1、第七章第七章 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)DNADNA的的复制复制 (replication)(replication)由亲代由亲代DNADNA合成两个相同的子代合成两个相同的子代 DNADNA的过的过程。程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA 一、一、PCR的基本原理的基本原理A AG GA AA AC CT TT TT TC CT TT TG GA AA AA AG GA AA AC CT TT TT TC CT TT TG GA AA AT TC CT TT TG GA AA AA AG GA AA AC CT TT T母代母代
2、DNADNA子代子代DNADNA基本原理：基本原理：在模板、引物、在模板、引物、4种种dNTP和赖热和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的于两段已知序列之间的DNA区段的酶促区段的酶促合成反应。合成反应。基本步骤：基本步骤：变性：加热使双链变性：加热使双链DNA变为单链变为单链 退火：降温使引物和互补模板在局部退火：降温使引物和互补模板在局部 形成杂交链形成杂交链 延伸：耐热延伸：耐热DNA聚合酶按聚合酶按53方向方向催化以引物为起始点的延伸反应催化以引物为起始点的延伸反应一、一、PCR的基本原理的基本原理 示意图示意图二、二、PCR引物设
3、计引物设计PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。计。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。PCR反应中有两条引物，即反应中有两条引物，即5引物和引物和3引物。设计引物引物。设计引物时，通常以信息链为基准，时，通常以信息链为基准，5引物与位于待扩增片段引物与位于待扩增片段5上游的一小段上游的一小段DNA序列相同，以信息链的互补
4、链为模序列相同，以信息链的互补链为模板，引导信息链的合成，板，引导信息链的合成，3引物与扩增片段引物与扩增片段3端的一小端的一小段段DNA序列互补，引导互补链的合成。序列互补，引导互补链的合成。PCR反应扩增反应扩增的就是这一对引物之间的的就是这一对引物之间的DNA片段。片段。（一）（一）PCR引物设计原则引物设计原则1、引物长度一般为、引物长度一般为1530个核苷酸。个核苷酸。引物过短会使引物过短会使PCR的特异性的特异性降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度聚合酶的最适温度74,亦会影响产物的生成，且合成
5、引物的成本亦会影响产物的生成，且合成引物的成本增加。增加。2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。现象。尤其是引物的尤其是引物的3端不应有连续端不应有连续3个个G和和C。否则会使。否则会使 引物在引物在模板的模板的G+C富集序列区错误配对。引物中富集序列区错误配对。引物中G+C的含量的含量 在在4555%左右。设计引物时要考虑左右。设计引物时要考虑3端和端和5端端 引物具有相似的引物具有相似的Tm值。值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于）。引物长度要确保解链温度不低于54C3、引物自身内部
6、不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。按按经验，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过经验，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。4、两个引物之间不应存在互补序列、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免，尤其应避免3端的互补重叠。端的互补重叠。5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物尤其是引物3末端末端连续连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。非特异性扩增。6、引物、引物3端碱基是引发延伸的起点，
