1、第三章：愈伤组织培养(callus culture)主要内容主要内容:基本概念基本概念 植物材料（外植体）的制备植物材料（外植体）的制备 愈伤组织的诱导与分化愈伤组织的诱导与分化 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生 愈伤组织的培养方式愈伤组织的培养方式一、基本概念 脱分化(redifferentiation)：具有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，细胞改变原来的分化状态，失去原有的结构与功能，转变为具有分生能力的细胞的过程。植物离体培养中的脱分化过程 植物离体培养利用特定的条件，促进细胞脱分化，使原已分化并具有一定功能的细胞脱离原轨道，失去其原有状态和功能，而恢复到未分化的愈伤组织状态
2、。植物组织细胞的脱分化能力菠萝的脱分化愈伤组织叶基在脱分化叶基 愈伤组织愈伤组织(Callus)：植物各种器官的外植体在离体的条件下，细胞经脱分化等一系列过程，转变为分生细胞，进而转变形成一种能够迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团 一般低，植物各器官、组织都有被诱发产生愈伤一般低，植物各器官、组织都有被诱发产生愈伤组织的潜在可能性。组织的潜在可能性。再分化再分化(redifferentiation)将处于脱分化状态的愈伤组织移植到合适的培养基上继续培养,愈伤组织就会重新进行分化,并形成具有根、茎、叶的完整植株。这个过程就叫做植物细胞的再分化。愈伤组织培养愈伤组织培养(callus cultur
3、e):是指将母体植株上的各个部分切下，形成外植体，接种到无菌的是指将母体植株上的各个部分切下，形成外植体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织，由外植体形成愈一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织，由外植体形成愈伤组织，标志着植物离体培养的开始。伤组织，标志着植物离体培养的开始。自然条件下的植物愈伤组织自然条件下的植物愈伤组织二二 植物材料（外植体）的制备植物材料（外植体）的制备1.一般植物组织都能诱发愈伤组织。一般植物组织都能诱发愈伤组织。诱导愈伤组织的诱导愈伤组织的成败关键
4、成败关键主要不是实验材料，而主要不是实验材料，而是是培养培养条件，其中条件，其中激素激素的成分和浓度是最重要的的成分和浓度是最重要的因素。因素。双子叶植物为最多，单子叶植物双子叶植物为最多，单子叶植物(1990s)，此外，此外，裸子植物、蕨类和藓类植物也有诱发成功的例子。裸子植物、蕨类和藓类植物也有诱发成功的例子。:所有的多细胞植物都有诱发愈伤组织成功的潜所有的多细胞植物都有诱发愈伤组织成功的潜在可能性。在可能性。双子叶双子叶植物能够迅速地长出愈伤组织。植物能够迅速地长出愈伤组织。单子叶单子叶 1990S重大进展。重大进展。植物的各种组织植物的各种组织，如维管束形成层、贮藏器官，如维管束形成层
5、、贮藏器官的薄壁组织、根的中柱鞘、胚乳、子叶、叶片的薄壁组织、根的中柱鞘、胚乳、子叶、叶片的叶肉、维管束组织等，在合适的条件下，都的叶肉、维管束组织等，在合适的条件下，都能形成愈伤组织能形成愈伤组织。2.2.材料必须完全无菌材料必须完全无菌微生物微生物一旦与培养基接触，就迅速繁殖，一旦与培养基接触，就迅速繁殖，抑制抑制愈伤组织的生长。愈伤组织的生长。用用抗菌素抗菌素来抑制微生物的生长，在来抑制微生物的生长，在短时间短时间有效，有效，而且抗菌素只能对而且抗菌素只能对一定谱系一定谱系中的细菌才产生作中的细菌才产生作用，该谱系以外的微生物仍然可以大量繁殖。用，该谱系以外的微生物仍然可以大量繁殖。抗菌
6、素还可能抗菌素还可能抑制植物组织的生长抑制植物组织的生长。得到无菌材料，植物组织必须得到无菌材料，植物组织必须先进行消毒先进行消毒。有好几种有好几种化学试剂化学试剂都能起到都能起到表面消毒表面消毒的作的作用，试剂的选择及处理用，试剂的选择及处理时间的长短时间的长短要根据要根据材料对试剂的敏感性材料对试剂的敏感性来决定。来决定。一般都采用在消毒后能很容易去除的药剂。一般都采用在消毒后能很容易去除的药剂。因为因为消毒剂消毒剂对植物细胞也有对植物细胞也有杀伤作用杀伤作用，若，若不去除就会不去除就会妨碍妨碍愈伤组织的愈伤组织的发生发生。例如用无菌水例如用无菌水反复冲洗反复冲洗后可以把大部分药后可以把大
