1、病毒鉴定方法病毒鉴定方法一、分离培养方法一、分离培养方法二、快速诊断方法二、快速诊断方法1 1、光学显微镜检查、光学显微镜检查 病毒包涵体及某些大病毒颗粒的检查病毒包涵体及某些大病毒颗粒的检查2 2、电子显微镜的检查、电子显微镜的检查 电镜直接检查电镜直接检查 免疫电镜检查免疫电镜检查3 3、血清学检查、血清学检查4 4、病毒基因组检查、病毒基因组检查 核酸杂交和聚合酶链反应核酸杂交和聚合酶链反应乙肝病毒检测乙肝病毒检测一一、乙肝五项（两对半）、乙肝五项（两对半）二、乙肝病毒核酸定量检测二、乙肝病毒核酸定量检测 HBVHBV抗原抗体系统检测临床意义抗原抗体系统检测临床意义HBsAg抗抗-HBs
2、HBeAg抗抗-HBe抗抗-HBc临床意义临床意义IgMIgG+-感染或无症状携带者感染或无症状携带者+-+-+-急性或慢性乙型肝炎（传染性强）急性或慢性乙型肝炎（传染性强）（大三阳）（大三阳）+-+-+急性肝炎趋向恢复急性肝炎趋向恢复（小三阳）（小三阳）-+-+-+既往感染恢复期既往感染恢复期-+-+-既往感染恢复期既往感染恢复期-+既往感染既往感染-+-既往感染或接种疫苗既往感染或接种疫苗-未感染，无免疫力未感染，无免疫力二、二、乙肝病毒核酸定量检测乙肝病毒核酸定量检测1.检测原理检测原理 利用荧光利用荧光PCR技术，以技术，以HBV基因组中相对保守区为基因组中相对保守区为靶区域，设计特异
3、引物及荧光探针，通过靶区域，设计特异引物及荧光探针，通过PCR对对DNA进行快速定量检测。进行快速定量检测。荧光探针荧光探针TaqMan 探针实时荧光探针实时荧光 PCR 技术。在技术。在 PCR 反应过程中，同时利用反应过程中，同时利用 Taq 酶的酶的 53聚合酶活聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得性和核酸外切酶活性，使得 TaqMan 探针降解，荧光探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射，报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射，FAM 荧荧光检测乙型肝炎病毒光检测乙型肝炎病毒JOE/RED610 nm 波长通道检测波长通道检测内参。内参。PCR分四个阶段分四个阶段O 1为Hb
4、eAg阳性（含HbeAg阳性血清）在 PCR 反应过程中，同时利用 Taq 酶的 53聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得 TaqMan 探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射，FAM 荧光检测乙型肝炎病毒JOE/RED610 nm 波长通道检测内参。93 45秒55 60秒10个循环洗涤时各孔均加满，防止孔内有游离酶未洗净影响结果在微孔板上预包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb），配以辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基联苯胺）等试剂，采用双抗夹心法检测血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）C100,HBV DNA浓度100 IU/ml洗涤液
5、充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）未结合SYBR Green 1 dye（含HbeAg阳性血清）HBV定量参考品（2.2 FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于300E+008,HBV DNA浓度=C IU/ml一、乙肝五项（两对半）Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。一、乙肝五项（两对半）HBV抗原抗体系统检测临床意义4实验无效，应重新实验（辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体）在微孔板上预包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb），配以辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb-HRP）及TMB
6、（四甲基联苯胺）等试剂，采用双抗夹心法检测血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）lCt值的定义是值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循循环次数环次数。确定初始模板的浓度确定初始模板的浓度q初始初始 DNADNA量越多量越多,荧光荧光达到某一值（域值）时达到某一值（域值）时所需要的循环数越少所需要的循环数越少qLogLog浓度与循环数呈线浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模计算出样品中所含的模板量板量l。SYBR Gre
7、en 1 结合到双链DNA的小沟部位lSYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACG GTAAT未结合SYBR Green 1 dye2.所用试剂所用试剂组分组分名称名称规格规格数量数量主要成分主要成分 核酸核酸提取试剂提取试剂DNA提取提取液液I I4.5ml/瓶瓶2DNA提取液提取液质质控品及阳性定量参考品控品及阳性定量参考品阴性质控品阴性质控品250ul/管管1HBV阴性血清阴性血清强阳性质控品强阳性质控品250ul/管管