7、因此一定要与模板端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。配对。引物引物3端的最佳碱基选择是端的最佳碱基选择是G和和C。因为它们形成的碱基配对比较。因为它们形成的碱基配对比较稳定。稳定。7、引物的、引物的5端可以修饰，端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子，物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在终止密码子等。在PCR的起始反应中，引物的起始反应中，引物5端游离的碱基并不端游离的碱基并不影响引导新生链影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环
8、中，这些合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以如此产物的双链中去，所以如此引物参与的引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。苷酸序列。（二）引物设计的方法（二）引物设计的方法现在现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，列到特定网页，(在线引物设计的网站有：在线引物设计的网站有：http:/cbr-rbc.nrc-cnrc.ca/cgi-bin/primer3ww
9、w.cgi;http:/genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/SGD/web-primer;http:/bioinformatics.weizmann.ac.il/cgi-bin/primer/primer3.cgi;http:/itsa.ucsf.edu/urolab/methprimer/index1.html;http:/alces.med.umn.edu/rawprimer.html)得到设计好的引物，也可得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。软件的引物设计功能主以在本地计算机上运行引物设计专业软件。软件的引物设计功能主要体现在两个方面
10、：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最为优秀；其次是引物的自动最为优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。也不尽相同。三、模板制备三、模板制备 PCR的模板可以是的模板可以是DNA，也可以是，也可以是RNA。当用当用RNA作模板时，首先作模板时，首先要进行逆转录生成要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正常的，然后再进行正常的PCR循环。大多数用途的循环。大多
11、数用途的PCR反应中，反应中，对对DNA模板的要求并不严格。模板的要求并不严格。首先对纯度要求不严。大量首先对纯度要求不严。大量的实验数据表明存在一定量的蛋白质，或的实验数据表明存在一定量的蛋白质，或SDS等对实验过程影响不大，所等对实验过程影响不大，所以只要没有交叉污染，模板以只要没有交叉污染，模板DNA的制备可以不必像克隆、酶切、连接、的制备可以不必像克隆、酶切、连接、标记等反应所用标记等反应所用DNA制备那样严格。其次，模板用量很低，理论上制备那样严格。其次，模板用量很低，理论上102104拷贝的模板是可满足各种要求的拷贝的模板是可满足各种要求的PCR反应。由于种种原因，准备反应。由于种
12、种原因，准备的模板量要求达一定水平。一方面可减少由于实验操作和实验精确度方面的模板量要求达一定水平。一方面可减少由于实验操作和实验精确度方面等原因而引起的扩增失败，同时用作扩增的模板等原因而引起的扩增失败，同时用作扩增的模板DNA量越多，由于交叉量越多，由于交叉污染引起的反应失败的可能性小。污染引起的反应失败的可能性小。（一）（一）DNA模板制备模板制备去垢剂破坏细胞，除杂质，乙醇沉淀核酸去垢剂破坏细胞，除杂质，乙醇沉淀核酸水煮沸溶解细胞水煮沸溶解细胞要求并不严格要求并不严格模板用量低，哺乳动物基因组模板用量低，哺乳动物基因组DNA1g，质，质粒粒DNA0.1ng(二二)RNA模板的制备模板的
13、制备RNA提取试剂盒提取试剂盒酸性硫氰酸胍酸性硫氰酸胍-酚酚-氯仿法氯仿法异硫胍氯化铯密度梯度分离法异硫胍氯化铯密度梯度分离法SDS-酚酚-氯仿法氯仿法注意防止注意防止RNA水解水解（三）模板的取材三）模板的取材病原体标本：病毒、细菌、真菌、螺旋体、病原体标本：病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等立克次体、支原体等病理生理标本：细胞、血液、绒毛、尿液病理生理标本：细胞、血液、绒毛、尿液等等法医学标本：血斑、精斑、毛发法医学标本：血斑、精斑、毛发考古标本考古标本四、四、PCR基本反应基本反应（一）以（一）以DNA为模板的反应为模板的反应反应体积：反应体积：50100l缓冲液缓冲液引物引物