7、部分药剂都洗掉，或者能剂都洗掉，或者能自动分解变成低毒性自动分解变成低毒性物物质。质。本氯酸钠本氯酸钠能分解成为具有杀菌效能的能分解成为具有杀菌效能的氯气氯气，然，然后就后就散失到空气散失到空气中。中。低浓度的氯化汞低浓度的氯化汞是一种令人满意的消毒剂，只是一种令人满意的消毒剂，只是是难以去除难以去除，故在消毒后必须用大量清水，故在消毒后必须用大量清水冲洗冲洗材料。材料。在材料放入消毒剂之前，先在在材料放入消毒剂之前，先在乙醇中漂洗乙醇中漂洗一下，一下，可以使材料表面弄湿，从而使可以使材料表面弄湿，从而使消毒剂易于渗入消毒剂易于渗入并杀死微生物。并杀死微生物。3.外植体的大小和形态外植体的大小
8、和形态消毒后的植物材料，即可进行培养。消毒后的植物材料，即可进行培养。从从外表均一外表均一的外植体长出的愈伤组织，在开始阶的外植体长出的愈伤组织，在开始阶段是相当段是相当一致的一致的，而从茎、根等器官切段上长出，而从茎、根等器官切段上长出的则是一个的则是一个混杂的混杂的愈伤组织。愈伤组织。有些外植体有些外植体外表上看来是由同一类细胞外表上看来是由同一类细胞组成，例组成，例如烟草的髓、胡萝卜的次生韧皮部、菊芋的块茎如烟草的髓、胡萝卜的次生韧皮部、菊芋的块茎等，这些细胞中等，这些细胞中DNA的含量有很大差别。这种差的含量有很大差别。这种差别可能是由于别可能是由于细胞核中染色体数目的差别，即倍细胞核
9、中染色体数目的差别，即倍性不同性不同所造成的。所造成的。得到形态一致的愈伤组织的培养策略得到形态一致的愈伤组织的培养策略从切段中取出从切段中取出某一种组织某一种组织进行培养。进行培养。改变培养基改变培养基的组成，只促的组成，只促进某一类细胞进某一类细胞分裂而分裂而抑抑制其他制其他细胞分裂的办法来建立这一类细胞的愈伤细胞分裂的办法来建立这一类细胞的愈伤组织。组织。往往培养基略加改变就能改变愈伤组织的整个性往往培养基略加改变就能改变愈伤组织的整个性质。质。接种的外植体的大小和形状并不需要严格限制接种的外植体的大小和形状并不需要严格限制不能太小，小于肉眼能见的限度时，细胞分裂可不能太小，小于肉眼能见
10、的限度时，细胞分裂可能难以发生。故一般要求切块的大小要适当。能难以发生。故一般要求切块的大小要适当。外植体的外植体的细胞数目多细胞数目多，获得愈伤组织的机会也多。，获得愈伤组织的机会也多。如果目的仅在于得到愈伤组织，如果目的仅在于得到愈伤组织，那末将茎的切那末将茎的切段、叶、根、花、果实或种子，或其中的某种段、叶、根、花、果实或种子，或其中的某种组织切成一片片或一块块放到培养基上就可以组织切成一片片或一块块放到培养基上就可以了。了。如果要定量地研究愈伤组织的发生，如果要定量地研究愈伤组织的发生，那末外植体那末外植体的的大小必须一致大小必须一致，形状和组成形状和组成也要也要基本基本相同。进相同。
11、进行这类研究常选用行这类研究常选用组织块较大的材料组织块较大的材料，例如胡萝，例如胡萝卜的贮藏根、马铃薯的块茎、菊芋、荷兰防风草卜的贮藏根、马铃薯的块茎、菊芋、荷兰防风草等。这样才能得到等。这样才能得到足够数量的、无菌的、一致的、足够数量的、无菌的、一致的、适合于培养的外植体适合于培养的外植体。三、愈伤组织的诱导与分化一）愈伤组织诱导的操作程序愈伤组织诱导的操作程序 获取外植体材料获取外植体材料消毒处理消毒处理修整除去坏死组修整除去坏死组织织切成切成5mm5mm的圆柱形或方形小块的圆柱形或方形小块直放或倒放到培养直放或倒放到培养基上基上每每9cm9cm培养基接种培养基接种5 56 6块外植体块
12、外植体培养。培养。选用较大组织做材料时，可用打孔器从块茎和块根选用较大组织做材料时，可用打孔器从块茎和块根中钻取一批圆柱型组织，切成相同厚度的小圆片进行培中钻取一批圆柱型组织，切成相同厚度的小圆片进行培养。养。圆柱形圆柱形大量地大量地、准确地准确地得到得到外形相同外形相同的外植体。的外植体。圆柱体的圆柱体的表面积大表面积大，利于组织块和外界，利于组织块和外界气体和营养物的气体和营养物的交换交换。外植体的外植体的损伤表面分泌物损伤表面分泌物，具有，具有促进愈伤组织促进愈伤组织形成的能形成的能力，因此力，因此表面积越大表面积越大，产生，产生分泌物分泌物数量也越多，愈伤组数量也越多，愈伤组织的得率也
13、越高。织的得率也越高。外植体的体积应尽可能小，从而得到较大数量的外植体。外植体的体积应尽可能小，从而得到较大数量的外植体。外植体最小的限度由其亲本外植体最小的限度由其亲本组织细胞的平均大小来决定组织细胞的平均大小来决定。细胞数目。细胞数目。采用圆形的原因：采用圆形的原因：例如例如菊芋菊芋的细胞比的细胞比胡萝卜根次生韧皮部胡萝卜根次生韧皮部的细胞的细胞大三倍，一个大三倍，一个3.8毫克的胡萝卜外植体大约包含毫克的胡萝卜外植体大约包含25，000个细胞，这样一个外植体是能够成活的。个细胞，这样一个外植体是能够成活的。而同样重量的菊芋外植体，由于细胞大而数目而同样重量的菊芋外植体，由于细胞大而数目少
