状类似，故该诊断不能用于确诊。确诊。关节炎症状关节炎症状败血症败血症1 染色镜检染色镜检猪链球菌猪链球菌2型：型：革兰氏染色阳性、革兰氏染色阳性、菌体呈圆形或椭圆形，菌体呈圆形或椭圆形，直径小于直径小于2.0m，一般呈短链或成双排列，革，一般呈短链
4、或成双排列，革兰氏染色阳性，兰氏染色阳性，菌体表面能形成荚膜。菌体表面能形成荚膜。二、微生物学诊断二、微生物学诊断马链球菌兽疫亚种：马链球菌兽疫亚种：革兰氏阳性球菌，直径革兰氏阳性球菌，直径0.51um，液体，液体培养基中呈长链，菌体表面能形成荚膜。培养基中呈长链，菌体表面能形成荚膜。营养要求较高，在营养要求较高，在5%犊牛血清生长良好。犊牛血清生长良好。根据类根据类M蛋白抗原性的差异，该菌至少有蛋白抗原性的差异，该菌至少有15个血清型。个血清型。马链球菌兽疫亚种 猪链球菌2型菌（溶血）图 2 猪 链 球 菌 2 型 (ZY05719)ATCC 35246株株2 培养特性培养特性猪链球菌猪链球
5、菌2型：型：菌落形态菌落形态 血平板上呈灰白色小菌落，血平板上呈灰白色小菌落，粘稠，粘稠，2型在绵型在绵 羊血平板上呈羊血平板上呈溶血，马血溶血，马血平板则呈平板则呈溶血。溶血。马链球菌兽疫亚种：马链球菌兽疫亚种：在血清肉汤培养基中培养该菌，开始时有轻在血清肉汤培养基中培养该菌，开始时有轻度混浊，继而变清，于管底形成沉淀。度混浊，继而变清，于管底形成沉淀。于于5绵羊血琼脂（绵羊血琼脂（THA）培养基上培养）培养基上培养24 h，大部分菌株形成，大部分菌株形成34mm的粘液样大菌落，的粘液样大菌落，产生明显的产生明显的溶血。小部分呈非粘液样菌落，大溶血。小部分呈非粘液样菌落，大小约小约1mm左右
6、。左右。3 生化鉴定生化鉴定猪链球菌猪链球菌2型：型：发酵乳糖、海藻糖、水扬苷，部分菌株发酵发酵乳糖、海藻糖、水扬苷，部分菌株发酵 棉实糖、菊糖；不发酵甘露醇、山梨醇棉实糖、菊糖；不发酵甘露醇、山梨醇马链球菌兽疫亚种：马链球菌兽疫亚种：能水解精氨酸，发酵乳糖、水扬苷、山梨能水解精氨酸，发酵乳糖、水扬苷、山梨醇产酸。不能发酵菊糖、甘露醇、棉子糖和海醇产酸。不能发酵菊糖、甘露醇、棉子糖和海藻糖。藻糖。V-P试验阴性，不产生靛基质，不还原试验阴性，不产生靛基质，不还原硝酸盐，不液化明胶。硝酸盐，不液化明胶。三、免疫学诊断三、免疫学诊断1 玻板凝集实验玻板凝集实验 用于猪链球菌用于猪链球菌2型快速定型
7、，但要求抗体效型快速定型，但要求抗体效价高；马链球菌兽疫亚种只能用于定群价高；马链球菌兽疫亚种只能用于定群 2 乳胶凝集实验乳胶凝集实验 敏感性较高，结果容易判断，但有非特异性敏感性较高，结果容易判断，但有非特异性3 免疫荧光免疫荧光猪链球菌猪链球菌2型：型：用用MRP特异抗体可用于菌体表面其分布的观特异抗体可用于菌体表面其分布的观察，但需用激光共聚焦显微镜。察，但需用激光共聚焦显微镜。马链球菌兽疫亚种：用类马链球菌兽疫亚种：用类M蛋白特异抗体可用于蛋白特异抗体可用于菌体表面其分布的观察菌体表面其分布的观察MRP单抗介导单抗介导FITC标记标记SS2表面表面MRP的的激光共聚焦图像激光共聚焦图
8、像 MRP单抗介导单抗介导FITC标记标记SS2表面表面MRP的激光共聚焦图像的激光共聚焦图像 SS2多抗介导多抗介导FITC标记的标记的SS2的激光共聚焦图像的激光共聚焦图像 4 4 ELISAELISA 常用链球菌多克隆抗体包被，以常用链球菌多克隆抗体包被，以MRPMRP或类或类M M蛋白的单克隆抗体夹心，敏感性高，蛋白的单克隆抗体夹心，敏感性高，特异性较强。特异性较强。四、分子诊断四、分子诊断1多酶电泳法：多酶电泳法：原理：不同型猪链球菌，胞内酶分子的氨基原理：不同型猪链球菌，胞内酶分子的氨基酸有差异，因而电荷有差异，在电场中，其酸有差异，因而电荷有差异，在电场中，其迁移率有差异。迁移率