14、底物：底物：4种种dNTP模板：模板：102105拷贝拷贝TaqDNA聚合酶聚合酶矿物油矿物油其中模板其中模板DNA的用量必须根据其分子量的大小加以调的用量必须根据其分子量的大小加以调整。整。（二）以（二）以mRNA为模板的反应为模板的反应以以mRNA为原始模板进行的为原始模板进行的PCR反应称为逆转录反应称为逆转录PCR一）逆转录反应体系一）逆转录反应体系体积：体积：20 l缓冲液缓冲液底物：底物：4种种dNTP引物：引物：oligo(dT)1218模板：模板：RNA逆转录酶逆转录酶其他试剂：其他试剂：RNA酶抑制剂，酶抑制剂，MgCl2.DTT.牛血清白蛋白牛血清白蛋白二）二）PCR反应体
15、系同以反应体系同以DNA模模 板的反应体系板的反应体系（三）（三）PCR产物的积累规律产物的积累规律 在在PCR反应中，反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐产物逐渐积累，在引物一模板与渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现稳定状态，即出现“停滞效应停滞效应”，又称，又称“平台期平台期”。到达平。到达平台
16、期所需台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩扩增效率、增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行聚合酶一般要进行25次以上次以上PCR循环。循环。多数情况下，平台期在多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。反应中不可避免。PCR产物的积累规律示意图产物的积累规律示意图 五、五、PCR反应条件的控制反应条件的控制(一一)标准标准PCR反应流程反应流程1.反应体系：标准反应体系：标准PCR反应体积为反应体积为50100l,其其
17、中含有缓冲液，中含有缓冲液，4种底物，引物，种底物，引物，DNA模板和模板和耐热耐热DNA聚合酶。聚合酶。2.反应步骤：加入各种试剂，反应步骤：加入各种试剂，950C热变性热变性510分钟，使模板分钟，使模板DNA充分变性，同时除去蛋白酶，充分变性，同时除去蛋白酶，氯仿对耐热氯仿对耐热DNA聚合酶的影响。然后加入聚合酶的影响。然后加入2UTaqDNA聚合酶，加聚合酶，加50l液体石蜡封盖反应液体石蜡封盖反应体系，防止液体挥发。进行体系，防止液体挥发。进行PCR反应。但反应。但PE9700仪设计了热盖，不需加液体石蜡。仪设计了热盖，不需加液体石蜡。(二二)循环参数数循环参数数变性温度和时间：按模
18、板变性温度和时间：按模板DNA复杂程度来调整变性温度复杂程度来调整变性温度和时间。和时间。94 ，1min；95 ，30 s；97 ，15 s；退火温度和时间：退火温度和时间：4555 ，30s1min延伸温度和时间：延伸温度和时间：72 ，时间因扩增片段的长度而异：，时间因扩增片段的长度而异：1kb，1min；34kb,34min循环次数：循环次数：2530次，视最初靶分子浓度而定次，视最初靶分子浓度而定两步两步PCR：将退火和延伸温度合并为一个温度，采用二：将退火和延伸温度合并为一个温度，采用二温式两步温式两步PCR(三三)PCR反应成分反应成分1.PCR反应的缓冲液：反应的缓冲液：105
19、0mmol/L Tris-Cl 缓冲缓冲液，液，72 时时pH7.2,调节反应体系的调节反应体系的pH值，使值，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50mmol/L的的KCl可促进引物退火，大于此浓度将可促进引物退火，大于此浓度将会抑制会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。2.镁离子浓度：镁离子浓度：1.5mmol/L Taq DNA聚合酶活性需要聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，浓度过低，会显著降低酶活性。会显著降低酶活性
