1、2023-1-28分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学分子诊断学_复杂性疾病复杂性疾病的分子诊断的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断Molecular pathology represents the application of the principles of basic molecular biology to the investigation of human disease processes.molecular pathology：分子病理学：分子病理学Key Points分子诊断学复杂性疾病的分子诊断Gene mutation and/or genetic polym
2、orphism is a normal occurrence,usually without grave consequences,that contributes to those traits that establish our individuality.genetic polymorphism：基因多态性：基因多态性分子诊断学复杂性疾病的分子诊断According to numerous information available,genetic diseases can be categorized into three major groups:chromosomal disor
3、ders,monogenic or single-gene disorders,and polygenic or multifactorial disorders.chromosomal：染色体；：染色体；monogenic/single-gene：单基因；单基因；polygenic/multifactorial多基因多基因分子诊断学复杂性疾病的分子诊断Polygenic or multifactorial disorders result from multiple genetic and/or epigenetic factors that do not conform to tradit
4、ional Mendelian inheritance pattens,which are different in monogenic disorders.epigenetic：后生的；：后生的；Mendelian inheritance：孟：孟德尔遗传；德尔遗传；分子诊断学复杂性疾病的分子诊断The pathogenic nature of methylation is illustrated by the observation that for many tumor suppressor genes.methylation：甲基化；：甲基化；pathogenic：病原的：病原的 Hyb
5、ridization：杂交：杂交分子诊断学复杂性疾病的分子诊断The detection of methylated sequences in DNA derived from the plasma or serum by all kinds of sensitive techniques is a potentially important early detection and monitoring method for cancer.plasma or serum：血浆或血清：血浆或血清potentially：潜在地：潜在地分子诊断学复杂性疾病的分子诊断DNA alterations h
6、ave been detected in patients with small or even in situ lesions,indicating that tumor DNA is shed into circulation early in the disease.alterations：改变，更改；：改变，更改；in situ：在原来的位置；：在原来的位置；lesion：机能障碍；：机能障碍；分子诊断学复杂性疾病的分子诊断Our ever broadening insights into the molecular basis of disease processes continu
7、e to provide an opportunity for the clinical laboratory to develop and implement new and novel approaches for diagnosis,monitoring,drug resistance and prognostic assessment of human diseases.Implement：实施；：实施；prognostic：预兆：预兆分子诊断学复杂性疾病的分子诊断复杂性疾病包括肿瘤（复杂性疾病包括肿瘤（tumor）、心血管疾病）、心血管疾病（cardiovascular diseas
8、es）、自身免疫性疾病）、自身免疫性疾病（autoimmune diseases）和一些代谢性疾病）和一些代谢性疾病（metabolic diseases）等。）等。分子诊断学复杂性疾病的分子诊断肿瘤（肿瘤（tumor）：医学术语亦称恶性肿瘤）：医学术语亦称恶性肿瘤（malignant neoplasm），由控制细胞生长增殖），由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。分子生物学统或淋巴系统转移到身体其他部分。分子生