8、1灭活灭活HBV阳性血清阳性血清临界阳性质控品临界阳性质控品250ul/管管1灭活灭活HBV阳性血清阳性血清HBV定量参考品（定量参考品（2.0X106IU/ml）250ul/管管1灭活灭活HBV阳性血清阳性血清HBV定量参考品（定量参考品（2.0X105IU/ml）250ul/管管1灭活灭活HBV阳性血清阳性血清HBV定量参考品（定量参考品（2.0X104IU/ml）250ul/管管1灭活灭活HBV阳性血清阳性血清HBV定量参考品（定量参考品（2.0X103IU/ml）250ul/管管1灭活灭活HBV阳性血清阳性血清 PCR检测试剂检测试剂HBV-内标溶液内标溶液100ul/管管1内标质粒及
9、稳定剂内标质粒及稳定剂HBV-PCR反应管反应管1人一份人一份/管管20引物、探针、引物、探针、taq酶酶等等3、实验步骤、实验步骤1.DNA提取提取 将待测样本、将待测样本、阳性定量参考品阳性定量参考品、阴性质控品、阴性质控品、HBV强阳性质强阳性质控品、控品、HBV临界质控品进行同步处理。临界质控品进行同步处理。1.1 取取200 L样品，加入样品，加入450 L DNA提取液提取液I I和和4 L内标溶液，内标溶液，用振荡器剧烈震荡摇匀用振荡器剧烈震荡摇匀15秒，瞬时离心数秒，秒，瞬时离心数秒，100处理处理10分分钟钟1.2 12000rpm离心离心5分钟，备用分钟，备用2.PCR试剂
10、准备试剂准备直接使用直接使用HBV-PCR反应管反应管3.加样加样HBV-PCR反应管反应管分别加入分别加入将待测样本、将待测样本、阳性定量参考品阳性定量参考品、阴性、阴性质控品、质控品、HBV强阳性质控品、强阳性质控品、HBV临界质控品上清临界质控品上清20 L。盖紧。盖紧管盖，管盖，8000rpm离心数秒后扩增离心数秒后扩增4.PCR扩增扩增对各标本进行标记对各标本进行标记反应条件：反应条件：93 2 2分钟分钟93 45 45秒秒55 6055 60秒秒1010个循环个循环93 30 30秒秒45 6045 60秒秒3030个循环个循环FAMFAM通道检测通道检测HBVHBV核酸，核酸，
11、VICVIC通道检测内标通道检测内标4.结果判定结果判定1 如果在如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或检测通道检测扩增曲线无明显对数期或Ct值等于值等于30，VIC检测通道扩增曲线有明显对数期，检测通道扩增曲线有明显对数期，则为阴性或小于检测灵敏度则为阴性或小于检测灵敏度2 FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于值小于30按以下方法判断：按以下方法判断：C100,HBV DNA100,HBV DNA浓度浓度100 IU/ml5.0E+008,HBV DNA5.0E+008,HBV DNA浓度浓度5.0X105.0X108 8 IU/ml IU/m
12、l 如需精确如需精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测，则样品再检测，则样品HBV DNAHBV DNA浓度浓度=（CXCX稀释倍数）稀释倍数）IU/ml IU/ml5.注意事项注意事项1 每次实验需检测每次实验需检测阴性质控品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、强阳性质控品、HBV临界质控品，满足要求方可进行判定（阳性质控临界质控品，满足要求方可进行判定（阳性质控品品Ct305.93 30秒45 60秒30个循环Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。一、乙肝五项（两对半）4实验无
13、效，应重新实验2 FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于3093 30秒45 60秒30个循环洗涤时各孔均加满，防止孔内有游离酶未洗净影响结果分别用加样器加入阳性对照血清、阴性对照血清50 L（各加两孔），待测血清50 L（1孔），空白对照（不加）一、乙肝五项（两对半）在微孔板上预包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb），配以辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基联苯胺）等试剂，采用双抗夹心法检测血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）2.所用试剂所用试剂组成成分组成成分规格规格组成成分组成成分规格规格1.HbeAg微孔板微孔板（包被鼠抗（包被鼠抗-H
14、be单克隆抗体单克隆抗体（HbeAb）96TX块块7.底物底物B（过氧化氢）（过氧化氢）7mlX1支支2.HbeAg酶标抗酶标抗体体（辣根过氧化（辣根过氧化物酶标鼠抗物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体）单克隆抗体）3.5mlX1支支8.终止液终止液7mlX1支支3.HbeAg阳性对阳性对照血清照血清（含（含HbeAg阳性阳性血清）血清）1mlX1支支9.封口膜封口膜2张张4.HbeAg阴性对阴性对照血清照血清（正常人血清）（正常人血清）1mlX1支支10.自封袋自封袋1个个5.浓缩洗涤浓缩洗涤（PBS-T缓冲液）缓冲液）12.5mlX1支支11.说明书说明书1张张6.底物底物A（过氧化氢）（过氧化氢
15、）7mlX1支支 3、实验步骤、实验步骤1.平衡平衡 试剂盒个组分取出，平衡至室温（试剂盒个组分取出，平衡至室温（16-25）余者以自封袋）余者以自封袋封存封存2.配液配液 浓缩洗涤液摇匀后，用蒸馏水或去离子水按浓缩洗涤液摇匀后，用蒸馏水或去离子水按1:19稀释备用稀释备用3.编号编号 微孔条固定于支架，按序编号微孔条固定于支架，按序编号4.加样加样 分别用加样器加入阳性对照血清、阴性对照血清分别用加样器加入阳性对照血清、阴性对照血清50 L（各加两孔），待测血清（各加两孔），待测血清50 L（1孔），空白对孔），空白对照（不加）照（不加）5.加酶加酶 每空加酶标抗体每空加酶标抗体50 L，混
