1、感染性疾病实验室诊断（优选）感染性疾病实验室诊断 第一节第一节 概概 述述n感染性疾病：感染性疾病：病原体病原体 宿主宿主 疾病疾病n病原体病原体（细菌、真菌、病毒、寄生虫（细菌、真菌、病毒、寄生虫 ）一、当今感染病的特点一、当今感染病的特点1 感染性病原体的种类不断发生变迁感染性病原体的种类不断发生变迁2 2 宿主的免疫防御能力下降宿主的免疫防御能力下降3 3 内源性感染与条件致病菌的感染增加内源性感染与条件致病菌的感染增加二、二、感染类型感染类型（一）按病原体分类（一）按病原体分类 1.传统病原体感染传统病原体感染 细菌：细菌：病毒：病毒：真菌：真菌：寄生虫寄生虫 2.2.新发病原体：新发
2、病原体：SARSSARS冠状病毒冠状病毒 新甲型新甲型H1N1流感病毒流感病毒 高致病性禽流感病毒高致病性禽流感病毒(二）按疾病特征分类二）按疾病特征分类1.1.病原体被清除病原体被清除2.2.隐性感染隐性感染(covert infection)(covert infection)，亦称亚临床感染，亦称亚临床感染 一般占人群的一般占人群的9090或以上或以上 3.3.显性感染显性感染(overt infection)(overt infection)又称为临床感染又称为临床感染 发病快慢和病程长短：急性感染和慢性感染发病快慢和病程长短：急性感染和慢性感染 感染部位及性质：局部感染和全身感染感染
3、部位及性质：局部感染和全身感染 全身感染：全身感染：菌血症菌血症 败血症败血症 毒血症毒血症 脓毒血症脓毒血症(三）按病原体来源三）按病原体来源外源性感染外源性感染内源性感染内源性感染三、感染性疾病的实验诊断三、感染性疾病的实验诊断（一）一般实验检测（一）一般实验检测 WBCWBC常规检查常规检查 C-C-反应蛋白（反应蛋白（CRPCRP）血清降钙素原（血清降钙素原（PCTPCT）器官功能改变的检测器官功能改变的检测（二）病原学实验诊断（二）病原学实验诊断 临床病原体检查目的临床病原体检查目的 明确感染病原体明确感染病原体 指导治疗，预防，判断预后指导治疗，预防，判断预后第二节第二节 感染性疾
4、病的常用病原学检测感染性疾病的常用病原学检测病原学检测基本程序病原学检测基本程序 正确、规范采集和运送标本正确、规范采集和运送标本 显微镜对标本或组织中的病原体的形态学检查显微镜对标本或组织中的病原体的形态学检查 病原体的分离培养和鉴定病原体的分离培养和鉴定 用免疫学技术对病原体抗原或相应抗体的检测用免疫学技术对病原体抗原或相应抗体的检测 用分子生物学方法对病原体特异性基因的检测用分子生物学方法对病原体特异性基因的检测一、临床标本的采集与处理 （一）标本采集的一般原则一）标本采集的一般原则 1.1.早期早期 病程早期、急性期或症状典型时病程早期、急性期或症状典型时 使用抗生素前使用抗生素前 2
5、.2.无菌采集无菌采集 应无污染，严格进行无菌操作应无污染，严格进行无菌操作 采集的标本均应盛于无菌容器内采集的标本均应盛于无菌容器内 3.3.根据目的菌的特性用不同的方法采集根据目的菌的特性用不同的方法采集 4.4.适量标本适量标本,不同病程采集不同部位标本不同病程采集不同部位标本 5.5.安全采集安全采集做好标记做好标记（二）标本的处理 原则：保持病原体活力，保持标本不被污染，也不污染环境原则：保持病原体活力，保持标本不被污染，也不污染环境1.1.尽快送检尽快送检 对环境敏感的细菌应保温立即送检对环境敏感的细菌应保温立即送检,其他所有采集后最好在其他所有采集后最好在2 2小时内送检小时内送
6、检,不能及时送检不能及时送检,应注意保存应注意保存2.2.必须注意安全防护必须注意安全防护,切勿污染环境切勿污染环境3.3.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽取标本的注射器运送用抽取标本的注射器运送 二、二、检验方法检验方法n查病原体：形态与结构检查查病原体：形态与结构检查 分离培养和鉴定分离培养和鉴定n检测病原体成分（抗原和核酸）检测病原体成分（抗原和核酸）n检测患者血清中特异性抗体检测患者血清中特异性抗体n代谢产物代谢产物（生化试验）（生化试验）n毒素：外毒素、内毒素毒素：外毒素、内毒素2）红细胞吸附（hemadso
