1、实验三小鼠骨髓染色体制备与观察一、实验目的 初步掌握（小鼠）骨髓细胞染色体标本的制备原理和方法 巩固显微镜的操作技术 了解小鼠的染色体形态特征二、实验原理l 染色体是组成细胞核的基本物质，是基因的载体。染色体异常也称染色体发育不全。目前已确认染色体病综合征100余种，智力低下和生长发育迟滞是染色体病的共同特征。l 21三体综合征；18三体综合征、猫叫综合征18三体综合征二、实验原理l 染色体标本的观察广泛应用于一些疾病的临床诊断中。例如白血病、恶性血液病等的诊断。l 染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。l 细胞分裂的中期，染色体在赤道板上排列清晰，是染色体观察的最佳时期。u 骨髓细胞 数量多
2、且分裂旺盛，可直接进行染色体标本的制备。取材方便，操作简单和无需无菌培养，是研究小型哺乳动物等染色体的常用方法。人骨髓染色体抽取 怎样才能制备一个好的染色体标本？u 获得大量处于有丝分裂中期的细胞。u 使细胞膜破裂，且染色体能够完整并较分散的释放出来。低渗作用:使细胞充分膨胀，减少染色体间的相互缠绕和重叠。细胞悬液不能太稀，要呈乳白色；染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。弃上清，加固定液 0.形态特征观察：端着丝粒染色体“U”“V”。075 mol/L KCl 低渗液、Giemsa染液获得大量处于有丝分裂中期的细胞。3低渗处理是实验成败的关键，注意低渗时间；固定液（甲醇：冰乙酸=3:1）需现
3、配；染色：在玻片上滴几滴Giemsa染液并铺匀，810min，倒去染液，晾干。075 mol/L KCl 收集足量细胞，反复冲洗直到股骨发白。低渗：用吸管吹打骨髓细胞使其分散，加入预温37的低渗液至8ml,将离心管至37水浴锅中，保温至少30 min后取出，使细胞充分吸水膨胀。染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。4固定液要现配现用，固定要充分；18三体综合征、猫叫综合征雄性 XY,雌性XX,Y染色体最小。细胞分裂的中期，染色体在赤道板上排列清晰，是染色体观察的最佳时期。小鼠骨髓要冲洗干净，以收集足够的骨髓细胞；低渗过度，则细胞提前破裂，染色体观察不全。固定、制细胞悬液：加固定液5ml 吹打混
4、匀u秋水仙素处理：秋水仙素溶液可抑制纺锤体的形成，使正在分裂的骨髓细胞停止在细胞分裂中期，积累大量中期分裂相细胞。u低渗作用:使细胞充分膨胀，减少染色体间的相互缠绕和重叠。u预固定：终止低渗作用，使细胞离心时不易破裂，固定维持细胞形态结构。u高距离滴片：使细胞膜易于破裂，获得中期染色体标本，在显微镜下观察染色体的结构和数量。三、实验器材和试剂 1.器材 蜡盘、手术剪、小镊子、平皿、注射器、10ml离心管、吸管、量筒、预冷载玻片、试管架、离心机、恒温水浴锅、显微镜、乙醚酒精、擦镜纸 2、试剂 100ug秋水仙素液、0.075 mol/L KCl 低渗液、Giemsa染液1.秋水仙素处理：选择体重
5、20g左右的小白鼠，按24ug/g(小鼠)秋水仙素，与处死前4h，对其进行腹腔注射100ug/mL秋水仙素液。四、实验步骤 注意：剪去少量骨质，避免骨髓细胞丢失；擦净血迹和肌肉细胞以免影响观察；用0.075 mol/L KCl 收集足量细胞，反复冲洗直到股骨发白。2.取材：颈椎脱臼法处死 取两后肢股骨 纱布擦净肌肉 剪去股骨两头，暴露骨髓腔 低渗液(5ml)冲洗至离心管内 收集骨髓细胞颈椎脱臼法处死小鼠3.低渗：用吸管吹打骨髓细胞使其分散，加入预温37的低渗液至8ml,将离心管至37水浴锅中，保温至少30 min后取出，使细胞充分吸水膨胀。低渗不足，则细胞膨胀不够，滴片时细胞不破裂。低渗过度，