20、。Mg2+浓度过高又使酶催化非特浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。异性扩增增强。Mg2+浓度还会影响引物的退火、模浓度还会影响引物的退火、模板与板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。率。在在PCR反应中，反应中，Mg2+的总量应比的总量应比dNTPs的浓度高。的浓度高。其原因是引物、模板、其原因是引物、模板、dNTP分子中的磷酸基团可分子中的磷酸基团可与与Mg2+结合而降低游离结合而降低游离Mg2+浓度，从而影响浓度，从而影响Taq DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。常用常用1.5mmol/L。3.底物浓度：底物浓度：20200mol/L dN
21、TP溶液具有较强的酸性。使用时应用溶液具有较强的酸性。使用时应用NaOH将将pH值值调至调至7.07.5，分装小管，于，分装小管，于-20存放，过多冻融会使存放，过多冻融会使dNTP产生降解。产生降解。在在PCR反应中，反应中，dNTPs浓度在浓度在20200mol/L,dNTP浓度浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，会导致反应速度的下降，但可提高反应的特异性及实验的精确性。但可提高反应的特异性及实验的精确性。4种种dNTP在使用在使用时必须以等摩尔
22、数浓度配制，以减少错配误差和提高使用时必须以等摩尔数浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。效率。4.耐热耐热DNA聚合酶：聚合酶：2.55 u在在PCR反应中，反应中，DNA聚合酶是最关键的因素之聚合酶是最关键的因素之一。一。PCR发明的初期使用的发明的初期使用的DNA聚合酶是聚合酶是Klenow片段、片段、T4DNA聚合酶和聚合酶和T7DNA聚合酶，聚合酶，它们因对热的稳定性差而未得到广泛应用。直它们因对热的稳定性差而未得到广泛应用。直到耐热的到耐热的DNA聚合酶聚合酶(Taq DNA polymerase)应应用于用于PCR反应，才使这一技术得到迅速发展和反应，才使这一技术得到迅速发展和
23、广泛应用。广泛应用。（1）TaqDNA聚合酶聚合酶 Taq DNA聚合酶在聚合酶在7580具有最高的聚合酶活性。具有最高的聚合酶活性。7580每个酶分子每秒可延伸约每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸，个核苷酸，70时延伸速度在时延伸速度在60个核苷酸个核苷酸/秒以上。秒以上。55时为时为22个核苷酸个核苷酸/秒；秒；37和和22时分别为时分别为1.5个和个和0.25个核苷酸个核苷酸/秒。温度超过秒。温度超过80时，合成速度明显下时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。Taq DNA聚合酶没有聚合酶没有35外切酶活性。没有校正功
24、能的。外切酶活性。没有校正功能的。对于对于30次循环的次循环的PCR扩增反应。此酶的错配率为扩增反应。此酶的错配率为0.1%0.25%。Taq DNA聚合酶体外扩增聚合酶体外扩增DNA的忠实性是所有已的忠实性是所有已知忠实性的知忠实性的DNA聚合酶中最低的。因此在特别考虑扩增聚合酶中最低的。因此在特别考虑扩增产物忠实性，推荐采用具有校对功能的其他耐热的产物忠实性，推荐采用具有校对功能的其他耐热的DNA聚合酶。如聚合酶。如Vent和和Pfu DNA聚合酶。聚合酶。Taq DNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能，能催化聚合酶具有类似未端转移酶的功能，能催化dNTP加到加到DNA的的3-OH端。端。但
25、对但对4种种dNTP聚合到聚合到3-未端未端的能力不同，的能力不同，对对dATP的聚合能力高于其他的聚合能力高于其他3种核苷酸，因种核苷酸，因此此PCR产物的末端总是带有两个产物的末端总是带有两个A。我们利用它的这种特。我们利用它的这种特性，在构建性，在构建T载体时，在反应体系载体时，在反应体系 中只加一种底物，即只中只加一种底物，即只加加dTTP。此酶就催化在载体末端加上。此酶就催化在载体末端加上dT,这种载体即可直这种载体即可直接用来克隆接用来克隆PCR 产物。产物。（2）Tth DNA聚合酶聚合酶在在95 0C半衰期为半衰期为20分钟，具有逆转录酶分钟，具有逆转录酶活性，可简化活性，可简
