1、 目的目的:提高检出率提高检出率,减少漏检以及误判的发减少漏检以及误判的发生生 手段手段:检测人员是否有足够的责任心检测人员是否有足够的责任心?检测试剂准备是否齐全且符合要求检测试剂准备是否齐全且符合要求?是否严格按照检测流程进行操作是否严格按照检测流程进行操作?霍乱是由霍乱是由0101群和群和01390139群群霍乱弧菌（霍乱弧菌（V Vcholeraecholerae）引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波及范围广、危害严重的及范围广、危害严重的甲类传染病。甲类传染病。古典生物型古典生物型 小川型小川型 Ogawa(AB)O1群群 稻叶型稻
2、叶型 Inaba(AC)埃尔托生物型埃尔托生物型 彦岛型彦岛型 Hikojim(ABC)霍乱弧菌霍乱弧菌 霍乱病原菌霍乱病原菌 O139群（群（Bengal）非非O1群群 O2-O200群群 腹泻病原菌腹泻病原菌 O1O1群，群，O139O139群霍乱弧菌群霍乱弧菌 剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡 不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到20205050（重症病人达（重症病人达7070100100）pH:7.4-9.6pH:7.4-9.6快速生快速生长长 WS 289-2008 WS 28
3、9-2008 霍乱诊断标准霍乱诊断标准 霍乱防治手册（霍乱防治手册（19991999年第五版）年第五版）病例：粪便、肛拭子、呕吐物病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前未使用抗生素之前 “健康健康”人：粪便、肛拭子人：粪便、肛拭子 其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品 监测：水样，水产品等监测：水样，水产品等一般要求在一般要求在3 3小时内小时内室温（室温（20-25 ）条件下）条件下送达实验室检测送达实验室检测 C-BC-B运输培养基（运输培养基（pH8.4pH8.4）;（或文腊二氏保存液）（或文腊二氏保存液）碱性蛋白胨水碱性蛋白胨水（pH8
4、.4-9.2）：不是最佳的，尤其：不是最佳的，尤其6 6小时内还不能进小时内还不能进行培养时，尽量采用行培养时，尽量采用 C-BC-B运输培养基。运输培养基。以采集病人自然排除的新鲜粪便为主，水样便采取以采集病人自然排除的新鲜粪便为主，水样便采取1 13mL3mL，成形便采取，成形便采取指甲大小的粪量，亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内指甲大小的粪量，亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3 35cm5cm处处采取，采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水（采取，采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水（8.8.-9.2-9.2），），同时划线分离选择性培养基（庆大四号平板），如不能在同时
5、划线分离选择性培养基（庆大四号平板），如不能在小时内送达实验室检测的样品，应插入小时内送达实验室检测的样品，应插入Cary-BlairCary-Blair二氏半固体保存培养二氏半固体保存培养基（或文腊二氏保存液）中送检。标本与保存液比例约为基（或文腊二氏保存液）中送检。标本与保存液比例约为1515。碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择性平板（庆大四号平板，第一板）。性平板（庆大四号平板，第一板）。碱性蛋白胨水在碱性蛋白胨水在 增菌小时，沾取菌膜下表层液体，增菌小时，沾取菌膜下表层液体，划线分离选择性平板（庆大四号平板，第二板），同时吸划线分离选择
6、性平板（庆大四号平板，第二板），同时吸取取0.10.10.2 ml0.2 ml表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。碱性蛋白胨水增菌小时后划线分离选择性平板（庆大四号碱性蛋白胨水增菌小时后划线分离选择性平板（庆大四号平板，第三板）。平板，第三板）。水体的采集一般用无菌的水体的采集一般用无菌的500ml500ml水样瓶采集相对静止的表层水水样瓶采集相对静止的表层水(深度为深度为 30cm30cm以内以内)500ml)500ml，密封加盖后于室温（，密封加盖后于室温（20-25 20-25 ）3 3小时内送达实验室小时内送达实验室检测。检测。取取450ml
7、450ml水样，用水样，用1M 1M 氢氧化钠调整至氢氧化钠调整至pH 8.4-9.2pH 8.4-9.2。然后加。然后加1010倍浓缩碱性倍浓缩碱性胨水胨水50ml50ml。再加入。再加入1%1%亚碲酸钾亚碲酸钾0.250.250.5 ml0.5 ml和和10001000单位单位/ml/ml青霉素青霉素1 ml1 ml。3737培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大四号培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大四号平板）分离培养，同时吸平板）分离培养，同时吸0.10.10.2 ml0.2 ml表层培养物转种于碱性胨表层培养物转种于碱性胨水管中作二次增菌，水管中作二次增菌，