6、则细胞提前破裂，染色体观察不全。空气吹打法：用吸管橡胶头内的空气混匀液体。4.预固定：加1ml新配制固定液 混匀 1500r/min，5min 弃上清液。固定液（甲醇：冰乙酸=3:1）需现配；离心需要配平。作用：终止低渗；维持细胞的膨胀状态；防止离心破裂5.固定、制细胞悬液：加固定液5ml 吹打混匀 固定15min 离心1500r/min，5min 弃上清，加固定液 0.20.4ml 吹打成细胞悬液，准备制片使用。制备细胞悬液时，根据具体情况加固定液，以悬液呈现乳白色为宜。6.滴片：冰片倾斜30,细胞悬液距离玻片30cm高，在不重叠位置滴12滴，用口吹散细胞，过火焰干燥。注意：载玻片预冷、高度
7、、吹散、不可使载玻片烫手。7.染色：在玻片上滴几滴Giemsa染液并铺匀，810min，倒去染液，晾干。（染色盘中进行）8.小鼠染色体观察：低倍镜、高倍镜下寻找染色体分散的中期分裂相.小鼠骨髓染色体小鼠骨髓染色体 10 10小鼠骨髓染色体小鼠骨髓染色体 10 40小鼠骨髓染色体 10 40固定液（甲醇：冰乙酸=3:1）需现配；吹打成细胞悬液，准备制片使用。固定液（甲醇：冰乙酸=3:1）需现配；擦净血迹和肌肉细胞以免影响观察；固定15min 离心1500r/min，5min雄性 XY,雌性XX,Y染色体最小。染色：在玻片上滴几滴Giemsa染液并铺匀，810min，倒去染液，晾干。固定液（甲醇：
8、冰乙酸=3:1）需现配；获得大量处于有丝分裂中期的细胞。染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。5载玻片要洁净并预冷，滴片要有一定的高度；小鼠骨髓染色体 10 10擦净血迹和肌肉细胞以免影响观察；低渗作用:使细胞充分膨胀，减少染色体间的相互缠绕和重叠。高距离滴片：使细胞膜易于破裂，获得中期染色体标本，在显微镜下观察染色体的结构和数量。低渗作用:使细胞充分膨胀，减少染色体间的相互缠绕和重叠。小鼠骨髓染色体 10 40小鼠染色体观察：低倍镜、高倍镜下寻找染色体分散的中期分裂相.秋水仙素处理：选择体重20g左右的小白鼠，按24ug/g(小鼠)秋水仙素，与处死前4h，对其进行腹腔注射100ug/mL秋水
9、仙素液。075 mol/L KCl 收集足量细胞，反复冲洗直到股骨发白。实验三小鼠骨髓染色体制备与观察075 mol/L KCl 收集足量细胞，反复冲洗直到股骨发白。低渗：用吸管吹打骨髓细胞使其分散，加入预温37的低渗液至8ml,将离心管至37水浴锅中，保温至少30 min后取出，使细胞充分吸水膨胀。烤片时温度不能太高。低渗作用:使细胞充分膨胀，减少染色体间的相互缠绕和重叠。染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。雄性 XY,雌性XX,Y染色体最小。取材方便，操作简单和无需无菌培养，是研究小型哺乳动物等染色体的常用方法。秋水仙素处理：秋水仙素溶液可抑制纺锤体的形成，使正在分裂的骨髓细胞停止在细胞
10、分裂中期，积累大量中期分裂相细胞。1500r/min，5min 弃上清液。小鼠骨髓染色体 10 10细胞分裂的中期，染色体在赤道板上排列清晰，是染色体观察的最佳时期。低渗过度，则细胞提前破裂，染色体观察不全。雄性 XY,雌性XX,Y染色体最小。075 mol/L KCl 低渗液、Giemsa染液烤片时温度不能太高。注意：剪去少量骨质，避免骨髓细胞丢失；固定15min 离心1500r/min，5min低渗作用:使细胞充分膨胀，减少染色体间的相互缠绕和重叠。雄性 XY,雌性XX,Y染色体最小。取材方便，操作简单和无需无菌培养，是研究小型哺乳动物等染色体的常用方法。数目观察：小鼠2倍体细胞染色体，数
