1、项目二超氧化物歧化酶（SODSOD）的生产班级：生物制药班级：生物制药1411姓名：吴怡慧姓名：吴怡慧预习方案汇报PPT酶与SDO酶的基本知识1酶的生产工艺与准备2SOD酶的检验与准备3注意事项4Contents目录第 一 章 节diyizhangjie2、超氧化物歧化酶（SOD）基本知识1、酶的基本知识酶的基本知识p酶是由生物活细胞产生的具有特殊催化功能的一类生物活性物质，其化学本质是蛋白质，故也称酶蛋白。p用于预防，治疗和诊断疾病的一类酶制剂，称为药用酶。早期主要用于治疗消化道疾病、烧伤及感染引起的炎症等，现已广泛应用于多种疾病的治疗。p药用酶制备通常有三种方法：直接提取法；微生物发酵法；
2、动植物细胞培养法p药用酶常用提取纯化方法有：水溶液法；有机溶剂法；表面活性剂法（应用较少）超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SODSOD）基本知识）基本知识p概念：超氧物歧化酶（Superoxide Dismutase简称SOD）是一种新型酶制剂，是广泛存在于生体内各种组织的一种金属酶，是机体细胞抵御氧化损伤最重要的酶之一，是药用酶之一，被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。p功能：清除体内多余的自由基；延缓由于自由基侵害而出现的衰老现象；提高人体抵抗自由基诱发疾病的能力；能抗疲劳、甚至抗肿瘤体内的SOD活性越高，寿命就越长。p分布：主要分布颜色举例真核细胞细胞质蓝绿色猪血、猪肝
3、原核及真核细胞线粒体紫红色人和狒狒肝细胞的胞液原核细胞黄褐色绿菌属、脱硫弧菌属v 主要来源：大蒜蒜瓣（含有丰富的SOD酶）第 二 章 节dierzhangjie2、实训准备（材料与仪器)3、酶的生产工艺流程图1、SOD酶的提取原理SODSOD酶的提取原理酶的提取原理 有机溶剂沉淀的原理是有机溶剂能降低水溶液的介电常数，使蛋白质分子之间的静电引力增大。同时，有机溶剂的亲水性比溶质分子的亲水性强，它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水，破坏其表面的水化膜，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生聚集，从而沉淀析出。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、
4、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子(O2-)进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲溶液提取出来。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。实训准备（材料与仪器）实训准备（材料与仪器）材料：大蒜蒜瓣 氯仿-乙醇混合液 冷丙酮 磷酸缓冲溶液（PH7.8、0.05mol/L)仪器：一个石英砂研钵 离心管 移液管 玻璃棒 塞离心管 离心机 冷冻离心机SODSOD酶的生产工艺流程图酶的生产工艺流程图称取5g大蒜蒜瓣捣碎加入磷酸缓冲溶液15ml(PH7.80.05mol/L)再研磨20min直到充分溶解置
5、于冷冻离心机以6000r/min离心15min弃沉淀取上清提取于上清液中加入1/4倍体积氯仿-乙醇混合液搅拌15min以6000r/min离心15min弃沉淀取上清得到粗酶液加入等体积冷丙酮持续搅拌15min以6000r/min离心15min 得到SOD酶沉淀冷冻干燥将沉淀置于5ml磷酸缓冲溶液中（PH7.8、0.05mol/ml）以6000r/min离心15min弃沉淀取上清液用凝胶SephacrylS-200进行纯化进行超滤浓缩得到SOD酶除杂蛋白分离纯化第 三 章 节disanzhangjie 2、实训准备（材料、仪器）1、SOD酶检验的原理3、SOD酶检验步骤SODSOD酶检验原理酶检
6、验原理 连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-,生成带色的中间产物（反应液由黄棕色变为绿色，再变为黄色，这是由于生成的中间物不断氧化的结果）。在自氧化过程的初始阶段，黄色中间产物的积累在滞后30-45s后就与时间呈现性关系。中间产物在420nm处有强烈的光吸收，线性时间一般维持4min的范围内。在有SOD存在时能催化生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，通过计算就可以求出SOD的活力。邻苯三酚自养化法测定酶活力，计算公式：单位体积活力（u/ml）=总活力（U）=单位体积活力x原液总体积v酶活力单位意义：在25恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义
7、为1个酶活力单位。0.070-供试品溶液速率0.07050%x反应液总体积x供试品溶液稀释倍数供试品溶液体积x100%SODSOD酶检验准备酶检验准备试剂：（1）PH8.30 50mol/L K2PHO4-KH2PO4缓冲溶液：25下 96.5ml 1mol/LK2HPO4与3.5ml1mol/LKH2PO4混合后用水稀释至2000ml（2）0.05mol/L连苯三酚溶液：称取3.15g连苯三酚用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容至500ml（3）10mol/L盐酸溶液仪器：（1）PH计（2）紫外分光光度计（3）恒温水浴槽（4）10ml试管（5）1cm比色皿 SODSOD酶检验步骤酶检验步骤
8、一、连苯三酚自养化速率的测定（1）准备好两只试管，同时加入PH值为8.30的50mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液4.50ml，在25+-0.5的恒温水浴中保温10min；（2）其中一只试管加入等体积事先预热好的25连苯三酚溶液，另支试管作为空白管，加入等体积10mol/LHCl，迅速摇匀后倒入1cm比色皿中；（3）以空白管为参比，在325nm下每隔30s测1次吸光值，连续记录3min，调节连苯三酚溶液用量，将其自氧化速率控制在0.068-0.072D/min。经实验测得连苯三酚溶液的用量为6ulSODSOD酶检验步骤酶检验步骤二、酶活性的测定（1）取两支试管时加入PH值为8.30的
9、50mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液1.5ml，在25+-0.5的恒温水浴中保温10min，加入等体积酶液；（2）取一支加入事先预热好的25连苯三酚溶液，另支空白试管再加入10mol/LHCl，迅速摇匀后倒入1cm比色皿中；（3）以空白管为参比，在325nm下每隔30s测1次吸光值，连续记录3min，调节酶液体积，使样液中连苯三酚的氧化速度控制在0.033-0.037D/min，记录此时样液体积。（4）根据公式计算出酶活性。第 四 章 节disizhangjie1、注意事项2、参考文献注意事项注意事项（1）在破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底；（2）PH的控制力度很重要，以及在实验中的温度等；（3）丙酮分级沉淀操作时，宜在410条件下进行，有利于提高蛋白沉淀效果，保护酶活性；（4）要学会正确使用分光光度计，先预热30min。参考文献参考文献1、http:/