26、化RT-PCR。但不具。但不具35 外外切酶活性，没有校对功能，催化聚合反切酶活性，没有校对功能，催化聚合反应的错误掺入率为应的错误掺入率为1/500（3）Vent DNA聚合酶聚合酶该酶在该酶在1000C时半衰期达时半衰期达95分钟，分钟，97.50C时半衰期长达时半衰期长达130分钟，其扩增产物的长分钟，其扩增产物的长度可达度可达1013kb。Vent DNA聚合酶具有聚合酶具有35 外切酶活性，具有校对功能，错误外切酶活性，具有校对功能，错误掺入率为掺入率为1/31000，忠实性比，忠实性比TaqDNA聚聚合酶提高合酶提高5 10倍。倍。（4）Pfu DNA聚合酶聚合酶此酶耐热性极好，在
27、此酶耐热性极好，在97.50C半衰期大于半衰期大于3小时，具有小时，具有35 外切酶活性，催化外切酶活性，催化DNA合成的忠实性比合成的忠实性比Taq DNA聚合酶高聚合酶高12倍。倍。4.引物：引物：0.10.5 mol/L PCR 反应引物浓度为反应引物浓度为0.10.5mol/L,引物与引物与模板的摩尔比至少为模板的摩尔比至少为108：1。如此过量的引物如此过量的引物才能确保模板才能确保模板DNA一旦变性就与引物退火，一旦变性就与引物退火，而不能与其自身退火。但引物浓度偏高会引起而不能与其自身退火。但引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，且可增加引物之间错配和非特异性产物扩增，且可增
28、加引物之间形成二聚体的几率，降低扩增效率。但如果该形成二聚体的几率，降低扩增效率。但如果该比例太低，比例太低，PCR效率也会降低。效率也会降低。5.模板模板在一定范围内在一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显产量随模板浓度的升高而显著升高，但模板浓度过高会导致反应的非特异著升高，但模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。为保证反应特异性，一般采用微克水性增加。为保证反应特异性，一般采用微克水平的基因组平的基因组DNA或或102 105拷贝的待扩增片段作拷贝的待扩增片段作为模板为模板 6.其他因素其他因素1）热启动：提高扩增的特异性）热启动：提高扩增的特异性2）添加剂：消除引物与模板的二级结构，
29、降低）添加剂：消除引物与模板的二级结构，降低DNA的解链温度，增进的解链温度，增进DNA复性时的特异配对，复性时的特异配对，增加或改进增加或改进DNA聚合酶的稳定性，可添加一些聚合酶的稳定性，可添加一些添加剂。添加剂。3）液体石蜡：防止反应液蒸发后引起的冷却与）液体石蜡：防止反应液蒸发后引起的冷却与反应成分的改变。反应成分的改变。六、六、PCR实验中应注意的事项实验中应注意的事项 由于由于PCR反应极强的扩增能力和检测的灵反应极强的扩增能力和检测的灵敏性，微量样品的污染便有可能导致假阳性结敏性，微量样品的污染便有可能导致假阳性结果的出现。果的出现。（一）（一）PCR实验室的设置实验室的设置样品
30、制备区样品制备区：这个区域专门用于制备模板，要求：这个区域专门用于制备模板，要求：PCR产物和带有待扩增序列的产物和带有待扩增序列的DNA克隆不能在这个克隆不能在这个区域操作，区域操作，用于样品处理的工具不能被用作普通分用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用于操作靶序列。子克隆的工具，也不能用于操作靶序列。在提取在提取DNA样品和样品和RNA样品时要带手套，并要经常更换。样品时要带手套，并要经常更换。纯化样品对污染的风险有极大的影响。纯化样品对污染的风险有极大的影响。PCR操作区：操作区：PCR仪应单独放在另一间实验室。仪应单独放在另一间实验室。另外，在另外，在PCR反应前应
31、对准备和保持干净的反应前应对准备和保持干净的PCR成分给予高度重视。成分给予高度重视。所用的所有溶液应所用的所有溶液应该没有核酸和核酸酶；该没有核酸和核酸酶；所用所用PCR试剂中的水试剂中的水都是高质量的新鲜蒸馏水；都是高质量的新鲜蒸馏水；所用试剂都应大所用试剂都应大体积配制，分装保存（一次用量）；体积配制，分装保存（一次用量）；所用吸所用吸头和试管均为一次性并是灭菌过的。所用器皿头和试管均为一次性并是灭菌过的。所用器皿和塑料制品都要严格消毒。和塑料制品都要严格消毒。反应产物分析区：反应产物分析区：在这区域中所用的试在这区域中所用的试剂，一次性器材和仪器都必须专门用于剂，一次性器材和仪器都必须