8、3737培养培养6 68h8h再划线接种于选择性培养基（庆大再划线接种于选择性培养基（庆大四号平板）。四号平板）。深圳生科源生物技术有限公司5去氧胆酸钠水溶液培养基的配备与质量控制（是否新鲜，含量、PH值、保存条件是否达标，分离平板、血清、生化鉴定等检测试剂质量是否满足要求，是否在有效期内使用等）不同样品的病原分离流程及技术要点30cm以内)500ml，密封加盖后于室温（20-25 ）3小时内送达实验室检测。荧光PCR检测1盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液O1群和O139群霍乱弧菌的检验程序国内商品化的霍乱检测血清庆大霉素、4号、TCBS琼脂庆大霉素平板和4号琼脂：多呈半透明状，
9、菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。不同样品的病原分离流程及技术要点水体分离流程及技术要点取450ml水样，用1M 氢氧化钠调整至pH 8.第二管碱性蛋白胨水增菌小时后划线分离选择性平板（庆大四号平板，第三板）。生物安全与个人防护（生物安全2级实验室操作，做好个人防护，整个培养流程产生的实验培养废弃物和均应进行高压灭菌消毒）生物安全与个人防护（生物安全2级实验室操作，做好个人防护，整个培养流程产生的实验培养废弃物和均应进行高压灭菌消毒）粪便分离流程及技术要点针对原始样品（如病人粪便）以及初始增菌后的菌液进行快速检测水产品，食品等通常选取活的或
10、者新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑冰冻的水生通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑冰冻的水生动物，有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置动物，有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置涂抹采集：涂抹采集：使用无菌棉签涂抹使用无菌棉签涂抹5 5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔，直接接种到只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔，直接接种到20ml20ml碱性蛋白胨水作为增菌液处理。碱性蛋白胨水作为增菌液处理。整体或局部采集：整体或局部采集：在实验室应以无菌操作将其解剖，取鳃部和肠内容物在实验室应以无菌操作将其解剖，取鳃部和肠内容物2525克剪碎后，置
11、灭菌均克剪碎后，置灭菌均质杯或均质袋中，加入质杯或均质袋中，加入225mL225mL倍体积的碱性蛋白胨水增菌；但小贝壳类动物，倍体积的碱性蛋白胨水增菌；但小贝壳类动物，则用锤子将外壳击碎，整体放入则用锤子将外壳击碎，整体放入100ml100ml三角瓶中，加入三角瓶中，加入5-105-10倍的碱性蛋白胨倍的碱性蛋白胨水增菌；甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分水增菌；甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分(包括鳃、肠、足、表层外包括鳃、肠、足、表层外壳等壳等)整体放入整体放入100ml100ml三角瓶中，加入三角瓶中，加入5-105-10倍的碱性蛋白胨水增菌。倍的碱性蛋白胨水增菌。接种后的接种后的碱性
12、蛋白胨水碱性蛋白胨水3737培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大四号平板）同时吸基（庆大四号平板）同时吸0.10.10.2 ml0.2 ml表层培养物转种于表层培养物转种于10ml10ml碱性胨水管中作二次增菌，碱性胨水管中作二次增菌，3737培养培养6 68h8h再划线接种于选择性培养基再划线接种于选择性培养基（庆大四号平板）。（庆大四号平板）。可疑阳性结果的及时规范上送（当出现可疑阳性菌株时，要第一时间进行分纯并进一步对分纯物进行血清学确认，应上送分纯后的培养物而不是初始平板！分离培养要点（十倍浓缩碱胨水增菌培养法）：可疑阳性结果的及
13、时规范上送（当出现可疑阳性菌株时，要第一时间进行分纯并进一步对分纯物进行血清学确认，应上送分纯后的培养物而不是初始平板！监测：水样，水产品等2）：不是最佳的，尤其6小时内还不能进行培养时，尽量采用 C-B运输培养基。检测人员是否有足够的责任心?病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前但小贝壳类动物，则用锤子将外壳击碎，整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌；可疑阳性结果的及时规范上送（当出现可疑阳性菌株时，要第一时间进行分纯并进一步对分纯物进行血清学确认，应上送分纯后的培养物而不是初始平板！接种后的碱性蛋白胨水37培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大四号