16、匀（空白对照不加），混匀（空白对照不加）6.温浴温浴 37温浴温浴2525分钟，室温平衡分钟，室温平衡5 5分钟（封口膜覆盖孔口，避免其分钟（封口膜覆盖孔口，避免其他因素影响）他因素影响）7.洗涤洗涤 洗涤液充分洗涤洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸秒的浸泡时间）泡时间）8.显色显色 每孔加入每孔加入A、B底物底物50 L，混匀，混匀，37暗置暗置1515分钟分钟9.终止终止 每孔加每孔加50 L终止液终止液50 L，混匀，混匀10.测定测定 酶标仪单波长酶标仪单波长450nm或双波长或双波长450/630nm测定各空测定各空OD值，记值，记录
17、结果录结果,30分钟内测定完成）分钟内测定完成）4.结果判定结果判定1.临界值临界值(C.O)计算计算 临界值临界值=阴性对照孔阴性对照孔OD值均值值均值N X 2.1 X 2.1 注意：阴性对照孔注意：阴性对照孔均值均值N大于大于0.1应重新实验，小于应重新实验，小于0.05按按0.05计算计算2.结果判定结果判定样品样品OD值值/C.O 11为为HbeAg阳性阳性样品样品OD值值/C.O 1 1为为HbeAg阳性阳性3.阴性对照孔阴性对照孔均值均值N大于大于0.1或阳性对照均值或阳性对照均值0.40.4实实验无效，验无效，应重新实验应重新实验5.注意事项注意事项1.1.洗涤时各孔均加满，防
18、止孔内有游离酶未洗净影洗涤时各孔均加满，防止孔内有游离酶未洗净影响结果响结果2.2.所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。集中放置高压灭菌后方可处置。3.3.微孔板拆封后，取出当天用的微孔条后，其余用封微孔板拆封后，取出当天用的微孔条后，其余用封口膜封存避免受潮口膜封存避免受潮PCR分四个阶段分四个阶段lCt值的定义是值的定义是PCR扩增过
19、程中，荧光信号开扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循循环次数环次数。4.结果判定结果判定1 如果在如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或检测通道检测扩增曲线无明显对数期或Ct值等于值等于30，VIC检测通道扩增曲线有明显对数期，检测通道扩增曲线有明显对数期，则为阴性或小于检测灵敏度则为阴性或小于检测灵敏度2 FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于值小于30按以下方法判断：按以下方法判断：C100,HBV DNA100,HBV DNA浓度浓度100 IU/ml5.0E+008,HBV D
20、NA5.0E+008,HBV DNA浓度浓度5.0X105.0X108 8 IU/ml IU/ml 如需精确如需精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测，则样品再检测，则样品HBV DNAHBV DNA浓度浓度=（CXCX稀释倍数）稀释倍数）IU/ml IU/ml0E+008,HBV DNA浓度=C IU/ml0X104IU/ml）1或阳性对照均值0.酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各空OD值，记录结果,30分钟内测定完成）0E+008,HBV DNA浓度5.1 如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或Ct
21、值等于30，VIC检测通道扩增曲线有明显对数期，则为阴性或小于检测灵敏度HBV定量参考品（2.HbeAg阴性对照血清HbeAg阴性对照血清FAM通道检测HBV核酸，VIC通道检测内标0X108 IU/ml 如需精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测，则样品HBV DNA浓度=（CX稀释倍数）IU/ml每空加酶标抗体50 L，混匀（空白对照不加）（辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体）一、乙肝五项（两对半）0E+008,HBV DNA浓度5.在微孔板上预包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb），配以辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基联
22、苯胺）等试剂，采用双抗夹心法检测血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）每孔加50 L终止液50 L，混匀Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。1 取200 L样品，加入450 L DNA提取液I和4 L内标溶液，用振荡器剧烈震荡摇匀15秒，瞬时离心数秒，100处理10分钟C100,HBV DNA浓度100 IU/ml洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）洗涤时各孔均加满，防止孔内有游离酶未洗净影响结果HBV-PCR反应管分别加入将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界质控品上清20 L。
23、将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界质控品进行同步处理。0X108 IU/ml 如需精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测，则样品HBV DNA浓度=（CX稀释倍数）IU/ml在微孔板上预包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb），配以辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基联苯胺）等试剂，采用双抗夹心法检测血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）（含HbeAg阳性血清）SYBR Green 1每孔加入A、B底物50 L，混匀，37暗置15分钟（辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体）3 所有样品包括质控品均按传