9、有差异。用于不同型链球菌的分析用于不同型链球菌的分析2 限制性酶切图谱分析限制性酶切图谱分析 原理：不同种或亚种链球菌基因不同，因而原理：不同种或亚种链球菌基因不同，因而用限制性内切酶酶切后，其电泳图谱不同。用限制性内切酶酶切后，其电泳图谱不同。用于分离株变异分析，亦可用于不同种用于分离株变异分析，亦可用于不同种或型的鉴定或型的鉴定3 3 随机扩增多态随机扩增多态DNA分析（分析（RAPD）用多对随机引物进行用多对随机引物进行PCR扩增，可得到不扩增，可得到不同的产物，且产物具有多态性。同的产物，且产物具有多态性。可用于种或型的鉴定或分离株变异分析可用于种或型的鉴定或分离株变异分析4 PCR猪
10、链球菌猪链球菌2型：型：mrp、ef、cps2、orf2以及溶血素基因均以及溶血素基因均可作为靶基因进行检测可作为靶基因进行检测 cps2具有型特异性具有型特异性bp970744622557 mrp,ef,sly,CPS 2 1 2 3 4 51:HA9801;2:ZY05719;3:Marker;4,5:阴性对阴性对照照250bp 500bp750bpM 1 22000bp1000bpMaker 1.HA 9801(cps2)2.ZY05719(cps2)cps2250bp 500bp750bp2000bpM 1 2 3 4ef，mrp，gdh，orf2Maker1.ef(626 bp)2.
11、mrp(316 bp)3.gdh(688 bp)4.orf2(858 bp).250bp 500bp750bp1000bp2000bp250bp 500bp750bp1000bp2000bp1099bp1310bpM 1M 1 slyfbpsMaker 1.slyMaker1.fbps1040bp100bp250bp 500bp750bp1000bp2 0 00bpM 1 2 3M:DL-Marker 2000 1:ZY05719(gapdh)2:HA9801(gapdh)3:空白对照空白对照gapdh图8 orf 2 PCR检测结果1 marker;24,713 PCR products o
12、f swine Streptococcus,2 HA9801;56 negative control图11 PCR检测猪链球菌2型cps21.H2O;2.SH0033;3.35246;4.ZY05722;5.ZG05464;6.GH05458;7.HA9802;.8.ZY05719;9.HA9801;10.YJ05465;11.JDZ05802-1;12.JR05730;13.ZY05721;14.11611;15.CHZ05806;16.260;M.Marker DL2000.bp387M16151413121110987 654321 10025020007501 2 3 4 5 6200010007505002501001 DL2000 market 2、3 PCR product of ATCC 352464 PCR product of streptococcus suis type 2 HA98015 PCR product of Staphylococcus aureus6 PCR product of Avain Escherichia coli O1ATCC35246株类株类M基因基因PCR结果结果