14、平板）同时吸0.C-B运输培养基（pH8.荧光PCR检测霍乱弧菌不同样品的病原分离流程及技术要点5 ml和1000单位/ml青霉素1 ml。古典生物型 小川型 Ogawa(AB)赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（+）针对原始样品（如病人粪便）以及初始增菌后的菌液进行快速检测检测工作中应关注的事项 （TCBSTCBS平板生长的菌落不能直挑取进行平板生长的菌落不能直挑取进行 O1群和O139群抗原构造与血清分型 型型 别别 群特异性抗原群特异性抗原型特异性抗原型特异性抗原AO139BC 小川小川+少量少量 稻叶稻叶+彦岛彦岛+O139 +国内商品化的霍乱检测血清国内商品化的霍乱检测血清 国外血清：日本生研，泰
15、国国外血清：日本生研，泰国S&A血清等血清等氧化酶试验氧化酶试验1 1盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液二甲基对苯二胺水溶液 粘丝试验粘丝试验0.50.5去氧胆酸钠水去氧胆酸钠水溶液溶液 发酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、产酸不产气 能分解色氨酸 赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（+）精氨酸双水解酶（-）针对原始样品（如病人粪便）以及初始增菌针对原始样品（如病人粪便）以及初始增菌后的菌液进行快速检测后的菌液进行快速检测 O1O1群霍乱胶体金标记快诊卡群霍乱胶体金标记快诊卡 O139O139群霍乱胶体金标记快诊卡群霍乱胶体金标记快诊卡 荧光荧光PCRPCR快速检测试剂盒快速检测
16、试剂盒 O1O1群、群、O139O139群双色荧光检测试剂盒群双色荧光检测试剂盒 霍乱霍乱CTXCTX毒力基因荧光检测试剂盒毒力基因荧光检测试剂盒注：快速检测并不能替代常规检测的进行，只注：快速检测并不能替代常规检测的进行，只是作为辅助检测的一种手段是作为辅助检测的一种手段霍乱快速检测技术的应用霍乱快速检测技术的应用 荧光荧光PCRPCR检测霍乱弧菌检测霍乱弧菌病例标本检测环境和食品调查的初筛方法O1O1群、群、O139O139群双色荧光检测试剂盒群双色荧光检测试剂盒 深圳生科源生物技术有限公司深圳生科源生物技术有限公司O1群和O139群霍乱弧菌的检验程序鉴定分型确诊报告胶体金、荧光PCR快速
17、诊断增菌培养（碱胨水）分离培养庆大霉素、4号、TCBS琼脂标本（粪便等）玻片凝集阳性（结合菌落、菌体形态）凝集菌落或可疑菌落纯培养（营养琼脂或克氏双糖培养）第二次增菌（碱胨水）初步报告10-20小时6-8小时10-20小时直接生物安全与个人防护（生物安全生物安全与个人防护（生物安全2 2级实验室操作，做好个人防护，整个培养流级实验室操作，做好个人防护，整个培养流程产生的实验培养废弃物和均应进行高压灭菌消毒）程产生的实验培养废弃物和均应进行高压灭菌消毒）培养基的配备与质量控制（是否新鲜，含量、培养基的配备与质量控制（是否新鲜，含量、PHPH值、保存条件是否达标，分值、保存条件是否达标，分离平板、
18、血清、生化鉴定等检测试剂质量是否满足要求，是否在有效期内使离平板、血清、生化鉴定等检测试剂质量是否满足要求，是否在有效期内使用等）用等）可疑阳性结果的及时规范上送（当出现可疑阳性菌株时，要第一时间进行分可疑阳性结果的及时规范上送（当出现可疑阳性菌株时，要第一时间进行分纯并进一步对分纯物进行血清学确认，应上送分纯后的培养物而不是初始平纯并进一步对分纯物进行血清学确认，应上送分纯后的培养物而不是初始平板！）板！）做好样品的相关登记记录。做好样品的相关登记记录。板分离一个样品（严禁一个平板分离2份或以上样品！O1群和O139群抗原构造与血清分型30cm以内)500ml，密封加盖后于室温（20-25
19、）3小时内送达实验室检测。注：快速检测并不能替代常规检测的进行，只是作为辅助检测的一种手段生物安全与个人防护（生物安全2级实验室操作，做好个人防护，整个培养流程产生的实验培养废弃物和均应进行高压灭菌消毒）5 ml和1000单位/ml青霉素1 ml。通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑冰冻的水生动物，有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置霍乱快速检测技术的应用但小贝壳类动物，则用锤子将外壳击碎，整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌；C-B运输培养基（pH8.甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分(包括鳃、肠、足、表层外壳等)整体放入100ml