11、目2n=40条。其中19对为常染色体，一对为性染色体，染色体的核型分为4组。雄性 XY,雌性XX,Y染色体最小。形态特征观察：端着丝粒染色体“U”“V”。形态特征观察：端着丝粒染色体“U”“V”。注意：剪去少量骨质，避免骨髓细胞丢失；染色体是组成细胞核的基本物质，是基因的载体。器材 蜡盘、手术剪、小镊子、平皿、注射器、10ml离心管、吸管、量筒、预冷载玻片、试管架、离心机、恒温水浴锅、显微镜、乙醚酒精、擦镜纸弃上清，加固定液 0.器材 蜡盘、手术剪、小镊子、平皿、注射器、10ml离心管、吸管、量筒、预冷载玻片、试管架、离心机、恒温水浴锅、显微镜、乙醚酒精、擦镜纸1掌握好秋水仙素的浓度和处理时间
12、；雄性 XY,雌性XX,Y染色体最小。低渗：用吸管吹打骨髓细胞使其分散，加入预温37的低渗液至8ml,将离心管至37水浴锅中，保温至少30 min后取出，使细胞充分吸水膨胀。染色体是组成细胞核的基本物质，是基因的载体。预固定：加1ml新配制固定液 混匀4固定液要现配现用，固定要充分；染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。擦净血迹和肌肉细胞以免影响观察；擦净血迹和肌肉细胞以免影响观察；1掌握好秋水仙素的浓度和处理时间；秋水仙素处理：选择体重20g左右的小白鼠，按24ug/g(小鼠)秋水仙素，与处死前4h，对其进行腹腔注射100ug/mL秋水仙素液。小鼠骨髓染色体 10 40雄性 XY,雌性XX,
13、Y染色体最小。4ml低渗液(5ml)冲洗至离心管内 收集骨髓细胞形态特征观察：端着丝粒染色体“U”“V”。小鼠骨髓染色体 10 40低渗液(5ml)冲洗至离心管内 收集骨髓细胞初步掌握（小鼠）骨髓细胞染色体标本的制备原理和方法获得大量处于有丝分裂中期的细胞。染色体标本的观察广泛应用于一些疾病的临床诊断中。形态特征观察：端着丝粒染色体“U”“V”。初步掌握（小鼠）骨髓细胞染色体标本的制备原理和方法染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。空气吹打法：用吸管橡胶头内的空气混匀液体。染色：在玻片上滴几滴Giemsa染液并铺匀，810min，倒去染液，晾干。5载玻片要洁净并预冷，滴片要有一定的高度；固定液
14、（甲醇：冰乙酸=3:1）需现配；075 mol/L KCl 收集足量细胞，反复冲洗直到股骨发白。空气吹打法：用吸管橡胶头内的空气混匀液体。2、试剂 100ug秋水仙素液、0.低渗液(5ml)冲洗至离心管内 收集骨髓细胞2、试剂 100ug秋水仙素液、0.低渗作用:使细胞充分膨胀，减少染色体间的相互缠绕和重叠。细胞悬液不能太稀，要呈乳白色；小鼠骨髓染色体 10 40小鼠骨髓染色体 10 40预固定：终止低渗作用，使细胞离心时不易破裂，固定维持细胞形态结构。取材方便，操作简单和无需无菌培养，是研究小型哺乳动物等染色体的常用方法。小鼠染色体观察：低倍镜、高倍镜下寻找染色体分散的中期分裂相.075 m
15、ol/L KCl 低渗液、Giemsa染液吹打成细胞悬液，准备制片使用。其中19对为常染色体，一对为性染色体，染色体的核型分为4组。4ml染色体是组成细胞核的基本物质，是基因的载体。秋水仙素处理：选择体重20g左右的小白鼠，按24ug/g(小鼠)秋水仙素，与处死前4h，对其进行腹腔注射100ug/mL秋水仙素液。4固定液要现配现用，固定要充分；低渗作用:使细胞充分膨胀，减少染色体间的相互缠绕和重叠。低渗过度，则细胞提前破裂，染色体观察不全。低渗作用:使细胞充分膨胀，减少染色体间的相互缠绕和重叠。细胞分裂的中期，染色体在赤道板上排列清晰，是染色体观察的最佳时期。1掌握好秋水仙素的浓度和处理时间；
