1、第十三章免疫细胞分离及表面标志检测优选第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt3免疫细胞的分离及检测免疫细胞的分离及检测检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定方法：体外法为主方法：体外法为主目的：判断机体免疫状态目的：判断机体免疫状态意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效免疫细胞的分离免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的细胞从血液或是指将各种参与免疫反应的细胞从血液或 组织中分离出来组织中分离出来 第一节第一节 免疫细胞的分离免疫细胞的分离 外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离淋
2、巴细胞的分离 T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离 T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离细胞分离基本原理细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞密度不同不同细胞生物学特性不同不同细胞生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同不同细胞表面分化抗原不同一、外周血单个核细胞分离一、外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）包括淋巴细胞和包括淋巴细胞和单核细胞（单核细胞（monocyte）。）。聚蔗糖聚蔗糖-泛影葡泛影葡胺胺聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒处理的硅胶颗粒原理外周血中各细胞的比重不同
3、，原理外周血中各细胞的比重不同，PBMCPBMC的比重为的比重为1.0751.0751.0901.090，红细胞和多核细胞分别为，红细胞和多核细胞分别为1.0931.093和和1.0921.092，选择比，选择比重为重为1.0771.0770.0010.001的介质，细胞与介质混合后离心，比重的介质，细胞与介质混合后离心，比重比介质大的红细胞和多核细胞沉降在下层，而比介质大的红细胞和多核细胞沉降在下层，而PBMCPBMC位于位于 FicollFicoll分离液上层。分离液上层。用用1.0771.0770.0010.001的分层液可分离人外周血单个核细胞的分层液可分离人外周血单个核细胞 Fico
4、ll Ficoll分离液分离液份份6%6%聚蔗糖蒸馏水溶液聚蔗糖蒸馏水溶液份份34%34%泛影葡胺生理盐水溶液泛影葡胺生理盐水溶液(聚蔗糖聚蔗糖-泛影葡胺泛影葡胺）Ficoll外周血外周血一、T细胞表面标志及其亚群聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒与血浆和分离细胞不相溶；第十三章免疫细胞分离及表面标志检测淋巴细胞占；CD4+CD25+调节性T细胞对分离介质的要求：对细胞无毒；E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）优选第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt三、T、B细胞和T细胞亚群的分离001的分层液可分离人外周血单个核细胞001的介质，细胞与介质混合后离心，比重比介质大的红细胞和多核细胞沉
5、降在下层，而PBMC位于 Ficoll分离液上层。对分离介质的要求：对细胞无毒；采用预先形成的密度梯度，分离的细胞轻轻叠加到液面上Percoll 液经离心后可形成一个从管底到液面逐渐递减的连续的密度梯度，不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带，从而将密度不等的细胞分离纯化。对分离介质的要求：对细胞无毒；目的：判断机体免疫状态组织中分离出来此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，T细胞纯度可达90%以上。对分离介质的要求：对细胞无毒；对分离介质的要求：对细胞无毒；等渗；等渗；与血浆和分离细胞不相溶；与血浆和分离细胞不相溶；有特定的比重。有特定的比重。不同动物的不同动物的PBMCPBM
6、C比重有差异：小鼠：比重有差异：小鼠：1.0851.085大鼠：大鼠：1.0871.087 人：人：1.0751.0751.0901.090方法学评价：分离得到的方法学评价：分离得到的PBMCPBMC纯度可达，纯度可达，淋巴细胞占；淋巴细胞占；操作简便；操作简便；易于无菌。易于无菌。二二、淋巴细胞分离、淋巴细胞分离贴壁粘附法贴壁粘附法 吸附柱过滤法吸附柱过滤法 Percoll Percoll 分离液法分离液法 （连续密度梯度离心）（连续密度梯度离心）利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，细胞悬液倾
7、于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，3737温箱静置温箱静置1 h1 h，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。为纯淋巴细胞。橡皮棒刮下贴壁的细胞，可得纯单核细胞橡皮棒刮下贴壁的细胞，可得纯单核细胞(无活性）。无活性）。1.1.贴壁黏附法贴壁黏附法PBMC37 1 hour上清液上清液单核单核单核单核淋巴细胞淋巴细胞注意：注意：B B细胞也可粘附细胞也可粘附 利用单核细胞具有贴壁利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将单个核细胞生长的特点，将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶聚糖凝胶Sephadex G1