20、三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌。进一步分型鉴定(省CDC进行)霍乱防治手册（1999年第五版）O1群、O139群双色荧光检测试剂盒不同样品的病原分离流程及技术要点2），同时划线分离选择性培养基（庆大四号平板），如不能在小时内送达实验室检测的样品，应插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基（或文腊二氏保存液）中送检。整体或局部采集：挑取粪便，直接接种于碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择性平板（庆大四号平板，第一板）。第一管碱性蛋白胨水在 增菌小时，沾取菌膜下表层液体，划线分离选择性平板（庆大四号平板，第二板），同时吸取0.分离培养（两管两板法）：是否严格按照检测流程进行操
21、作?病例：粪便、肛拭子、呕吐物病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前未使用抗生素之前 “健康健康”人：粪便、肛拭子人：粪便、肛拭子 其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品 监测：水样，水产品等监测：水样，水产品等一般要求在一般要求在3 3小时内小时内室温（室温（20-25 ）条件下）条件下送达实验室检测送达实验室检测 C-BC-B运输培养基（运输培养基（pH8.4pH8.4）;（或文腊二氏保存液）（或文腊二氏保存液）碱性蛋白胨水碱性蛋白胨水（pH8.4-9.2）：不是最佳的，尤其：不是最佳的，尤其6 6小时内还不能进小时内还不能进行培养时，尽量采
22、用行培养时，尽量采用 C-BC-B运输培养基。运输培养基。通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑冰冻的水生通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑冰冻的水生动物，有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置动物，有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置涂抹采集：涂抹采集：使用无菌棉签涂抹使用无菌棉签涂抹5 5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔，直接接种到只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔，直接接种到20ml20ml碱性蛋白胨水作为增菌液处理。碱性蛋白胨水作为增菌液处理。整体或局部采集：整体或局部采集：在实验室应以无菌操作将其解剖，取鳃部和肠
23、内容物在实验室应以无菌操作将其解剖，取鳃部和肠内容物2525克剪碎后，置灭菌均克剪碎后，置灭菌均质杯或均质袋中，加入质杯或均质袋中，加入225mL225mL倍体积的碱性蛋白胨水增菌；但小贝壳类动物，倍体积的碱性蛋白胨水增菌；但小贝壳类动物，则用锤子将外壳击碎，整体放入则用锤子将外壳击碎，整体放入100ml100ml三角瓶中，加入三角瓶中，加入5-105-10倍的碱性蛋白胨倍的碱性蛋白胨水增菌；甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分水增菌；甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分(包括鳃、肠、足、表层外包括鳃、肠、足、表层外壳等壳等)整体放入整体放入100ml100ml三角瓶中，加入三角瓶中，加入5-10
24、5-10倍的碱性蛋白胨水增菌。倍的碱性蛋白胨水增菌。接种后的接种后的碱性蛋白胨水碱性蛋白胨水3737培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大四号平板）同时吸基（庆大四号平板）同时吸0.10.10.2 ml0.2 ml表层培养物转种于表层培养物转种于10ml10ml碱性胨水管中作二次增菌，碱性胨水管中作二次增菌，3737培养培养6 68h8h再划线接种于选择性培养基再划线接种于选择性培养基（庆大四号平板）。（庆大四号平板）。O1群和O139群抗原构造与血清分型 型型 别别 群特异性抗原群特异性抗原型特异性抗原型特异性抗原AO139BC 小川小川
25、+少量少量 稻叶稻叶+彦岛彦岛+O139 +氧化酶试验氧化酶试验1 1盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液二甲基对苯二胺水溶液 粘丝试验粘丝试验0.50.5去氧胆酸钠水去氧胆酸钠水溶液溶液 生理盐水不凝集，O139群血清明显凝集的菌落，一般为O139群，但其与O22群及O155群甚至一些非霍乱弧菌会出现交叉凝集，由上级实验室进行进一步确认。第一管碱性蛋白胨水在 增菌小时，沾取菌膜下表层液体，划线分离选择性平板（庆大四号平板，第二板），同时吸取0.蔗糖、产酸不产气不同样品的病原分离流程及技术要点剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡2）：不是最佳