14、，在分离过程中造成损伤往往难以成活。必少，在分离过程中造成损伤往往难以成活。必须重量达到须重量达到8毫克才包含约毫克才包含约20，000个细胞，使个细胞，使之易于成活。之易于成活。二）、愈伤组织的诱导 诱导愈伤组织的诱导愈伤组织的成败关键成败关键主要不是实验材料，而是主要不是实验材料，而是培养培养条件，其中条件，其中激素激素的成分和浓度是最重要的因素。的成分和浓度是最重要的因素。1、常用激素与浓度激素类型 激素浓度生长素类（2，4-D,IAA,NAA)0.0110 mg/L细胞分裂素类（玉米素，6-BA)0.110 mg/L三）、影响愈伤组织诱导的因素：1）、激素：多数情况下，单独使用2，4-
15、D可以成功诱导愈伤组织的发生案例1：MS培养基含有不同浓度2，4-D时斑茅幼叶形成愈伤组织的诱导率（%）不同浓度的2，4-D对愈伤组织的诱导率是不同的。一般情况下，2，4-D的浓度过低（低于10-9mg/L）时，愈伤组织生长缓慢；浓度过高（高于10 mg/L）时，就会抑制愈伤组织的生长。案例2.不同培养基及激素浓度对诱导扁桃花药愈伤组织的影响不同培养基及激素浓度对诱导扁桃花药愈伤组织的影响 无论在MS还是在H或B5培养基中，不附加激素2,4-D均不能诱导扁桃花药愈伤组织的形成，扁桃花药在H+1.0mg/L 2,4-D的培养基上诱导率最高为47%;在MS+1.0mg/L 2,4-D培养基上诱导率
16、为67.0%;在B5+0.51.0mg/L2,4-D，出愈率都在84.0%以上，其中以2,4-D为0.5mg/L时，出愈率高达100%.。说明在扁桃花药诱导过程中，最适基本培养基是B5，最佳 2,4-D浓度为0.5mg/L。研究表明：生长素与细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是二者搭配使用时更能强烈刺激愈伤组织的形成。在愈伤组织的诱导时，植物材料不同所用的植物生长调节物质不同，使用的浓度也不同。2）.培养基不同的培养基成分对植物不同器官的愈伤组织诱导存在着影响 培养基培养基一般一般包括包括大量大量元素、元素、微量微量元素和一种元素和一种碳碳水化合物水化合物，最常用的碳水化合物是蔗
17、糖。，最常用的碳水化合物是蔗糖。这样简单的培养基这样简单的培养基(基本培养基基本培养基)只有很少几种植只有很少几种植物组织能够培养和维持下去，大多数组织需要物组织能够培养和维持下去，大多数组织需要添加各种各样的附加物添加各种各样的附加物（完全培养基）（完全培养基），如维，如维生素、氨基酸、糖醇，生长素、细胞分裂素、生素、氨基酸、糖醇，生长素、细胞分裂素、赤霉素、螯合剂如赤霉素、螯合剂如EDTA、各种营养性的提取物、各种营养性的提取物如椰子汁等。如椰子汁等。注意：选用完全已知的注意：选用完全已知的合成化合物合成化合物，不大主张用，不大主张用复杂的复杂的天然产物天然产物，如酵母提取物、番茄汁、椰子
18、，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。汁等。必须强调：必须强调：适合于适合于诱发诱发愈伤组织的培养基不一定适合于愈伤组织的培养基不一定适合于维持维持这些愈伤组织；适合于这些愈伤组织；适合于液体液体培养的培养基也不一培养的培养基也不一定适合于定适合于固体固体培养。培养。早期，早期，采用无机盐浓度低的培养基，采用无机盐浓度低的培养基，化学工业不够发化学工业不够发达，化学试剂中杂质含量较高达，化学试剂中杂质含量较高。用高浓度无机盐带入更。用高浓度无机盐带入更大量的杂质，往往会抑制愈伤组织的生长。大量的杂质，往往会抑制愈伤组织的生长。近代近代，MS培养基或类似培养基或类似MS培养基的高浓度的培养基培养基的
19、高浓度的培养基。高浓度无机盐既有利于保证组织生长所需的矿质营养，高浓度无机盐既有利于保证组织生长所需的矿质营养，愈伤组织生长快，又因离子浓度高，在配制、贮存、消愈伤组织生长快，又因离子浓度高，在配制、贮存、消毒等过程中，若某种成分略有出入，也毒等过程中，若某种成分略有出入，也不致影响不致影响培养基培养基的的离子平衡离子平衡。培养基中的培养基中的N，大多数都用，大多数都用硝态氮硝态氮，只有，只有MS培培养基和养基和B5培养基中才用硝态和铵态的混合物。培养基中才用硝态和铵态的混合物。K的水平在近代的培养基中有逐渐提高的趋势。的水平在近代的培养基中有逐渐提高的趋势。有趣的是，有趣的是，各种离子各种离