7、rption）Gram stain（二）呼吸系统感染的病原学检查呼吸道合胞病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒（一）引起呼吸系统感染常见微生物与常见疾病First reportProcedure for bacterial detection in Clean-catch midstreamurine类型：鼻咽拭子、痰和经气管采集的标本microscopic examination现症感染分离培养是微生物学诊断的金标准，是最可靠的传统诊断技术代谢产物（生化试验）细菌外毒素对机体的毒性作用，可被相应抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，然后再注射外毒素，则动物不产生中毒症状。识别病毒在培养细胞中增殖正确、规范
8、采集和运送标本同化碳源试验 含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基(45)混合，然后在培养基上分别加糖，置25孵育观察结果。microscopic examinationDirect microscopicSARS冠状病毒antibiotic susceptibility test肿大、数个细胞融合成多核巨细胞等。血清降钙素原（PCT）（一）直接显微镜检查（一）直接显微镜检查（形态与结构检查）（形态与结构检查）1.染色标本检查法染色标本检查法n染色标本：了解病原体的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体染色标本：了解病原体的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体n临床意义：临床意义：1.1.镜检可以
9、了解有无病原体及大致的量镜检可以了解有无病原体及大致的量 2.2.根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原体的初步识别和分类根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原体的初步识别和分类 3.3.通过形态学检查可得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有通过形态学检查可得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有 一定的参考意义一定的参考意义 如如CSFCSF找到抗酸杆菌，应初步考虑结核分枝杆菌感染找到抗酸杆菌，应初步考虑结核分枝杆菌感染 革兰阳性革兰阳性 革兰阴性革兰阴性 抗酸染色 培养在McCoy细胞的沙眼衣原体 吉姆萨染色的McCoy细胞，含大衣原体包涵体，使部分细胞核不清楚。（吉姆萨染色,放大100
10、0倍）狂犬病毒可于细胞浆中可形成嗜酸性包涵体 antibiotic susceptibility test脑膜炎、脑炎、脑脓肿镜检可以了解有无病原体及大致的量1）细胞病变:细胞病变效应（CPE）、包涵体核酸分子杂交(nucleic acid molecula hybridization)stain of smear andcolony count通过已知序列的探针与病原体的核苷酸杂交，用以了解病原体的有无。血凝抑制实验Culture(Sabouraud agarProcedure for bacterial and fungal detection in sputum,bronchal lav
11、age,transtracheal aspirate白喉棒状杆菌的Elek平板毒力测定脑膜炎、脑炎、脑脓肿双份血清的滴度呈4倍或4倍以上升高，microscopic examination检测病原体成分（抗原和核酸）（2）体外毒力试验Sputum,bronchal lavage,transtracheal aspirate乙型脑炎病毒，单纯疱疹病毒microscopic examination（2）体外毒力试验新生隐球菌假丝酵母菌（白色念珠菌）革兰染色革兰染色 墨汁负染墨汁负染 2.2.不染色标本不染色标本 1)1)检查生活状态下细菌的动力及运动状况检查生活状态下细菌的动力及运动状况2 2）螺