32、专门用于PCR产物的分析，绝对不能把这一区域产物的分析，绝对不能把这一区域的试剂或仪器用于样品的制备，的试剂或仪器用于样品的制备，PCR反反应前的操作。应前的操作。（二）设置严格对照（二）设置严格对照阳性对照：阳性阳性对照：阳性DNA模板模板阴性对照：阴性阴性对照：阴性DNA模板模板试剂对照：无试剂对照：无DNA模板模板（三）阴性结果应采取的措施（三）阴性结果应采取的措施用第一次扩增的产物作模板进行第二次扩增用第一次扩增的产物作模板进行第二次扩增增加增加TaqDNA聚合酶的浓度聚合酶的浓度增加模板量增加模板量纯化模板纯化模板增加扩增循环次数增加扩增循环次数适当降低退火温度适当降低退火温度（四）
33、出现非特异性产物时应采取的措施（四）出现非特异性产物时应采取的措施增加退火温度增加退火温度减少减少TaqDNA聚合酶的浓度聚合酶的浓度减少退火及延伸时间减少退火及延伸时间减少引物浓度减少引物浓度减少扩增循环次数减少扩增循环次数七、七、PCR相关技术的发展相关技术的发展 PCR技术建立以来，因其较高的实用性技术建立以来，因其较高的实用性而在各个领域广泛使用。而在各个领域广泛使用。PCR方法本身又在方法本身又在使用中不断得到发展，形成了一系列适用不使用中不断得到发展，形成了一系列适用不同目的的特殊方法。同目的的特殊方法。设计一对外测引物和一对内测引物设计一对外测引物和一对内测引物先用外测引物扩增含
34、目的先用外测引物扩增含目的DNA的大片段的大片段再用内测引物以扩增的大片段为模板扩增目的再用内测引物以扩增的大片段为模板扩增目的DNA片段片段模板DNA加外侧引物A和B引物A 引物BPCR加内侧引物C和D引物CPCR 引物D巢式巢式PCR示意图示意图1、巢式、巢式PCR和半巢式和半巢式PCR(nested primer PCR)2、共享引物、共享引物PCR （shared primer PCR）利用利用3条引物来扩增两种不同的条引物来扩增两种不同的DNA序列，其中一条引序列，其中一条引物可与两种物可与两种DNA序列互补结合序列互补结合共享引物共享引物PCR示意图示意图PCR 引物C引物APCR
35、引物A 引物B3、多重、多重PCR(multiple PCR)用多对引物扩增同一模板的几个区域用多对引物扩增同一模板的几个区域4、不对称、不对称PCR(asymmetric PCR)采用不同的引物浓度扩增得到单采用不同的引物浓度扩增得到单链链DNA两引物浓度比为两引物浓度比为50100：15、锚定、锚定PCR （anchored PCR)以以mRNA为模板经为模板经RT合成合成cDNA，末端转移酶在，末端转移酶在cDNA3末末端加上端加上poly(dG)尾。尾。Poly(dC)锚定引物锚定引物与与poly（dG)尾互补尾互补结合引导合成未知结合引导合成未知DNA序列序列6、反向、反向PCR（i
36、nverted PCR)用限制酶消化基因组用限制酶消化基因组DNA，用连接酶将各片段连，用连接酶将各片段连接成环状。用限制酶切割已知序列，根据已知序接成环状。用限制酶切割已知序列，根据已知序列设计列设计3端引物和端引物和5 端引物，扩增未知序列。端引物，扩增未知序列。7、彩色、彩色PCR（color complementation asay)用不同荧光染料分别标记用不同荧光染料分别标记PCR引物，采用多重引物，采用多重PCR扩增同一扩增同一DNA的不同区域，显示不同颜色，的不同区域，显示不同颜色，用于基因诊断。用于基因诊断。8、原位、原位PCR（in situ PCR）固定组织细胞内的固定组织
37、细胞内的DNA或或RNA，以其为模板，以其为模板进行进行PCR反应的过程反应的过程 将原位杂交的细胞定位技术和将原位杂交的细胞定位技术和PCR的高灵敏度的高灵敏度相结合，产生了原位相结合，产生了原位PCR技术。其原理是以组织固技术。其原理是以组织固定处理细胞内的核酸或定处理细胞内的核酸或RNA作为靶序列，进行作为靶序列，进行PCR反应的过程。与其它反应的过程。与其它PCR方法不同的是，原位方法不同的是，原位PCR不必从组织细胞中分离模板不必从组织细胞中分离模板DNA或或RNA。如冷冻。如冷冻的组织或经有机试剂固定的组织细胞，用蛋白酶，的组织或经有机试剂固定的组织细胞，用蛋白酶，DNA 酶处理，
38、进行原位的逆转录，再加入酶处理，进行原位的逆转录，再加入PCR扩扩增试剂，进行原位增试剂，进行原位PCR反应。用于检测靶基因的细反应。用于检测靶基因的细胞定位、组织分布及靶基因的表达等。胞定位、组织分布及靶基因的表达等。9、定量、定量PCR（quantified PCR）以以mRNA为模板合成为模板合成cDNA加入参照基因，待测基因，参照引物，待测基加入参照基因，待测基因，参照引物，待测基因引物因引物PCR扩增扩增以参照基因的扩增产物的量为基础，观测待测以参照基因的扩增产物的量为基础，观测待测基因产物的相对量。进行定量基因产物的相对量。进行定量PCR时，要考虑时，要考虑内参照因素、内参照因素、