20、子浓度大为不同浓度大为不同的培养基往的培养基往往能使往能使相同的组织快速生长相同的组织快速生长。例如。例如Hildebrandt培养基与培养基与MS培养基培养基显著不同显著不同，但二者都能培养，但二者都能培养烟草的愈伤组织。烟草的愈伤组织。不同的培养基成分对植物不同器官的愈伤组织诱导存在着影响 二)愈伤组织的形成 愈伤组织从增殖的组织细胞中产生，激愈伤组织从增殖的组织细胞中产生，激素改变细胞的新陈代谢状态，从生长静止素改变细胞的新陈代谢状态，从生长静止期到代谢旺盛。期到代谢旺盛。二)愈伤组织的形成 三个时期愈伤组织的代谢状况、结构以及细胞的三个时期愈伤组织的代谢状况、结构以及细胞的平均大小都有
21、明显的差别。平均大小都有明显的差别。从外植体脱分化从外植体脱分化形成形成典型的典型的愈伤愈伤组织大致可分为组织大致可分为三个时期：三个时期：愈伤组织分化愈伤组织分化诱导期诱导期分裂期分裂期分化期分化期诱导期（诱导期（Induction,起动期、或起始期）起动期、或起始期）:起动期：起动期：细胞准备分裂的时期，愈伤组织形成起点。细胞准备分裂的时期，愈伤组织形成起点。外植体细胞在完整植株中随着细胞的分化过程而逐渐停止分外植体细胞在完整植株中随着细胞的分化过程而逐渐停止分裂，开始执行它们各自不同的功能。外植体细胞一般处于静止状裂，开始执行它们各自不同的功能。外植体细胞一般处于静止状态，称为静止细胞。
22、态，称为静止细胞。在外源植物激素的作用下，处于静止状态的植物细胞经过复在外源植物激素的作用下，处于静止状态的植物细胞经过复杂的脱分化过程恢复分裂能力转化为分生细胞。此过程有人称之杂的脱分化过程恢复分裂能力转化为分生细胞。此过程有人称之为：细胞的诱导活化过程。为：细胞的诱导活化过程。有人认为损伤是诱导细胞分裂的重要因素。受伤细胞释放出有人认为损伤是诱导细胞分裂的重要因素。受伤细胞释放出的物质与外源激素共同诱导细胞发生分裂，是诱导植物愈伤组织的物质与外源激素共同诱导细胞发生分裂，是诱导植物愈伤组织形成的主要原因。形成的主要原因。Brown（1972）认为静止细胞是具有分裂能力的，只是被存在的一类抑
23、制物质所阻止，而使其分裂能力不能表现，如果除去抑制物质，就可恢复分裂能力。若加入抵消抑制物质影响的外源物质（激素），细胞就立即进行DNA复制，全部细胞进入S期，并发生同步分裂。特点：特点：在诱导期，代谢活化了，细胞内的在诱导期，代谢活化了，细胞内的合成代谢迅速进行，但是细胞的大合成代谢迅速进行，但是细胞的大小仍然和外植体时一样，没有多大小仍然和外植体时一样，没有多大改变。改变。处于起始期外植体诱导期的长短诱导期的长短 由一系列由一系列内部（植物的种类、生理状况）内部（植物的种类、生理状况）和外部（光照、外源激素）因素和外部（光照、外源激素）因素决定。决定。例如例如：菊芋的诱导期有时还不需要：菊
24、芋的诱导期有时还不需要1天，天，胡萝卜则要好几天，而菊芋块茎贮藏时胡萝卜则要好几天，而菊芋块茎贮藏时间的改变，诱导期也发生改变。从间的改变，诱导期也发生改变。从11月月到次年到次年4月取菊芋块茎进行培养，则诱导月取菊芋块茎进行培养，则诱导期从期从22小时逐渐延长到小时逐渐延长到40小时。小时。故可以从内外因两方面着手，改变诱导期长短故可以从内外因两方面着手，改变诱导期长短主要外因方面是主要外因方面是添加一些生长物质添加一些生长物质Steward等等(1964)用用2,4-D及其及其类似的生长调节类似的生长调节物质处理处于物质处理处于静止状态的组织静止状态的组织，看到，看到RNA的的含量含量很快
25、明显地增加很快明显地增加。并且。并且2、4-D积累在分裂积累在分裂细胞的核仁中。细胞的核仁中。Yeoman 和和 Mitchell(1970)指出了指出了核仁核仁是生长是生长物质的物质的作用部位作用部位。分裂期Cell division)：Active cell division,cells revert to a meristematic(分生组织的分生组织的)dedifferentiated state.外植体外植体(explant)中中已分已分化的活细胞化的活细胞在在外源激素外源激素的作的作用下，外植体用下，外植体外层细胞外层细胞出现出现了分裂，由于外层细胞的了分裂，由于外层细胞的迅迅速