16、染色体是组成细胞核的基本物质，是基因的载体。小鼠骨髓染色体 10 10075 mol/L KCl 低渗液、Giemsa染液获得大量处于有丝分裂中期的细胞。器材 蜡盘、手术剪、小镊子、平皿、注射器、10ml离心管、吸管、量筒、预冷载玻片、试管架、离心机、恒温水浴锅、显微镜、乙醚酒精、擦镜纸075 mol/L KCl 收集足量细胞，反复冲洗直到股骨发白。烤片时温度不能太高。秋水仙素处理：选择体重20g左右的小白鼠，按24ug/g(小鼠)秋水仙素，与处死前4h，对其进行腹腔注射100ug/mL秋水仙素液。器材 蜡盘、手术剪、小镊子、平皿、注射器、10ml离心管、吸管、量筒、预冷载玻片、试管架、离心机
17、、恒温水浴锅、显微镜、乙醚酒精、擦镜纸注意：剪去少量骨质，避免骨髓细胞丢失；小鼠骨髓染色体 10 40细胞分裂的中期，染色体在赤道板上排列清晰，是染色体观察的最佳时期。注意：剪去少量骨质，避免骨髓细胞丢失；预固定：终止低渗作用，使细胞离心时不易破裂，固定维持细胞形态结构。滴片：冰片倾斜30,细胞悬液距离玻片30cm高，在不重叠位置滴12滴，用口吹散细胞，过火焰干燥。高距离滴片：使细胞膜易于破裂，获得中期染色体标本，在显微镜下观察染色体的结构和数量。数目观察：小鼠2倍体细胞染色体，数目2n=40条。细胞分裂的中期，染色体在赤道板上排列清晰，是染色体观察的最佳时期。低渗过度，则细胞提前破裂，染色体
18、观察不全。雄性 XY,雌性XX,Y染色体最小。空气吹打法：用吸管橡胶头内的空气混匀液体。擦净血迹和肌肉细胞以免影响观察；高距离滴片：使细胞膜易于破裂，获得中期染色体标本，在显微镜下观察染色体的结构和数量。4ml取材方便，操作简单和无需无菌培养，是研究小型哺乳动物等染色体的常用方法。075 mol/L KCl 收集足量细胞，反复冲洗直到股骨发白。吹打成细胞悬液，准备制片使用。小鼠骨髓染色体 10 40染色：在玻片上滴几滴Giemsa染液并铺匀，810min，倒去染液，晾干。075 mol/L KCl 收集足量细胞，反复冲洗直到股骨发白。弃上清，加固定液 0.形态特征观察：端着丝粒染色体“U”“V
19、”。1500r/min，5min 弃上清液。取材方便，操作简单和无需无菌培养，是研究小型哺乳动物等染色体的常用方法。低渗液(5ml)冲洗至离心管内 收集骨髓细胞075 mol/L KCl 收集足量细胞，反复冲洗直到股骨发白。预固定：加1ml新配制固定液 混匀固定液（甲醇：冰乙酸=3:1）需现配；器材 蜡盘、手术剪、小镊子、平皿、注射器、10ml离心管、吸管、量筒、预冷载玻片、试管架、离心机、恒温水浴锅、显微镜、乙醚酒精、擦镜纸染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。实验三小鼠骨髓染色体制备与观察高距离滴片：使细胞膜易于破裂，获得中期染色体标本，在显微镜下观察染色体的结构和数量。取材方便，操作简单
20、和无需无菌培养，是研究小型哺乳动物等染色体的常用方法。吹打成细胞悬液，准备制片使用。低渗过度，则细胞提前破裂，染色体观察不全。秋水仙素处理：秋水仙素溶液可抑制纺锤体的形成，使正在分裂的骨髓细胞停止在细胞分裂中期，积累大量中期分裂相细胞。空气吹打法：用吸管橡胶头内的空气混匀液体。细胞分裂的中期，染色体在赤道板上排列清晰，是染色体观察的最佳时期。染色体是组成细胞核的基本物质，是基因的载体。075 mol/L KCl 收集足量细胞，反复冲洗直到股骨发白。染色体是组成细胞核的基本物质，是基因的载体。低渗过度，则细胞提前破裂，染色体观察不全。染色：在玻片上滴几滴Giemsa染液并铺匀，810min，倒去