8、0Sephadex G10的层的层析柱中，凡有黏附能力的细析柱中，凡有黏附能力的细胞绝大部分被吸附而黏滞在胞绝大部分被吸附而黏滞在柱层中，从柱上洗脱下来的柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。细胞主要是淋巴细胞。2.2.吸附柱过滤法吸附柱过滤法PBMCPBMC洗洗 脱脱 洗脱液洗脱液淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞 DC B细胞细胞 T细胞细胞细胞的粘附能力：细胞的粘附能力：3.Percoll 3.Percoll 分离液法分离液法Percoll Percoll 是一种经聚乙烯吡咯烷酮是一种经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。采用预先形
9、成的密度梯度，毒性。采用预先形成的密度梯度，分离的细胞轻轻叠加到液面上分离的细胞轻轻叠加到液面上Percoll Percoll 液经离心后可形成一个从液经离心后可形成一个从管底到液面逐渐递减的连续的密度管底到液面逐渐递减的连续的密度梯度，不同密度的细胞将悬浮于各梯度，不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带，从而将密度不自不同的密度区带，从而将密度不等的细胞分离纯化。等的细胞分离纯化。死细胞 血小板单核细胞淋巴细胞粒细胞红细胞三、三、T T、B B细胞和细胞和T T细胞亚群细胞亚群的分离的分离 磁性微球分离法磁性微球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪分离法 大鼠：1.CD4+C
10、D25+调节性T细胞等渗；E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）优选第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt缺点：不适用于细胞表面分子不清的细胞分离，试剂和仪器昂贵组织中分离出来（regulatory T cell,Tr or Treg）大鼠：1.SmIg：膜表面免疫球蛋白CD40（成熟B细胞）CD22 和CD23CD3+CD4CD8+细胞毒性T细胞单核细胞 DC B细胞 T细胞与血浆和分离细胞不相溶；（连续密度梯度离心）份6%聚蔗糖蒸馏水溶液三、T、B细胞和T细胞亚群的分离人：1.利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，37温箱静置1
11、h，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。1.磁性微球分离法磁性微球分离法磁性微球：金属小颗粒（磁性微球：金属小颗粒（FeFe2 2o o3 3,Fe,Fe3 3o o4 4)，其表面包裹有高，其表面包裹有高分子材料（聚苯乙烯，聚氯乙烯等），表面有活性基团分子材料（聚苯乙烯，聚氯乙烯等），表面有活性基团（氨基、羧基和羟基），可结合生物大分子物质（抗原，（氨基、羧基和羟基），可结合生物大分子物质（抗原，抗体，核酸等）。抗体，核酸等）。免疫磁珠：微球表面包被有免疫物质称免疫磁珠。免疫磁珠：微球表面包被有免疫物质称免疫磁珠。流式细胞分析仪流式细胞分析仪2.荧光激活细胞分离仪分离
12、法荧光激活细胞分离仪分离法 E E花环沉降法花环沉降法 尼龙毛柱分离法尼龙毛柱分离法 T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离1.E1.E花环沉降法（花环沉降法（E E受体受体/CD2/CD2与绵羊红细胞结合）与绵羊红细胞结合）B B 细胞细胞T T 细胞细胞FicollFicoll液离心液离心溶解红细胞溶解红细胞T T细胞细胞B B细胞细胞2.2.尼龙毛柱分离法尼龙毛柱分离法此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，T细胞纯度可达细胞纯度可达90%以上。以上。四、不同细胞分离方法的综合评价四、不同细胞分离方法的综合评价早期早期细胞
13、物理属性细胞物理属性细胞生物属性细胞生物属性分辨率和灵敏度不高分辨率和灵敏度不高现在（根据细胞表面标志）现在（根据细胞表面标志）免疫磁珠免疫磁珠流式细胞仪流式细胞仪分辨率和灵敏度高分辨率和灵敏度高缺点：不适用于细胞表面分子不清的细胞分离，试剂和仪器昂贵缺点：不适用于细胞表面分子不清的细胞分离，试剂和仪器昂贵五、分离细胞的保存和活力检测五、分离细胞的保存和活力检测1.1.分离细胞的保存分离细胞的保存 对保存液的要求等渗，具对保存液的要求等渗，具pH pH 缓冲作用，缓冲作用，并对细胞无毒性（并对细胞无毒性（HanksHanks、Tc199Tc199、RPMI RPMI 1640 1640）。如需
14、短期保存，置）。如需短期保存，置44放置较好，放置较好，可减低细胞代谢活动。如需长期保存，应可减低细胞代谢活动。如需长期保存，应放入液氮罐中在深低温放入液氮罐中在深低温(196)(196)条件下保存条件下保存细胞。细胞。2.2.细胞活力测定细胞活力测定 细胞活力常用活细胞占总细胞的百分比表示，细胞活力常用活细胞占总细胞的百分比表示，细胞活力的测定常用的简便方法是台盼蓝细胞活力的测定常用的简便方法是台盼蓝(trypan(trypan blue)blue)染色法。死细胞着色，染成蓝色；活细胞拒染色法。死细胞着色，染成蓝色；活细胞拒染。染。用血细胞计数器在显微镜下观察到着色和不着用血细胞计数器在显微