9、物学的研究已经发现的研究已经发现2.5万多种与癌症相关的基因变异，万多种与癌症相关的基因变异，这个数字还在增加这个数字还在增加分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断心血管疾病（心血管疾病（cardiovascular diseases）：心血管疾病）：心血管疾病是威胁人类健康的最常见疾病，其发病率在中国居于首位。是威胁人类健康的最常见疾病，其发病率在中国居于首位。自身免疫性疾病（自身免疫性疾病（autoimmune diseases）：是指机体）：是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。病。代谢性疾病
10、（代谢性疾病（metabolic diseases）营养物质进入机体）营养物质进入机体后在体内合成和分解代谢过程中的一系列化学反应，如某后在体内合成和分解代谢过程中的一系列化学反应，如某一环节出现障碍则引起代谢性疾病一环节出现障碍则引起代谢性疾病分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断复杂性疾病（复杂性疾病（complicated diseases）基本特征基本特征：发病原因不明，由多个基因和环境因：发病原因不明，由多个基因和环境因素共同参与，不符合孟德尔
11、遗传规律，当出现典素共同参与，不符合孟德尔遗传规律，当出现典型临床表现时已经处于病程的中后期。型临床表现时已经处于病程的中后期。分子诊断学复杂性疾病的分子诊断复杂性疾病复杂性疾病分子诊断的特点分子诊断的特点：直接检测疾病或疾病相关基因，属病因诊断，直接检测疾病或疾病相关基因，属病因诊断，针针对性强对性强。特异性强，灵敏度高特异性强，灵敏度高。1.适用范围广适用范围广。分子诊断学复杂性疾病的分子诊断患者的外周血细胞患者的外周血细胞病灶局部的受损组织病灶局部的受损组织血浆血浆DNA分子诊断学复杂性疾病的分子诊断血浆血浆DNA（plasma DNA），又称循环），又称循环DNA（circulatin
12、g DNA），是一种无细胞状态的胞），是一种无细胞状态的胞外外DNA，由长度不等的单链或双链，由长度不等的单链或双链DNA组成。组成。根据核苷酸序列的组成差异性，可分为：根据核苷酸序列的组成差异性，可分为：人类基因组来源的循环人类基因组来源的循环DNA；细菌及病毒等病原生物来源的循环细菌及病毒等病原生物来源的循环DNA分子诊断学复杂性疾病的分子诊断人类基因组循环人类基因组循环DNA来源于：来源于：细胞死亡后释放的细胞死亡后释放的DNA片段；片段；细胞主动分泌或释放的细胞主动分泌或释放的DNA片段片段分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子杂交（分子杂交（molecular hybridization
13、）不同来源或不同种类生物分子间相互特异识别而不同来源或不同种类生物分子间相互特异识别而发生的结合。如核酸发生的结合。如核酸(DNA、RNA)之间、蛋白质之间、蛋白质分子之间、核酸与蛋白质分子之间、以及自组装分子之间、核酸与蛋白质分子之间、以及自组装单分子膜之间的特异性结合。单分子膜之间的特异性结合。分子诊断学复杂性疾病的分子诊断PCR（polymerase chain reaction）DNA序列分析序列分析基因芯片基因芯片分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断基因结构异常检测：基因结构异常检测：斑点杂交（斑点杂
14、交（dot blot hybridization）等位基因特异的寡核苷酸探针杂交（等位基因特异的寡核苷酸探针杂交（allele-specific oligonucleotide,ASO）单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP）限制性内切酶图谱（限制性内切酶图谱（restriction map）限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）DNA印迹（印迹（Southern blot）分子诊断学复杂性疾病的分子诊断基因转录水平检测：基因转录水平检测：RNA印迹（印迹（Northern blot）逆转录逆转
15、录PCR（RT-PCR）基因序列分析及表达检测技术基因序列分析及表达检测技术DNA序列分析序列分析基因芯片基因芯片分子诊断学复杂性疾病的分子诊断基因和蛋白质水平改变，其发生发展存在一定的基因和蛋白质水平改变，其发生发展存在一定的遗传学基础，以此作为肿瘤分子诊断的依据遗传学基础，以此作为肿瘤分子诊断的依据分子诊断学复杂性疾病的分子诊断 阶梯式遗传学疾病阶梯式遗传学疾病分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断 表观遗传学改变表观遗传学改变分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断Classical genetics分子诊断学复杂性
16、疾病的分子诊断表观遗传学表观遗传学研究不涉及研究不涉及DNA序列改变的基因表达序列改变的基因表达和调控的可遗传变化的，或者说是研究和调控的可遗传变化的，或者说是研究从基因演绎为表型的过程和机制的一门从基因演绎为表型的过程和机制的一门新兴的遗传学分支。新兴的遗传学分支。分子诊断学复杂性疾病的分子诊断表观遗传表观遗传所谓表观遗传就是不基于所谓表观遗传就是不基于DNA差异的核酸差异的核酸遗传。即细胞分裂过程中，遗传。即细胞分裂过程中，DNA 序列不变的序列不变的前提下，全基因组的基因表达调控所决定的前提下，全基因组的基因表达调控所决定的表型遗传，涉及染色质重编程、整体的基因表型遗传，涉及染色质重编程