24、染性标本对待严格遵循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。每孔加入A、B底物50 L，混匀，37暗置15分钟质控品及阳性定量参考品Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。93 30秒45 60秒30个循环2 FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于30二、乙肝病毒核酸定量检测HbeAg阴性对照血清利用
25、荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异引物及荧光探针，通过PCR对DNA进行快速定量检测。0E+008,HBV DNA浓度=C IU/ml（含HbeAg阳性血清）2.所用试剂所用试剂组成成分组成成分规格规格组成成分组成成分规格规格1.HbeAg微孔板微孔板（包被鼠抗（包被鼠抗-Hbe单克隆抗体单克隆抗体（HbeAb）96TX块块7.底物底物B（过氧化氢）（过氧化氢）7mlX1支支2.HbeAg酶标抗酶标抗体体（辣根过氧化（辣根过氧化物酶标鼠抗物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体）单克隆抗体）3.5mlX1支支8.终止液终止液7mlX1支支3.HbeAg阳性对阳性对照血清照血清（含
26、（含HbeAg阳性阳性血清）血清）1mlX1支支9.封口膜封口膜2张张4.HbeAg阴性对阴性对照血清照血清（正常人血清）（正常人血清）1mlX1支支10.自封袋自封袋1个个5.浓缩洗涤浓缩洗涤（PBS-T缓冲液）缓冲液）12.5mlX1支支11.说明书说明书1张张6.底物底物A（过氧化氢）（过氧化氢）7mlX1支支 利用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异引物及荧光探针，通过PCR对DNA进行快速定量检测。2 FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于301 如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或Ct值等于30，VIC检测通道扩增曲线有明显对数期，则为阴性
27、或小于检测灵敏度93 30秒45 60秒30个循环核酸杂交和聚合酶链反应HBV定量参考品（2.洗涤时各孔均加满，防止孔内有游离酶未洗净影响结果0X106IU/ml）盖紧管盖，8000rpm离心数秒后扩增浓缩洗涤液摇匀后，用蒸馏水或去离子水按1:19稀释备用1 取200 L样品，加入450 L DNA提取液I和4 L内标溶液，用振荡器剧烈震荡摇匀15秒，瞬时离心数秒，100处理10分钟Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。质控品及阳性定量参考品93 45秒55 60秒10个循环二、乙肝病毒核酸定量检测引物、探针、taq酶等二、乙肝病毒核酸定量检
28、测2 FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于30洗涤时各孔均加满，防止孔内有游离酶未洗净影响结果O 1为HbeAg阳性Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量0X104IU/ml）酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各空OD值，记录结果,30分钟内测定完成）核酸杂交和聚合酶链反应93 45秒55 60秒10个循环将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界质控品进行同步处理。1 如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或Ct值等于30，VIC检测通道扩增曲线有明显对数期，则为阴性或小于检测灵敏度
29、微孔板拆封后，取出当天用的微孔条后，其余用封口膜封存避免受潮SYBR Green 1酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各空OD值，记录结果,30分钟内测定完成）引物、探针、taq酶等（包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb）核酸杂交和聚合酶链反应引物、探针、taq酶等所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。（含HbeAg阳性血清）洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）93 45秒55 60秒10个循环注意：阴性对照孔均值N大于0
30、.（辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体）洗涤时各孔均加满，防止孔内有游离酶未洗净影响结果0X104IU/ml）HBV-PCR反应管分别加入将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界质控品上清20 L。5.注意事项注意事项1.1.洗涤时各孔均加满，防止孔内有游离酶未洗净影洗涤时各孔均加满，防止孔内有游离酶未洗净影响结果响结果2.2.所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。集中放置高压灭菌后方可处置。3.3.微孔板拆封后，取出当天用的微孔条后，其余用封微孔板拆封后，取出当天用的微孔条后，其余用封口膜封存避免受潮口膜封存避免受潮