26、分裂速分裂使得这些细胞的使得这些细胞的体积体积缩小缩小，逐渐回复到，逐渐回复到分生组织分生组织状态状态，该时期细胞通过，该时期细胞通过脱分脱分化化的起动期而进入的起动期而进入分裂，分裂，并并开始开始形成愈伤组织。形成愈伤组织。分裂期特征特征：生理生化上分裂期的一个明显特征生理生化上分裂期的一个明显特征是是外层细胞进行分裂外层细胞进行分裂，而，而中间的细胞不中间的细胞不分裂分裂。另外还有细胞数目增加，体积变。另外还有细胞数目增加，体积变小；细胞核和核仁增到最大，小；细胞核和核仁增到最大，RNA含量含量达到最高等。达到最高等。此时期的愈伤组织：细胞分裂快，结构疏散，缺少组织的结构，颜色浅而透明。分
27、裂期愈伤组织分裂期愈伤组织1mg/l 2,4-D10mg/l 2,4-Dp 1.1.细胞的细胞的数目迅速增加数目迅速增加。p 2.2.每个细胞每个细胞平均鲜重下降平均鲜重下降。p 3.3.细胞体积小，内无液泡细胞体积小，内无液泡。p 4 4细胞的核和核仁增大到最大。细胞的核和核仁增大到最大。p 5.5.细胞中细胞中RNARNA含量减少，而含量减少，而DNADNA含量保持不含量保持不变变。p 6.6.随着细胞不断分裂和生长，随着细胞不断分裂和生长，细胞总干细胞总干重、蛋白质和核酸量大大增加，新细胞壁重、蛋白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快合成极快。分裂期细胞的主要表现分裂期细胞的主要表现:植
28、物分裂期脱分化规律植物分裂期脱分化规律：胡萝卜等脱分化较禾谷类容易胡萝卜等脱分化较禾谷类容易 茎叶较花器脱分化茎叶较花器脱分化 幼嫩茎组织比老组织较容易幼嫩茎组织比老组织较容易分化期（分化期（Differentiation）：）：A p p e a r a n c e o f c e l l u l a r differentiation and the expression of secondary metabolic pathways.分化期：分化期：细胞分裂从分裂期的周缘细胞分裂为主逐渐转向内部的组织细胞，愈伤组织表层细胞分裂减缓或停止，内部深层细胞分裂并形成像维管束或类似于分生组织组成
29、的鸟巢状结构的次生组织。此时期中细胞的伸展和分裂处于此时期中细胞的伸展和分裂处于平衡，故细胞的平均大小趋于稳平衡，故细胞的平均大小趋于稳定。定。分化期愈伤组织的特点：生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色，有光泽；也有浅绿色或绿色；而老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。A A 细胞分裂部位和方向发生改变细胞分裂部位和方向发生改变：B B 形成瘤状或片状形成瘤状或片状的的分生组织结节分生组织结节。或。或维管组织维管组织结节。结节。C C 细胞的体积相对稳定，不再减少。细胞的体积相对稳定，不再减少。D D 出现了各种类型的细胞出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、：如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、分生
30、细胞、色素细胞薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等。等。E E 生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的多转化为黄色或褐色老化的多转化为黄色或褐色。分化期细胞特点：分化期细胞特点：提醒：根据形态变化列出三个时期，实际上根据形态变化列出三个时期，实际上它们的界限并不分严格，特别是分裂期它们的界限并不分严格，特别是分裂期和分化期。一块培养组织的细胞既有分和分化期。一块培养组织的细胞既有分裂的又有分化的。裂的又有分化的。愈伤组织类型愈伤组织类型Callus types Callus may be heavily lignified（木质化）（木质化）and
31、 hard in texture,w h e r e a s o t h e r s b r e a k e a s i l y i n t o s m a l l f r a g m e n t s(friable).Different types of Gloriosa(火炎花)callus:Friable Hard/lignified callus Rhizogenic callus Callus exuding sticky poly-saccharides 愈伤组织的类型：不同植物来源的愈伤组织，在质地、形态和物理性状方面均有明显的差异。有的愈伤组织呈淡黄色或白色，有的愈伤组织呈绿色