15、镜下观察到着色和不着色的细胞，计数色的细胞，计数200 200 个细胞，以不着色细胞的百分个细胞，以不着色细胞的百分率即代表细胞的活力。率即代表细胞的活力。一、T细胞表面标志的检测细胞表面标志的检测二、B细胞表面标志的检测细胞表面标志的检测四、细胞表面标志检测的意义四、细胞表面标志检测的意义 三、自然杀伤细胞表面标志的检测三、自然杀伤细胞表面标志的检测 第二节第二节 淋巴细胞标志及亚群分类淋巴细胞标志及亚群分类一、一、T T细胞表面标志及其亚群细胞表面标志及其亚群 CD3+CD4+CD8辅助性辅助性T细胞细胞 （help T cell,Th）CD3+CD4CD8+细胞毒性细胞毒性T细胞细胞 （
16、cytotoxic T cell,Tc or CTL）CD4+CD25+调节性调节性T细胞细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg）不同细胞生物学特性不同001的介质，细胞与介质混合后离心，比重比介质大的红细胞和多核细胞沉降在下层，而PBMC位于 Ficoll分离液上层。一、T细胞表面标志及其亚群荧光激活细胞分离仪分离法一、T细胞表面标志的检测对分离介质的要求：对细胞无毒；等渗；采用预先形成的密度梯度，分离的细胞轻轻叠加到液面上Percoll 液经离心后可形成一个从管底到液面逐渐递减的连续的密度梯度，不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带，从而将密度不等的细胞分离纯化
17、。090，红细胞和多核细胞分别为1.单核细胞 DC B细胞 T细胞一、外周血单个核细胞分离不同细胞表面分化抗原不同检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定组织中分离出来001的分层液可分离人外周血单个核细胞此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，T细胞纯度可达90%以上。优选第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt淋巴细胞占；与血浆和分离细胞不相溶；如需短期保存，置4放置较好，可减低细胞代谢活动。大鼠：1.二、二、B B细胞表面标志细胞表面标志 SmIgSmIg、FcFc受体、补体受体、受体、补体受体、EBEB病毒受体，部分病毒受体，部分CDCD分子是分子是B B细胞的重要表面标志
18、，其中以细胞的重要表面标志，其中以SmIgSmIg为为B B细胞所特有，是鉴定细胞所特有，是鉴定B B细胞可靠的指标。细胞可靠的指标。CD19/CD5CD19/CD5分子可将分子可将B B细胞区分为细胞区分为B1B1细胞和细胞和B2B2细细胞，胞，B1B1细胞为细胞为CD19CD19和和CD5CD5双阳性，而双阳性，而B2B2细胞仅细胞仅为为CD19CD19阳性，阳性，B2B2细胞为通常所指的细胞为通常所指的B B细胞。细胞。CD19CD19+CD5CD5-:B2:B2细胞细胞SmIgSmIg：膜表面免疫球蛋白：膜表面免疫球蛋白CD19CD19（B B细胞的标志）细胞的标志）CD21 CD21
19、 CD32(FcR)CD32(FcR)CD35CD35（C3b/C4bC3b/C4b受体）受体）CD40CD40（成熟（成熟B B细胞）细胞）CD80/86CD80/86（活化的（活化的B B细胞）细胞）CD19CD19+CD5CD5+:B1:B1细胞细胞CD22 和CD23 二、二、B B细胞表面标志细胞表面标志 三、三、NKNK细胞表面标志细胞表面标志 人类人类NKNK细胞表面标志主要以细胞表面标志主要以CD16CD16、CD56CD56来认定，临床上将来认定，临床上将CD3CD56+CD16+CD3CD56+CD16+淋巴细胞认定为淋巴细胞认定为NKNK细胞。细胞。一、外周血单个核细胞分
20、离CD19（B细胞的标志）一、T细胞表面标志的检测E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）一、T细胞表面标志及其亚群一、T细胞表面标志及其亚群淋巴细胞占；CD3+CD4+CD8辅助性T细胞份6%聚蔗糖蒸馏水溶液CD3+CD4+CD8辅助性T细胞优选第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt对分离介质的要求：对细胞无毒；与血浆和分离细胞不相溶；利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，37温箱静置1 h，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，37温箱静置1 h，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。四、细胞表面标志检测的意义CD40（成熟B细胞）对分离介质的要求：对细胞无毒；淋巴细胞表面标志检测的临床意义淋巴细胞表面标志检测的临床意义 淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。能的重要指标。对对CD4+CD4+和和CD8+TCD8+T细胞的测定，有助于免细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。排斥反应的监测。