39、RNA制备、逆转录制备、逆转录PCR、凝胶电、凝胶电泳、定量检测各个环节对结果的影响。泳、定量检测各个环节对结果的影响。10、差异显示、差异显示PCR（differential display PCR）将两种将两种mRNA逆转录为逆转录为cDNA第一链第一链加入锚定引物，随机引物加入锚定引物，随机引物PCR扩增，以扩增产物代表相应扩增，以扩增产物代表相应mRNA分析两种细胞基因表达的差异分析两种细胞基因表达的差异11、重组、重组PCR（recombinant PCR）PCR参与的体外基因突变或基因融合过程参与的体外基因突变或基因融合过程12、荧光实时定量、荧光实时定量PCR技术技术 荧光定量荧
40、光定量PCR(FQ-PCR)是新近才出现的一是新近才出现的一种种PCR检测方法，是基于荧光能量转移检测方法，是基于荧光能量转移(FRET)的原理建立的。的原理建立的。FRET是指通过供受体发色团之是指通过供受体发色团之间偶极间偶极-偶极相互作用，能量从供体发色团转移偶极相互作用，能量从供体发色团转移至受体发色团，使受体发光。检测方法有双链至受体发色团，使受体发光。检测方法有双链DNA内插染料、水解探针检测模式、分子信标内插染料、水解探针检测模式、分子信标技术等多种。技术等多种。在普通在普通PCR 仪的基础上再配备一个激发和仪的基础上再配备一个激发和检测的装置。通过检测的装置。通过PCR反应的数
41、学函数关系，反应的数学函数关系，加入标准品，可以对待测样品中的目标基因进加入标准品，可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。该法具有高特异性和可靠性，实行准确定量。该法具有高特异性和可靠性，实验结果稳定，重复性好，在临床检测方面有广验结果稳定，重复性好，在临床检测方面有广泛的用途，如对病毒、病菌和其他病源微生物泛的用途，如对病毒、病菌和其他病源微生物致病基因的检测。致病基因的检测。13.增敏增敏PCR当模板数小于当模板数小于1000个拷贝时，采用增敏个拷贝时，采用增敏PCR，可明，可明显提高显提高PCR的产量。的产量。分两期进行，第一期是在引物分两期进行，第一期是在引物与模板均少的状态下进行与
42、模板均少的状态下进行，延长退火时间，进行，延长退火时间，进行15 20个循环。这一期扩增的主要目的是增加模板个循环。这一期扩增的主要目的是增加模板量，有效地防止第二期扩增时加入过多引无间的相量，有效地防止第二期扩增时加入过多引无间的相互反应，阻止引物二聚体的形成。互反应，阻止引物二聚体的形成。第二期反应：补第二期反应：补加引物至加引物至0.1mol/L,于常规条件下进行于常规条件下进行20个个PCR循循环。环。第一期增加特异性，第二期增加特异产物的量。第一期增加特异性，第二期增加特异产物的量。14.表达表达PCR 表达表达PCR是重组是重组PCR的一种，通过将高表达的启动子的一种，通过将高表达
43、的启动子和高效转录的终止子附加与扩增目的基因的两个引物的和高效转录的终止子附加与扩增目的基因的两个引物的5 端，使目的基因的端，使目的基因的5 端带上强的启动子，端带上强的启动子，3 端带上高效转端带上高效转录终止序列，将其克隆到表达载体上可获得高效表达。亦录终止序列，将其克隆到表达载体上可获得高效表达。亦可直接进行转录和翻译。可直接进行转录和翻译。例如：将例如：将PCR 引物的引物的5 端带上启端带上启动子动子3 端的同源序列，扩增的目的基因的产物与启动子混端的同源序列，扩增的目的基因的产物与启动子混合进行第二次合进行第二次PCR扩增，经变性，退火，其中有一种产物扩增，经变性，退火，其中有一
44、种产物可作为可作为PCR反应的模板，加入适当的引物，可产生带有启反应的模板，加入适当的引物，可产生带有启动子序列目的动子序列目的DNA片段，即可直接进行转录和翻译。片段，即可直接进行转录和翻译。八、八、PCR产物的检测产物的检测（一）琼脂糖凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是琼脂糖凝胶电泳是PCR扩增产物的分离、纯化和鉴定最扩增产物的分离、纯化和鉴定最常用的方法。常用的方法。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙锭扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙锭(EB)染色，在紫外灯下便可以直接确定染色，在紫外灯下便可以直接确定DNA片段在凝胶片段在凝胶板中的位置。其分辨率很高，可测出板中的位置。