32、或红色。一般来说，来源于相同组织的愈伤组织含有的色素大致相同，但经过反复继代培养后会失去色素。根尖愈伤组织（无色透明）茎尖愈伤组织（淡绿色）植物愈伤组织类型举例：植物愈伤组织类型举例：当归茎段愈伤组织（绿色）当归茎段愈伤组织（绿色）香茶菜愈伤组织香茶菜愈伤组织 锁阳愈伤组织（红色）锁阳愈伤组织（红色）愈伤组织类型及特征愈伤组织类型及特征 1.结构致密型：表面光滑有光泽，结构致密，多为淡黄色或 白色，易于再生芽 2.结构松散型：多为白色，可以用于悬浮系建立 3胚性愈伤组织：具有产生胚状体能力。愈伤组织的基本解剖学：愈伤组织的基本解剖学：基本解剖学基本解剖学特征明显差异。特征明显差异。菜豆，凡是菜
33、豆，凡是脆的脆的都有大量的都有大量的分生组织中心分生组织中心或或瘤瘤状状结构，它们被大而结构，它们被大而未分化的细胞所分开未分化的细胞所分开；而；而不脆不脆的类型的类型很少分化很少分化，而且大部分是高度液泡化细胞。，而且大部分是高度液泡化细胞。单冠毛菊，单冠毛菊，脆的脆的愈伤组织由愈伤组织由松散排列松散排列的细胞组成，的细胞组成，坚实的坚实的愈伤组织是由愈伤组织是由堆得很紧堆得很紧的细胞所组成。的细胞所组成。愈伤组织的化学成分：愈伤组织的化学成分：蚕豆蚕豆，不脆的愈伤组织有大量的，不脆的愈伤组织有大量的组成细胞组成细胞壁的多糖壁的多糖，以单位干重计，细胞壁的部分，以单位干重计，细胞壁的部分也多
34、；但与果胶物质及半纤维素相比，纤也多；但与果胶物质及半纤维素相比，纤维素的百分率是低的。无疑，大量的维素的百分率是低的。无疑，大量的纤维纤维素增加素增加了细胞的了细胞的硬度硬度，而，而果胶果胶含量的增加，含量的增加，保证了细胞紧紧地保证了细胞紧紧地粘粘在一起而在一起而不易断碎不易断碎。Callus may have a yellow,white,green or red(anthocyanin 花青苷花青苷)appearance.影响植物愈伤组织形成的因素：1、同一植株不同器官形成愈伤组织的能力不同。例如：君子兰 用MS+2mg/L 6-BA+2mg/L NAA+1mg/L 2,4-D 固体培
35、养基培养，茎尖、茎切块和叶片形成愈伤组织的诱导率分别为85%、13%和72%；若用MS+5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+1mg/L 2,4-D 固体培养基培养,三种外植体形成愈伤组织的诱导率分别为82%、9%和70%。这说明培养基中植物生长物质组成的比例不同，直接影响着愈伤组织的形成。杨宁1等人的研究表明，植物扁桃（Naporeil品种）的茎段、花药在适宜的培养基上能比较容易的诱导出愈伤组织，而叶肉组织则不能或难以诱导形成愈伤组织。影响植物愈伤组织形成的因素：2、选择适宜基本培养基不仅影响愈伤组织的诱导，而且影响伤组织的生长。于树宏和李玲（1999）用浅绿色野葛叶片愈伤组织进行继
36、代培养，用MS+1mg/L NAA，愈伤组织呈浅绿色，新鲜健壮；在培养基中同时加入3mg/L 6-BA 和1mg/L NAA,愈伤组织生长迅速，若培养时间较长，形成的愈伤组织呈白、硬颗粒状，部分会发生褐变死亡；但若将愈伤组织置于含相同浓度6-BA和NAA的 B5 培养基上生长，愈伤组织可以始终保持新鲜健壮的外观，而且不断生长。杨宁2等人用MS培养基作为基本培养继进行当归愈伤组织增殖培养的研究表明，单独使用一种生长素时，愈伤组织增殖很不明显；若只使用一种细胞分裂素时，愈伤组织均不见增殖，并且生长状况也不佳；但将二者合理搭配使用时，愈伤组织不仅增殖较明显，而且生长状况较佳。可见，兼用生长素和6-B
37、A增效作用较明显 基本培养基对当归愈伤组织继代的影响基本培养基对当归愈伤组织继代的影响*注：注：“+”表示基本可以生长表示基本可以生长;“+”表示生长较好表示生长较好,继代较好；继代较好；“+”表示继代最表示继代最好好.*表中数据取材于杨宁等人的表中数据取材于杨宁等人的当归愈伤组织的增殖与分化培养当归愈伤组织的增殖与分化培养 不同激素组合对当归愈伤组织增殖的影响不同激素组合对当归愈伤组织增殖的影响*注：注：“+”表示基本可以生长表示基本可以生长;“+”表示生长较好表示生长较好,继代较好；继代较好；“+”表示继代最表示继代最好好.*表中数据取材于杨宁等人的表中数据取材于杨宁等人的当归愈伤组织的增