26、的，尤其6小时内还不能进行培养时，尽量采用 C-B运输培养基。荧光PCR快速检测试剂盒不同样品的病原分离流程及技术要点不同样品的病原分离流程及技术要点针对原始样品（如病人粪便）以及初始增菌后的菌液进行快速检测水产品，食品等霍乱弧菌生化鉴定管（11种生化,套装，环凯）；可疑阳性结果的及时规范上送（当出现可疑阳性菌株时，要第一时间进行分纯并进一步对分纯物进行血清学确认，应上送分纯后的培养物而不是初始平板！霍乱防治手册（1999年第五版）霍乱弧菌 霍乱病原菌接种后的碱性蛋白胨水37培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大四号平板）同时吸0.O1群、O139群双色荧光检测试剂盒非O1群分离培
27、养（两管两板法）：PFGE脉冲场分型进一步分型鉴定(省CDC进行)使用无菌棉签涂抹5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔，直接接种到20ml碱性蛋白胨水作为增菌液处理。甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分(包括鳃、肠、足、表层外壳等)整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌。营养要求不高，兼性厌氧，37生长，怕酸嗜碱，pH:7.剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡进一步分型鉴定(省CDC进行)庆大霉素平板和4号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。不同样品的病原分离流程及技术要点O1群、O13
28、9群双色荧光检测试剂盒生化鉴定条：梅里埃API 20E鉴定条等2）：不是最佳的，尤其6小时内还不能进行培养时，尽量采用 C-B运输培养基。做好样品的相关登记记录。霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌（Vcholerae）引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波及范围广、危害严重的甲类传染病。整体或局部采集：C-B运输培养基（pH8.病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前TCBS（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐。荧光PCR检测霍乱弧菌板分离一个样品（严禁一个平板分离2份或以上样品！挑取粪便，直接接种于碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分
29、离选择性平板（庆大四号平板，第一板）。板分离一个样品（严禁一个平板分离2份或以上样品！O1群、O139群双色荧光检测试剂盒检测工作中应关注的事项生化鉴定条：梅里埃API 20E鉴定条等水产品分离流程及技术要点霍乱弧菌生化鉴定管（11种生化,套装，环凯）；第一管碱性蛋白胨水在 增菌小时，沾取菌膜下表层液体，划线分离选择性平板（庆大四号平板，第二板），同时吸取0.C-B运输培养基（pH8.非O1群甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分(包括鳃、肠、足、表层外壳等)整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌。样品的采集和运输分离培养（两管两板法）：甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分(包
30、括鳃、肠、足、表层外壳等)整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌。粪便的采集与保存运送不同样品的病原分离流程及技术要点分离培养要点（十倍浓缩碱胨水增菌培养法）：监测：水样，水产品等不同样品的病原分离流程及技术要点但小贝壳类动物，则用锤子将外壳击碎，整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌；做好样品的相关登记记录。30cm以内)500ml，密封加盖后于室温（20-25 ）3小时内送达实验室检测。病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前样品平板分离时应进行分区划线分离，平板分离的单个菌落数量应该达到通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑
31、冰冻的水生动物，有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置标本与保存液比例约为1 5。监测：水样，水产品等培养基的配备与质量控制（是否新鲜，含量、PH值、保存条件是否达标，分离平板、血清、生化鉴定等检测试剂质量是否满足要求，是否在有效期内使用等）一般要求在3小时内室温（20-25 ）条件下送达实验室检测荧光PCR快速检测试剂盒荧光PCR检测霍乱弧菌4）;（或文腊二氏保存液）生化鉴定条：梅里埃API 20E鉴定条等2 ml表层培养物转种于10ml碱性胨水管中作二次增菌，37培养68h再划线接种于选择性培养基（庆大四号平板）。O1群、O139群双色荧光检测试剂盒板分离一个样品（严禁一个