45、其分辨率很高，可测出1ngDNA。首先。首先根据根据PCR扩增片段的大小选择琼脂糖凝胶浓度，一般扩增片段的大小选择琼脂糖凝胶浓度，一般800bp以以上的片段用上的片段用0.8%的胶，的胶，800bp以下的片段用以下的片段用1.0%2.0%的胶。成功的的胶。成功的PCR扩增应可见到分子质量均一的一条区扩增应可见到分子质量均一的一条区带带，对照分子质量标准还可对扩增产物进行半定量。，对照分子质量标准还可对扩增产物进行半定量。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的灵敏度比琼脂糖凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的灵敏度比琼脂糖凝胶电泳高泳高，主要用于分离制备小于，主要用于分离制备小于1kb长度的低分子质量基长度的低分子
46、质量基因片段，因此特别适用于合成的基因片段的分离和检测。因片段，因此特别适用于合成的基因片段的分离和检测。PAGE有静电效应和分子筛效应，分辨率很高，在有静电效应和分子筛效应，分辨率很高，在DNA序列分析时，即使相差一个核苷酸片段也能很好地分开。序列分析时，即使相差一个核苷酸片段也能很好地分开。适用于适用于PCR扩增效率低时产物的检测。根据扩增片段的扩增效率低时产物的检测。根据扩增片段的大小选择合适的胶浓度，电泳后可用银染或溴乙锭染色大小选择合适的胶浓度，电泳后可用银染或溴乙锭染色检测，银染比检测，银染比EB染色检测灵敏度高染色检测灵敏度高210倍。倍。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（二）聚丙烯酰胺
47、凝胶电泳 高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)是在常压基础上发展起是在常压基础上发展起来的一项现代化分析技术，其特点是分离速度快、来的一项现代化分析技术，其特点是分离速度快、效果好，是目前基因片段分离纯化所广泛采用的效果好，是目前基因片段分离纯化所广泛采用的方法之一。方法之一。离子交换层析的基础是溶质分子所携带的电离子交换层析的基础是溶质分子所携带的电荷，而合成的基因片段恰好具有这一性质。因此，荷，而合成的基因片段恰好具有这一性质。因此，ICE分析广泛应用于分析广泛应用于DNA的合成及其扩增后的分的合成及其扩增后的分离纯化。离纯化。（三）层析技术（三）层析技术 为了确定为了确定PCR产物是否是
48、预先设计的目的产物是否是预先设计的目的片段，或产物是否有突变，都需做分子杂交检片段，或产物是否有突变，都需做分子杂交检测。分子杂交包括点杂交和测。分子杂交包括点杂交和Southern印迹杂交。印迹杂交。点杂交灵敏度较高，特别适用于特异性不高的点杂交灵敏度较高，特别适用于特异性不高的PCR扩增产物分析。扩增产物分析。Southern印迹杂交可鉴定印迹杂交可鉴定PCR产物的大小产物的大小和特异性，检测灵敏度可达和特异性，检测灵敏度可达10ng。基本过程是。基本过程是PCR产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳，然后，产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳，然后，印迹转移到尼龙膜上，再用标记的探针进行杂印迹转移到尼龙膜
49、上，再用标记的探针进行杂交检测。交检测。（四）分子杂交（四）分子杂交 若知道若知道PCR扩增片段的序列或限制性内切酶酶切扩增片段的序列或限制性内切酶酶切图谱，则可选择合适的限制酶消化图谱，则可选择合适的限制酶消化PCR产物，再进行产物，再进行电泳分析，根据电泳分析，根据PCR酶切产物的电泳图谱，可判定酶切产物的电泳图谱，可判定PCR产物的特异性及是否存在突变。产物的特异性及是否存在突变。（六）（六）PCR扩增产物的直接测序扩增产物的直接测序 直接序列分析是指在直接序列分析是指在PCR扩增基因组扩增基因组DNA序列的序列的基础上，直接进行基因核苷酸序列分析的方法，是检基础上，直接进行基因核苷酸序
50、列分析的方法，是检测基因突变最有效、最直接的方法。测基因突变最有效、最直接的方法。（五）限制性内切酶酶切分析（五）限制性内切酶酶切分析九、九、PCR技术的应用技术的应用（一）遗传性疾病的基因诊断，例地贫的产前诊断。（一）遗传性疾病的基因诊断，例地贫的产前诊断。（二）检测癌基因二）检测癌基因PCR与寡核苷酸探针杂交结合检测与寡核苷酸探针杂交结合检测ras基因点突变基因点突变PCR扩增包含扩增包含ras基因基因12、13和和61位密码子的位密码子的DNA片段片段寡核苷酸探针与寡核苷酸探针与PCR产物杂交产物杂交放射自显影，检测点突变发生的类型和部位放射自显影，检测点突变发生的类型和部位（三）检测病