38、殖与分化培养当归愈伤组织的增殖与分化培养 三、愈伤组织的形态发生三、愈伤组织的形态发生 愈伤组织培养物在某些条件下，可以愈伤组织培养物在某些条件下，可以再分再分化产生不定芽或根的分生组织化产生不定芽或根的分生组织甚至是甚至是胚状体胚状体，继之，由这些有结构的组织而发育成继之，由这些有结构的组织而发育成苗或完整苗或完整小植株小植株。愈伤组织通过愈伤组织通过再分化形成再生植株的方式再分化形成再生植株的方式主要有三种：主要有三种：1)、先产生、先产生芽，芽，后在茎的基部长后在茎的基部长根根；2)先长先长根根，再长，再长芽芽；3)愈伤组织的不同部位愈伤组织的不同部位分别形成根和芽。分别形成根和芽。概念
39、：概念：极性极性植物细胞分化中的一个基本现象，指植物的器植物细胞分化中的一个基本现象，指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同轴向上存在的某种形官、组织、甚至单个细胞在不同轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。态结构以及生理生化上的梯度差异。细胞无性系细胞无性系植物离体培养中，任何形式的细胞培养植物离体培养中，任何形式的细胞培养所产生的植株，即称细胞无性系。所产生的植株，即称细胞无性系。一）、器官的形成一）、器官的形成 一般愈伤组织开始分化时，由一般愈伤组织开始分化时，由大小不等大小不等的细的细胞开始逐渐形成胞开始逐渐形成大小均匀的细胞大小均匀的细胞，保持，保持相对稳定相对稳定状态。
40、状态。在分化时，愈伤组织的在分化时，愈伤组织的表层和内部表层和内部都可形成都可形成分生中心分生中心。芽芽多发生在愈伤组织的多发生在愈伤组织的表层表层，属，属外起外起源。源。根根发生在组织的发生在组织的深处深处，与整体植株发生类似，与整体植株发生类似，是是内起源内起源。愈伤组织的愈伤组织的外部形态也随分化而改变外部形态也随分化而改变，一般，一般由由疏松转向紧密疏松转向紧密。植物愈伤组织离体培养中，脱分化植物愈伤组织离体培养中，脱分化形成无极性或无明显形态的愈伤组织块。形成无极性或无明显形态的愈伤组织块。当条件适合时，愈伤组织发生再分化而当条件适合时，愈伤组织发生再分化而产生芽或根的分生组织，甚至
41、体细胞胚，产生芽或根的分生组织，甚至体细胞胚，进而发育成苗或完整植株。进而发育成苗或完整植株。愈伤组织的形态发生有以下两种情愈伤组织的形态发生有以下两种情况：况：1 1、不定芽和根的发生（器官发生）、不定芽和根的发生（器官发生）是愈伤组织培养物或细胞培养中常是愈伤组织培养物或细胞培养中常见的器官发生方式。见的器官发生方式。1 1）愈伤组织通过不定芽和根形成器）愈伤组织通过不定芽和根形成器官的阶段官的阶段外植体脱分化外植体脱分化-愈伤组织愈伤组织 是细胞分裂的结果。是细胞分裂的结果。愈伤组织愈伤组织-瘤状结构瘤状结构 是细胞分化、分化组织出现和有是细胞分化、分化组织出现和有限细胞分裂的结果。限细
42、胞分裂的结果。、瘤状结构、瘤状结构-器官原基器官原基 是分生细胞团分化的结果。是分生细胞团分化的结果。叶片愈伤组织的形成叶片愈伤组织的形成二）愈伤组织的器官发生顺序二）愈伤组织的器官发生顺序1 1、无芽的根或无根的芽、无芽的根或无根的芽 愈伤组织仅有芽或根器官的分别形愈伤组织仅有芽或根器官的分别形成，不能形成完整植株。成，不能形成完整植株。2 2、先芽后根、先芽后根 愈伤组织先形成芽，芽生长后，其愈伤组织先形成芽，芽生长后，其基部发出根，进而形成小植株，是大多数基部发出根，进而形成小植株，是大多数植物的器官发生方式。植物的器官发生方式。如苹果、葡萄、柑橘、番茄、菊花、如苹果、葡萄、柑橘、番茄、
43、菊花、小麦、水稻小麦、水稻3 3、先根后芽、先根后芽 先形成根，再从根的基部分化出芽先形成根，再从根的基部分化出芽形成小植株，双子叶植物中普遍。形成小植株，双子叶植物中普遍。如颠茄、枸杞、苜蓿如颠茄、枸杞、苜蓿4 4、分别形成芽和根、分别形成芽和根 愈伤组织邻近不同部位分别形成芽愈伤组织邻近不同部位分别形成芽和根，两者结合起来形成一株小植株，类和根，两者结合起来形成一株小植株，类似根芽的天然嫁接，但必须根与芽的维管似根芽的天然嫁接，但必须根与芽的维管束相同，才能得到成活植株。束相同，才能得到成活植株。如胡萝卜、石刁柏如胡萝卜、石刁柏三、体细胞胚的发生 愈伤组织愈伤组织 体细胞胚体细胞胚 植株植
44、株魔芋体细胞胚魔芋体细胞胚胚状体形成植株的优点胚状体形成植株的优点 胚状体作为植物组培形态发生常胚状体作为植物组培形态发生常见的重要方式，与不定芽方式比较，具见的重要方式，与不定芽方式比较，具有自身的优点：有自身的优点：1 1、胚状体的数量比不定芽多、胚状体的数量比不定芽多2 2、胚状体可制成人工种子，便于运输、胚状体可制成人工种子，便于运输和贮藏和贮藏3 3、胚状体的有性后代遗传性更接近母、胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。体植株。器官分化的植物激素控制理论器官分化的植物激素控制理论 大量的实验结果表明：大量的实验结果表明：大多数植物组织或器官的再生作用符合器官大多数植物组织或器官的再生