32、平板分离2份或以上样品！37培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大四号平板）分离培养，同时吸0.针对原始样品（如病人粪便）以及初始增菌后的菌液进行快速检测挑取粪便，直接接种于碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择性平板（庆大四号平板，第一板）。其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品以采集病人自然排除的新鲜粪便为主，水样便采取13mL，成形便采取指甲大小的粪量，亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内35cm处采取，采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水（8.样品的采集和运输O1群 稻叶型 Inaba(AC)分离培养要点（十倍浓缩碱胨水增菌培养法）：5去氧胆酸钠水溶液营养要求不
33、高，兼性厌氧，37生长，怕酸嗜碱，pH:7.水产品分离流程及技术要点做好样品的相关登记记录。整体或局部采集：使用无菌棉签涂抹5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔，直接接种到20ml碱性蛋白胨水作为增菌液处理。使用无菌棉签涂抹5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔，直接接种到20ml碱性蛋白胨水作为增菌液处理。O1群、O139群双色荧光检测试剂盒2）：不是最佳的，尤其6小时内还不能进行培养时，尽量采用 C-B运输培养基。4）;（或文腊二氏保存液）检测工作中应关注的事项不同样品的病原分离流程及技术要点1盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液O1群、O139群双色荧光检测试剂盒水体的采集与保存
34、运送不同样品的病原分离流程及技术要点2），同时划线分离选择性培养基（庆大四号平板），如不能在小时内送达实验室检测的样品，应插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基（或文腊二氏保存液）中送检。1盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液以采集病人自然排除的新鲜粪便为主，水样便采取13mL，成形便采取指甲大小的粪量，亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内35cm处采取，采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水（8.霍乱弧菌胶体金免疫层析检测全自动生化检测仪检测：梅里埃VITEK2 COMP 全自动生化鉴定卡等 C-B运输培养基（pH8.但小贝壳类动物，则用锤子将外壳击碎，整体放入100ml
35、三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌；检测工作中应关注的事项1盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液2）：不是最佳的，尤其6小时内还不能进行培养时，尽量采用 C-B运输培养基。PFGE脉冲场分型50个以上。但小贝壳类动物，则用锤子将外壳击碎，整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌；1盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液霍乱快速检测技术的应用平板分离及可疑菌落挑取但小贝壳类动物，则用锤子将外壳击碎，整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌；O1群和O139群霍乱弧菌的检验程序30cm以内)500ml，密封加盖后于室温（20-25
36、）3小时内送达实验室检测。2）：不是最佳的，尤其6小时内还不能进行培养时，尽量采用 C-B运输培养基。生物安全与个人防护（生物安全生物安全与个人防护（生物安全2 2级实验室操作，做好个人防护，整个培养流级实验室操作，做好个人防护，整个培养流程产生的实验培养废弃物和均应进行高压灭菌消毒）程产生的实验培养废弃物和均应进行高压灭菌消毒）培养基的配备与质量控制（是否新鲜，含量、培养基的配备与质量控制（是否新鲜，含量、PHPH值、保存条件是否达标，分值、保存条件是否达标，分离平板、血清、生化鉴定等检测试剂质量是否满足要求，是否在有效期内使离平板、血清、生化鉴定等检测试剂质量是否满足要求，是否在有效期内使用等）用等）可疑阳性结果的及时规范上送（当出现可疑阳性菌株时，要第一时间进行分可疑阳性结果的及时规范上送（当出现可疑阳性菌株时，要第一时间进行分纯并进一步对分纯物进行血清学确认，应上送分纯后的培养物而不是初始平纯并进一步对分纯物进行血清学确认，应上送分纯后的培养物而不是初始平板！）板！）做好样品的相关登记记录。做好样品的相关登记记录。