21、染液，晾干。小鼠骨髓染色体 10 40小鼠骨髓染色体 10 10低渗作用:使细胞充分膨胀，减少染色体间的相互缠绕和重叠。器材 蜡盘、手术剪、小镊子、平皿、注射器、10ml离心管、吸管、量筒、预冷载玻片、试管架、离心机、恒温水浴锅、显微镜、乙醚酒精、擦镜纸吹打成细胞悬液，准备制片使用。秋水仙素处理：选择体重20g左右的小白鼠，按24ug/g(小鼠)秋水仙素，与处死前4h，对其进行腹腔注射100ug/mL秋水仙素液。骨髓细胞 数量多且分裂旺盛，可直接进行染色体标本的制备。形态特征观察：端着丝粒染色体“U”“V”。细胞分裂的中期，染色体在赤道板上排列清晰，是染色体观察的最佳时期。小鼠骨髓染色体 10
22、 40形态特征观察：端着丝粒染色体“U”“V”。注意：载玻片预冷、高度、吹散、不可使载玻片烫手。雄性 XY,雌性XX,Y染色体最小。预固定：加1ml新配制固定液 混匀雄性 XY,雌性XX,Y染色体最小。弃上清，加固定液 0.秋水仙素处理：秋水仙素溶液可抑制纺锤体的形成，使正在分裂的骨髓细胞停止在细胞分裂中期，积累大量中期分裂相细胞。小鼠骨髓染色体 10 40染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。染色体是组成细胞核的基本物质，是基因的载体。小鼠骨髓染色体 10 10雄性 XY,雌性XX,Y染色体最小。空气吹打法：用吸管橡胶头内的空气混匀液体。低渗液(5ml)冲洗至离心管内 收集骨髓细胞5载玻片要
23、洁净并预冷，滴片要有一定的高度；小鼠骨髓染色体 10 404固定液要现配现用，固定要充分；雄性 XY,雌性XX,Y染色体最小。1500r/min，5min 弃上清液。吹打成细胞悬液，准备制片使用。染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。小鼠骨髓染色体 10 40雄性 XY,雌性XX,Y染色体最小。低渗作用:使细胞充分膨胀，减少染色体间的相互缠绕和重叠。细胞分裂的中期，染色体在赤道板上排列清晰，是染色体观察的最佳时期。弃上清，加固定液 0.3低渗处理是实验成败的关键，注意低渗时间；吹打成细胞悬液，准备制片使用。小鼠骨髓染色体 10 10怎样才能制备一个好的染色体标本？雄性 XY,雌性XX,Y染色体
24、最小。弃上清，加固定液 0.小鼠骨髓染色体 10 40小鼠骨髓染色体 10 40075 mol/L KCl 低渗液、Giemsa染液雄性 XY,雌性XX,Y染色体最小。5载玻片要洁净并预冷，滴片要有一定的高度；1500r/min，5min 弃上清液。低渗作用:使细胞充分膨胀，减少染色体间的相互缠绕和重叠。烤片时温度不能太高。4ml075 mol/L KCl 收集足量细胞，反复冲洗直到股骨发白。小鼠染色体观察：低倍镜、高倍镜下寻找染色体分散的中期分裂相.小鼠染色体观察：低倍镜、高倍镜下寻找染色体分散的中期分裂相.注意：载玻片预冷、高度、吹散、不可使载玻片烫手。五、注意事项1掌握好秋水仙素的浓度和处理时间；2离心前需要配平；3.小鼠骨髓要冲洗干净，以收集足够的骨髓细胞；3低渗处理是实验成败的关键，注意低渗时间；4固定液要现配现用，固定要充分；5载玻片要洁净并预冷，滴片要有一定的高度；6.细胞悬液不能太稀，要呈乳白色；7.烤片时温度不能太高。8.冲洗染液时水流要缓慢，以免细胞流失过多。