12、旋体由于不易着色并有形态特征螺旋体由于不易着色并有形态特征 对某些病原菌作出初步鉴定，如霍乱弧菌对某些病原菌作出初步鉴定，如霍乱弧菌 常用方法常用方法 压片法压片法(压滴法压滴法)或悬滴法或悬滴法 暗视野显微镜或相差显微镜检查暗视野显微镜或相差显微镜检查体癣皮屑可见关节孢子体癣皮屑可见关节孢子HAV particles found in fecal extracts by immunoelectron microscopy HAV形态电镜图粪便标本负染 X200000 3.直接电镜检测直接电镜检测EM 免疫电镜技术免疫电镜技术IEM（二）（二）分离培养和鉴定分离培养和鉴定 分离培养是微生物学诊
13、断的金分离培养是微生物学诊断的金标准，是最可靠的传统诊断技术标准，是最可靠的传统诊断技术临床意义：临床意义：1.1.明确感染病原体明确感染病原体2.2.为临床提供体外抗微生物药物敏为临床提供体外抗微生物药物敏 感试验结果感试验结果药物敏感试验药物敏感试验培养特征培养特征形态特征形态特征生化试验生化试验血清学试验血清学试验毒力试验毒力试验1.细菌的分离培养和鉴定细菌的分离培养和鉴定培培养养特特征征细菌学诊断细菌学诊断形态特征形态特征血清学鉴定血清学鉴定大肠埃希菌大肠埃希菌对照-吲哚试验吲哚试验枸椽酸盐利用试验枸椽酸盐利用试验大肠埃希菌大肠埃希菌甲基红试验甲基红试验VP试验试验大肠埃希菌大肠埃希菌
14、大肠埃希菌大肠埃希菌对照-对照+对照+生化试验生化试验一）病毒分离培养一）病毒分离培养 1 1动物接种动物接种（二）（二）病毒的分离与鉴定病毒的分离与鉴定 2鸡胚培养鸡胚培养卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种尿囊接种及羊膜腔接种尿囊接种及羊膜腔接种敏感动物合适部位敏感动物合适部位2）红细胞吸附（hemadsorption）肿大、数个细胞融合成多核巨细胞等。肿大、数个细胞融合成多核巨细胞等。第二节 感染性疾病的常用病原学检测Bacteria culture脑膜炎、脑炎、脑脓肿以细菌外毒素的特异性免疫血清为抗体与被检细菌外毒素(抗原)进行抗原抗体反应，来检测外毒素，从而鉴定细菌是
15、否产生该种毒素。First reportanaerobic culture(鲎试剂)凝固酶原 凝固酶代谢产物（生化试验）病原体抗原成分的检测：厌氧培养采用膀胱穿刺法、无菌厌氧小瓶运送刘,男,40岁，因腹痛、腹泻2天入院。（二）呼吸系统感染的病原学检查病毒在培养细胞中增殖的指标代谢产物（生化试验）colony characteristicsEnrichment broths,3组织细胞培养：组织细胞培养：目前培养病毒应用最广的方法目前培养病毒应用最广的方法 （1）原代和次代细胞培养 （2）二倍体细胞培养 （3）传代细胞培养 识别病毒在培养细胞中增殖识别病毒在培养细胞中增殖 病毒在培养细胞中增殖的
16、指标病毒在培养细胞中增殖的指标 1）细胞病变）细胞病变:细胞病变效应（细胞病变效应（CPE）、包涵体）、包涵体 2）红细胞吸附（）红细胞吸附（hemadsorption）细胞病变效应（细胞病变效应（CPECPE）：）：病毒感染细胞后引起的细胞病变，可出现细胞圆缩、裂解或细胞病毒感染细胞后引起的细胞病变，可出现细胞圆缩、裂解或细胞 肿大、数个细胞融合成多核巨细胞等。肿大、数个细胞融合成多核巨细胞等。二）病毒鉴定二）病毒鉴定Cytopathic effect(CPE)of primary severe acute respiratory syndromeassociated coronavirus
17、 strain48h72h36hN病毒学诊断病毒学诊断 常用常用鉴定鉴定试验：试验：中和实验中和实验 血凝抑制实验血凝抑制实验virus 红细胞凝集抑制（红细胞凝集抑制（HI）试验）试验原理：原理：病毒病毒 病毒（特异性抗体）病毒（特异性抗体）+红细胞红细胞 红细胞红细胞 凝集凝集 不凝集不凝集 血凝现象血凝现象 血凝抑制现象血凝抑制现象 Confocal image showing a macrophage in the lung of a mouse infected with SARS-corona virus.Double immunofluorescence labels the m