45、作用符合器官分化的植物激素控制理论。分化的植物激素控制理论。即：生长素与细胞分裂素的即：生长素与细胞分裂素的比例小比例小时则产生时则产生苗苗，比例大比例大时则生时则生根根，而两种激素的比例，而两种激素的比例适中适中时，时，则产生无结构的愈伤组织。则产生无结构的愈伤组织。植物物种和品种基因型影响愈伤组织的分化 程林梅等（2001）的研究表明，利用不同基因型大豆品种的下胚轴作外植体进行组培时，培养基对愈伤组织的影响不明显；细胞分裂素（KT）和NAA的配比浓度对其愈伤组织的分化影响显著；不同基因型大豆植株再生作用差异明显；外植体取材时间和取材部位对再生植株的形成也具有较大的影响，再生能力最强的取材部
46、位时从子叶节到下胚轴6mm区段,当下胚轴长到23cm时取材最佳（见表3-6）不同基因型、激素浓度对大豆植株再生的影响*资料来源资料来源:基因型和激素浓度对大豆植株再生的影响基因型和激素浓度对大豆植株再生的影响.程林梅等，程林梅等，植物学通报植物学通报2001.18(3):367-370.木本植物愈伤组织形态发生的人为调控 第一步：利用分化培养基（含有6-BA、CPPU、KT）使愈伤组织形成不定芽，增加繁殖系数。(N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲)第二步：当不定芽长大出现叶片后，再将伸长的苗从基部切下转入含生长素类（如IAA、NAA）的生根培养基上培养诱导根的生成。芦荟愈伤组织形态发生的人
47、为调控 1、先用MS培养附加不同浓度的6BA，促进不定芽的生成。不同浓度不同浓度6-BA对库拉索芦荟增殖的影响对库拉索芦荟增殖的影响芦荟愈伤组织形态发生的人为调控2、然后将抽枝的小植株转移到MS附加不同浓度NAA培养基上培养，诱导根的发生与生长。不同浓度不同浓度NAA对库拉索芦荟生根的影响对库拉索芦荟生根的影响影响愈伤组织分化的其他因素1）、生长素对维管组织分化过程有显著影响.法国植物学家Camus（1949）最早将小营养芽嫁接在一种菊苣属植物根的愈伤组织（由薄壁细胞构成）表面，营养芽经培养一段时间后分化出维管组织。Wetmore等许多人的研究也证实芽之所以能诱导愈伤组织分化是因为它在生长时合
48、成了某些植物激素。一般说来生长素浓度和木质部发生之间存在着一种反比关系，低浓度的生长素能刺激木质部的发生。生长素对维管组织分化所起的作用在很大程度上取决于糖的存在。在洋丁香愈伤组织培养时，如果灌注到愈伤组织顶面缺口里的琼脂含有0.05mg/L的IAA和1%的蔗糖，愈伤组织只能形成很少的木质部分子。若保持生长素浓度不变，而将蔗糖水平增加到2%，则有利于木质部的分化，但韧皮部很少。当蔗糖增至2.5%3.5%时，木质部与韧皮部都可以分化形成，而当蔗糖增至4%时，只有韧皮部的分化。影响愈伤组织分化的其他因素2）细胞分裂素能刺激大豆子叶愈伤组织木质部的分化。3）IAA与激动素之间能协同影响烟草愈伤组织木
49、质部的分化形成。生长素与赤霉素对植物愈伤组织的分化形成也存在着协同作用。乙烯也参与木质部的形成，有人研究发现缺乏乙烯的番茄突变体植株木质部内没有导管，但正常植株是具有导管的。4）硝酸银能抑制大豆愈伤组织木质部的分化，加入蛋氨酸可以克服硝酸银的抑制作用。二、愈伤的培养方式：二、愈伤的培养方式：培养分为固体和液体培养两大类。培养分为固体和液体培养两大类。液体培液体培养又分养又分静止和振荡培养静止和振荡培养的二类。的二类。1、静止液体培养、静止液体培养 是由是由Heller和和Gautheret(1940)在矿质营养在矿质营养工作的基础上发展起来的。方法简便。工作的基础上发展起来的。方法简便。优点：
50、是培养基中优点：是培养基中不出现营养物浓度差异不出现营养物浓度差异的现象，可以用来的现象，可以用来进行许多营养方面的进行许多营养方面的研究工作研究工作。操做方法：操做方法：试管中先放入液体培养基，然后放入滤纸，试管中先放入液体培养基，然后放入滤纸，滤纸制成桥状的支持物滤纸制成桥状的支持物，使它正巧贴在，使它正巧贴在液面上，最后把液面上，最后把组织放在滤纸上组织放在滤纸上。滤纸。滤纸象象灯芯灯芯一样不断给组织提供水分和营养。一样不断给组织提供水分和营养。这种静止培养目前已经很少有人应用了。这种静止培养目前已经很少有人应用了。2、振荡液体培养、振荡液体培养外植体外植体在液体培养基中在液体培养基中不