17、、整体的基因表达调控（如隔离子，增强子，弱化子，表达调控（如隔离子，增强子，弱化子，DNA甲基化，组蛋白修饰等功能甲基化，组蛋白修饰等功能),及基因型及基因型对表型的决定作用。对表型的决定作用。分子诊断学复杂性疾病的分子诊断 表观遗传学的表观遗传学的研究内容研究内容：l 基因转录后的调控基因转录后的调控u基因组中非编码基因组中非编码RNAu微小微小RNA（miRNA）u反义反义RNAu内含子、核糖开关等内含子、核糖开关等l 基因选择性转录表达基因选择性转录表达的调控的调控uDNA甲基化甲基化u基因印迹基因印迹u组蛋白共价修饰组蛋白共价修饰u染色质重塑染色质重塑分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子
18、诊断学复杂性疾病的分子诊断组蛋白修饰组蛋白修饰2染色质重塑染色质重塑3RNA 调调 控控4DNA 甲基化甲基化1分子诊断学复杂性疾病的分子诊断DNA甲基化甲基化(methylation)分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断DNA甲基化一般与基因的沉默甲基化一般与基因的沉默(gene s i l e n c e)相 关，非 甲 基 化相 关，非 甲 基 化(n o n-methylation)一般则与基因的活化一般则与基因的活化(gene a c t i v a t i o n)相 关，而 去 甲 基 化相 关，而 去 甲 基 化(demethylation)往往是与一个
19、沉默基因往往是与一个沉默基因的重新激活的重新激活(reactivation)相关相关分子诊断学复杂性疾病的分子诊断DNA甲基化对维持染色体的结构具有重甲基化对维持染色体的结构具有重要作用，并且与要作用，并且与X染色体的失活、基因染色体的失活、基因印迹和肿瘤的发生密切相关。印迹和肿瘤的发生密切相关。分子诊断学复杂性疾病的分子诊断 基因变异基因变异分子诊断学复杂性疾病的分子诊断基因异常表达基因异常表达 肿瘤肿瘤因此可以将特定肿瘤的基因表达标记，应用到因此可以将特定肿瘤的基因表达标记，应用到肿瘤诊断、分型和对治疗反应性的预测当中。肿瘤诊断、分型和对治疗反应性的预测当中。癌基因（癌基因（oncogen
20、e）：能引起细胞恶性转化）：能引起细胞恶性转化的基因的基因 原癌基因（原癌基因（pro-oncogene）或细胞癌基因）或细胞癌基因（c-onc）分子诊断学复杂性疾病的分子诊断按照癌基因编码蛋白的结构和功能及其在细胞按照癌基因编码蛋白的结构和功能及其在细胞内的定位，内的定位，癌基因可以分为五大类：癌基因可以分为五大类：生长因子类生长因子类 酪氨酸激酶类酪氨酸激酶类 GTP结合蛋白类结合蛋白类 核蛋白类核蛋白类 端粒酶（端粒酶（telomerase）P264分子诊断学复杂性疾病的分子诊断癌基因的活化机制：癌基因的活化机制：转导：漫长的生物进化过程中，正常基因整合转导：漫长的生物进化过程中，正常基
21、因整合癌基因癌基因 点突变点突变 插入突变插入突变 易位易位 基因扩增基因扩增 基因甲基化改变基因甲基化改变分子诊断学复杂性疾病的分子诊断抑癌基因：抑癌基因：一对等位基因由于其功能的丧失，从而使细一对等位基因由于其功能的丧失，从而使细胞过度生长增殖，导致肿瘤形成。这一对等位胞过度生长增殖，导致肿瘤形成。这一对等位基因即为抑癌基因。基因即为抑癌基因。主要包括两个方面：主要包括两个方面：抑癌基因必须是抑癌基因必须是一对等位基因同时是失活的；一对等位基因同时是失活的；wild-type导入到肿瘤细胞，体外培养可以抑制导入到肿瘤细胞，体外培养可以抑制细胞增殖细胞增殖分子诊断学复杂性疾病的分子诊断常见的
22、抑癌基因：常见的抑癌基因：Rb基因、基因、p53基因、基因、APC基因、基因、BRCA1基因、基因、WT1基因、基因、erbA基因、基因、INK4基因、基因、p21clip1基基因因分子诊断学复杂性疾病的分子诊断 基因变异基因变异 DNA损伤及其分子改变损伤及其分子改变 基因组不稳定性基因组不稳定性 染色体异常染色体异常 微卫星不稳定性微卫星不稳定性分子诊断学复杂性疾病的分子诊断 肿瘤早期诊断的策略：肿瘤早期诊断的策略：考虑因素：考虑因素：特殊类型肿瘤的靶基因；特殊类型肿瘤的靶基因；不同肿瘤特定靶基因的突变谱；不同肿瘤特定靶基因的突变谱；共检测使用的合适样本；共检测使用的合适样本；分子诊断技术
23、的敏感性分子诊断技术的敏感性分子诊断学复杂性疾病的分子诊断检测标本的选择：多选择含有患者肿瘤细胞来检测标本的选择：多选择含有患者肿瘤细胞来源基因信息的体液、分泌物或排泄物作为临床肿源基因信息的体液、分泌物或排泄物作为临床肿瘤分子诊断的检测样本，如血、痰及大便等瘤分子诊断的检测样本，如血、痰及大便等检测样本的处理：检测样本的处理：重复离心法：重复离心法：EDTA抗凝血抗凝血4 1500r/min centrifuge 20min 上层血浆上层血浆3000r/min centrifuge 10min，吸取上清，弃去沉淀，得到，吸取上清，弃去沉淀，得到的液体即为无细胞血浆，置的液体即为无细胞血浆，置
24、-70 保存备用保存备用分子诊断学复杂性疾病的分子诊断 蛋白酶蛋白酶K-酚酚/氯仿抽提法氯仿抽提法 磁珠法磁珠法 QIAamp DNA mini kit(超链接超链接)分子诊断学复杂性疾病的分子诊断肺癌的早期分子检测：肺癌的早期分子检测：甲基化特异性引物基因扩增（甲基化特异性引物基因扩增（methylation specific PCR,MSP）、甲基化特异性序列分）、甲基化特异性序列分析（析（methylation specific sequencing,MSS）分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断分子诊断学复杂性疾病的分子诊断2023-1-28分子诊断学复杂性疾病的分子诊断