18、acrophage in red with antibodies against Mac-2 and viral protein in green with antibodies against spike.Sputum,bronchal lavage,transtracheal aspirate采血时间：寒战或体温高峰到来之前0.Procedure for bacterial detection in Clean-catch midstreamurine明确感染病原体Selective medium初报：增菌培养真菌孢子Bacteria culture指导治疗，预防，判断预后同化氮源试验 同
19、化碳源试验相同，但需用无氮源的培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾。Serological indentification病原体抗原成分的检测：24小时内采集23次microscopic examination显微镜对标本或组织中的病原体的形态学检查自然排便，挑取脓、血或粘液部分于清洁容器中送检；革兰阳性球菌：葡萄球菌、链球菌、肠球菌查病原体：形态与结构检查（一）引起呼吸系统感染常见微生物与常见疾病BA,CA,MAC,L-JGram stain球菌：菌数 10/m1，尿路感染肿大、数个细胞融合成多核巨细胞等。（三）真菌的分离培养（三）真菌的分离培养 常用培养基常用培养基 沙保（沙保（Sabouru
20、d）培养基）培养基 真菌的菌落有两种：酵母型菌落和丝状菌落真菌的菌落有两种：酵母型菌落和丝状菌落酵母型菌落酵母型菌落丝状菌落丝状菌落新生隐球菌假丝酵母菌（白色念珠菌）（三）鉴定（三）鉴定1.1.糖糖(醇醇)类发酵试验类发酵试验 3737孵育，观察糖发酵情况。孵育，观察糖发酵情况。2.2.同化碳源试验同化碳源试验 含菌生理盐水与已融化的固体同化碳含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基源培养基(45)(45)混合，然后在培养基上分别加糖，置混合，然后在培养基上分别加糖，置2525孵育观察结果。若孵育观察结果。若24h24h后无变化可重复加糖。如能后无变化可重复加糖。如能同化周围有生长圈，否则无生
21、长。同化周围有生长圈，否则无生长。3.3.同化氮源试验同化氮源试验 同化碳源试验相同，但需用无氮源的同化碳源试验相同，但需用无氮源的培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾。培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾。（三）病原体抗原与抗体的检测（三）病原体抗原与抗体的检测n病原体抗原成分的检测：病原体抗原成分的检测：早期诊断早期诊断 现症感染现症感染n特异性特异性 IgMIgM：早期诊断早期诊断 现症感染现症感染n特异性特异性 IgGIgG：双份血清的滴度呈双份血清的滴度呈4 4倍或倍或4 4倍以上升高，倍以上升高，考虑病原体现症感染考虑病原体现症感染 *排除交叉反应的影响排除交叉反应的影响Procedure
22、 for bacterial detection in blood镜检可以了解有无病原体及大致的量2）红细胞吸附（hemadsorption）细胞病变效应（CPE）：2）红细胞吸附（hemadsorption）分离培养是微生物学诊断的金标准，是最可靠的传统诊断技术Sabouraud agar(二)血流感染的病原学检查microscopic examination染色标本：了解病原体的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体菌数10/m1 l0/ml：结合临床Korthoff mediumSerological indentificationanaerobic culture分离培养是微生物学诊断的金
23、标准，是最可靠的传统诊断技术（2）二倍体细胞培养细菌外毒素对机体的毒性作用，可被相应抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，然后再注射外毒素，则动物不产生中毒症状。一定的参考意义Giemsa stainstain of smear and目前培养病毒应用最广的方法夹心夹心ELISA(检测抗原）检测抗原）间接间接ELISA(检测抗体）检测抗体）（四）病原体核酸检测（四）病原体核酸检测 1 1核酸杂交技术核酸杂交技术 通过已知序列的探针与病原体的核苷酸杂交，通过已知序列的探针与病原体的核苷酸杂交，用以了解病原体的有无用以了解病原体的有无。SouthernSouthern印迹杂交（印迹杂交（Souther
24、n blotSouthern blot）NorthernNorthern印迹杂交（印迹杂交（Northern blotNorthern blot）斑点杂交（斑点杂交（dot blotdot blot）原位杂交（原位杂交（in situ hybridization,ISHin situ hybridization,ISH）2 2PCRPCR扩增病原体微生物特异的扩增病原体微生物特异的DNADNA或或 RNARNA片段片段 常用于检测不能在体外培养或目前的培养技术不敏感、常用于检测不能在体外培养或目前的培养技术不敏感、费用高昂或耗时长的病原体费用高昂或耗时长的病原体 genomeprobe32P
25、35S 3H 125I 生物素生物素 地高辛地高辛 酶酶genomegenomegenomeprobeprobeprobe检测方法：放射自显影检测方法：放射自显影 底物显色底物显色 化学发光化学发光2 2PCR PCR 3.3.生物芯片技术生物芯片技术 核酸检测结果评价核酸检测结果评价n检测病原体微生物最灵敏的方法检测病原体微生物最灵敏的方法n早期诊断早期诊断n现症感染现症感染n假阳性与假阴性假阳性与假阴性 （五）细菌毒素的检测（五）细菌毒素的检测 1.1.内毒素的测定内毒素的测定 常用方法：鲎试验常用方法：鲎试验（limulus tests）内毒素与鲎试剂接触时，可激活凝固酶原，使可溶内毒素
26、与鲎试剂接触时，可激活凝固酶原，使可溶 性的凝固蛋白原变成凝胶状态的凝固蛋白性的凝固蛋白原变成凝胶状态的凝固蛋白 内毒素内毒素(鲎试剂鲎试剂)凝固酶原凝固酶原 凝固酶凝固酶 凝固蛋白原凝固蛋白原 凝固蛋白凝固蛋白(凝胶凝胶)2.2.外毒素的测定外毒素的测定（1 1）体内毒力试验）体内毒力试验 细菌外毒素对机体的毒性作用，可被相应抗毒素中和，细菌外毒素对机体的毒性作用，可被相应抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，然后再注射外毒素，则动物若先给动物注射抗毒素，然后再注射外毒素，则动物不产生中毒症状。不产生中毒症状。（2 2）体外毒力试验）体外毒力试验 以细菌外毒素的特异性免疫血清为抗体与被检细菌外毒
27、素以细菌外毒素的特异性免疫血清为抗体与被检细菌外毒素(抗抗原原)进行抗原抗体反应，来检测外毒素，从而鉴定细菌是否产生进行抗原抗体反应，来检测外毒素，从而鉴定细菌是否产生该种毒素。该种毒素。白喉棒状杆菌的白喉棒状杆菌的ElekElek平板毒力测定平板毒力测定 （)免疫学方法：免疫学方法：如如ELISAELISA法法 葡萄球菌肠毒素、肠产毒型大肠埃希菌葡萄球菌肠毒素、肠产毒型大肠埃希菌LTLT及及STST等的测定等的测定 （4 4）分子技术）分子技术 Elek平板试验Elek Test沉淀线(阳性)含白喉抗毒素滤纸片白喉杆菌菌苔标准产毒株(六）体外抗菌药物敏感试验六）体外抗菌药物敏感试验常用方法常
28、用方法n纸片扩散法（纸片扩散法（Kirby-Bauer test）n稀释法（稀释法（dilution test）nE试验法（试验法（E test）n杀菌试验杀菌试验n体外联合药物敏感试验体外联合药物敏感试验 第三节第三节 常见感染性疾病的实验诊断常见感染性疾病的实验诊断一、血流感染一、血流感染（一）引起血流感染常见微生物与常见疾病（一）引起血流感染常见微生物与常见疾病n常见微生物常见微生物革兰阳性球菌：葡萄球菌、革兰阳性球菌：葡萄球菌、链球菌、肠球菌链球菌、肠球菌革兰阴性杆菌：大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷革兰阴性杆菌：大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、沙门菌伯菌、沙门菌真菌：真菌：
29、病毒：病毒：HBVHBV、HCVHCVn血流感染常见疾病血流感染常见疾病细菌：菌血症、败血症、脓毒血症细菌：菌血症、败血症、脓毒血症真菌：真菌血症真菌：真菌血症病毒：病毒血症病毒：病毒血症(二二)血流感染的病原学检查血流感染的病原学检查1.1.血液标本采集与运送血液标本采集与运送n采血时间：寒战或体温高峰到来之前采血时间：寒战或体温高峰到来之前0.50.51hr1hr 24小时内采集小时内采集23次次n采血量：成人采血量：成人5 510ml10ml，婴儿和儿童为，婴儿和儿童为1 12ml2mln运送：血液置于含抗凝集聚茴香脑磺酸钠无菌瓶中送检运送：血液置于含抗凝集聚茴香脑磺酸钠无菌瓶中送检St
30、ool,rectal swab,food and water类型：鼻咽拭子、痰和经气管采集的标本aerobic cultureProcedure for bacterial detection in Clean-catch midstreamurine细菌外毒素对机体的毒性作用，可被相应抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，然后再注射外毒素，则动物不产生中毒症状。Endotoxin detectionBacteria growthSouthern印迹杂交（Southern blot）流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒镜检可以了解有无病原体及大致的量肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆
31、菌、用分子生物学方法对病原体特异性基因的检测examinationBA,CA,MAC,L-J菌数10/m1 l0/mll0/ml尿路感染尿路感染 球菌：球菌：菌数菌数 10/m1 10/m1，尿路感染，尿路感染 菌数菌数10/m1 10/m1 l0/mll0/ml：结合临床结合临床 注意区分污染菌注意区分污染菌5454检验程序检验程序标本标本 观察菌落性状、溶血性、色素观察菌落性状、溶血性、色素 涂片、染色、镜检涂片、染色、镜检 挑取可疑菌落挑取可疑菌落 生化反应测定生化反应测定 纯培养纯培养 血清学鉴定血清学鉴定 普通琼脂平板普通琼脂平板血平板血平板选择培养基选择培养基分离分离培养培养直接涂
32、片镜检直接涂片镜检增菌增菌 初步鉴别初步鉴别终报终报毒力试验毒力试验药敏试验药敏试验刘,男,40岁，因腹痛、腹泻2天入院。大便10+次/天，初为稀便，后为脓血便，每次量不多，伴腹痛，有里急后重感。临床疑“菌痢”。1本病的病原菌属哪种菌属？2进行微生物学检测最适宜的标本是什么?3采集该标本时应注意哪些问题？4如何进行微生物学检测?血清降钙素原（PCT）First reportCulture(BA)厌氧培养采用膀胱穿刺法、无菌厌氧小瓶运送Bacteria growthGram stain（优选）感染性疾病实验室诊断细菌外毒素对机体的毒性作用，可被相应抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，然后再注射外毒
33、素，则动物不产生中毒症状。呼吸道合胞病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒1）细胞病变:细胞病变效应（CPE）、包涵体病原体抗原成分的检测：3 内源性感染与条件致病菌的感染增加脑脊液应立即保温送检或床边接种，不能暂时保存于Serological indentification乙型脑炎病毒，单纯疱疹病毒Procedure for bacterial detection in Clean-catch midstreamurineGiemsa stainDirect microscopicanaerobic culture2）螺旋体由于不易着色并有形态特征药物敏感试验药物敏感试验培养特征培养特征形态特征形态特征生化试验生化试验血清学试验血清学试验报告报告
