1、生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程原料液原料液细胞分离细胞分离(离心，过滤离心，过滤)细胞胞内产物细胞胞内产物路线一路线一路线二路线二细胞破碎细胞破碎碎片分离碎片分离路线一路线一A A路线一路线一B B清液胞外产物清液胞外产物粗分离粗分离(沉淀沉淀/超过滤超过滤/萃取萃取)纯化纯化(层析、离子交换、吸附层析、离子交换、吸附)脱盐脱盐(凝胶过滤、超滤凝胶过滤、超滤)浓缩浓缩(超滤超滤)精制精制(结晶、干燥结晶、干燥)包含体包含体溶解溶解(加盐酸胍、脲加盐酸胍、脲)复性复性p第一节第一节 沉淀法概述沉淀法概述p第二节第二节 盐析法盐析法p第三节第三节 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法p第四节
2、第四节 等电点沉淀法等电点沉淀法p第五节第五节 其他沉淀方法其他沉淀方法p第六节第六节 沉淀法应用沉淀法应用本章主要内容本章主要内容一、沉淀法的概念一、沉淀法的概念(利用利用沉析剂沉析剂使生化物质在溶液中的使生化物质在溶液中的溶溶解度降低解度降低而形成而形成无定形固体无定形固体沉淀的过沉淀的过程。程。第一节第一节 概述概述二、沉淀法的目的二、沉淀法的目的(浓缩；浓缩；(有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步纯化初步纯化 ；(将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。进一步处理。沉淀法是最古老的分离和
3、纯化生物物质的方法，沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。三、沉淀法操作步骤三、沉淀法操作步骤首先加入沉淀剂；首先加入沉淀剂；沉淀剂的陈化，促进粒子生长；沉淀剂的陈化，促进粒子生长；离心或过滤，收集沉淀物。离心或过滤，收集沉淀物。四、沉淀生成动力学四、沉淀生成动力学溶解度降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定溶解度降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚并作用。通常认为相以后，分子互相碰撞并产生聚并作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：互碰撞由下面几种运动引起：热运动，热运动，Bromnia
4、nBromnian运动；运动；对流运动，由机械搅拌产生；对流运动，由机械搅拌产生；差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。为了简化沉淀过程动力学，可把沉淀过程为了简化沉淀过程动力学，可把沉淀过程分成下述个步骤：分成下述个步骤：n(1)(1)初始混合初始混合n(2)(2)新相生成新相生成n(3)(3)布朗运动凝集布朗运动凝集n(4)(4)机械碰撞凝集机械碰撞凝集n(5)(5)聚集体陈化聚集体陈化n(6)(6)聚集体沉淀聚集体沉淀沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产，是分离纯化生物且易
5、于放大，也广泛用于生产，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。l优点：操作简单、经济、浓缩倍数高优点：操作简单、经济、浓缩倍数高l缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强性不强五、沉淀法的特点五、沉淀法的特点六、沉淀法的分类六、沉淀法的分类根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：（1 1）盐析法；）盐析法；（2 2）等电点沉淀法；）等电点沉淀法；（3 3）有机溶剂沉淀法；）有机溶剂沉淀法；（4 4）非离子型聚合物沉淀法；）非离子型聚合物沉淀法
6、；（5 5）聚电解质沉淀法；）聚电解质沉淀法；（6 6）复合盐沉淀法等）复合盐沉淀法等（7 7）亲和沉淀法）亲和沉淀法（8 8）选择性沉淀法。）选择性沉淀法。七、蛋白质的溶解特性七、蛋白质的溶解特性n在水溶液中，疏水残基具有向内部折叠的趋势，在水溶液中，疏水残基具有向内部折叠的趋势，部分暴露在外表面，形成部分暴露在外表面，形成疏水区疏水区。疏水性氨基酸疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。n亲水残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。亲水残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。n因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷
7、电基团形成荷电区、亲水区和疏水区荷电区、亲水区和疏水区构成。构成。u1、蛋白质周围的水、蛋白质周围的水化层化层（hydration shell)，保护了蛋白保护了蛋白质粒子，避免了相互质粒子，避免了相互碰撞，碰撞，使蛋白质形成使蛋白质形成稳定的胶体溶液。稳定的胶体溶液。u2、蛋白质分子、蛋白质分子间静电排斥作用。间静电排斥作用。蛋白质表面的电蛋白质表面的电荷与溶液中反离荷与溶液中反离子的电荷构成双子的电荷构成双电层。电层。第二节第二节 盐析盐析Salt induced precipitation一、盐析的概念一、盐析的概念在在高浓度的中性盐高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生存在下，蛋白质（
8、酶）等生物大分子物质在水溶液中的物大分子物质在水溶液中的溶解度降低溶解度降低，产生，产生沉淀的过程。沉淀的过程。盐析是可逆的，而变性是不可逆的。盐析是可逆的，而变性是不可逆的。二、盐析法机理二、盐析法机理（1 1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2 2）破坏水化膜，暴露出憎水区域破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水
9、由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。易沉淀。（3 3）中和电荷，减少静电斥力中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。沉淀。中性盐中性盐盐析法机理示意图盐析法机理示意图三、盐析过程三、盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：种情况：（1）“盐溶盐溶”现象现象(sal
10、t-in)低盐浓度下，增加蛋低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大。（2）“盐析盐析”现象现象(salt-out)高盐浓度下，中和高盐浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降。l盐析作用要强盐析作用要强l盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐需有较大的溶解度l盐析用盐必须是惰性的盐析用盐必须是惰性的l来源丰富、经济来源丰富、经济四、影响盐析的因素四、影响盐析的因素1、盐析用盐的选择、盐析用盐的选择p在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异
11、，一般的规律为：一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱。用较强，半径大的低价离子作用较弱。p柠檬酸柠檬酸PO43-SO42-CH3COO-Cl-NO3-SCN-pNH4+K+Na+高价阳离子高价阳离子p阴离子的影响大于阳离子。阴离子的影响大于阳离子。盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂。u（1 1）价廉；）价廉；u（2 2）溶解度大；）溶解度大；u（3 3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好；）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好；u（4 4）不易引起蛋白质变性。）不易引起蛋白质变性。缺点：缺点：
12、（1）水解变酸；）水解变酸；（2）高）高pH 释氨，腐蚀；释氨，腐蚀；（3）残留产品有影响。）残留产品有影响。由下表可以看到，硫铵在由下表可以看到，硫铵在0 0时的溶解度，远远高时的溶解度，远远高于其它盐类：于其它盐类：几种盐在不同温度下的溶解度（克几种盐在不同温度下的溶解度（克/100/100毫升水）毫升水）0 20 80 100 0 20 80 100 （NHNH4 4)2 2SOSO4 4 70.6 75.4 95.3 103 70.6 75.4 95.3 103 Na Na2 2SOSO4 4 4.9 18.9 43.3 42.2 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH NaH2
13、 2POPO4 4 1.6 7.8 93.8 101 1.6 7.8 93.8 1011 1）加入固体盐法）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；的情况；速度不能太快，分批加入。搅拌需适中。速度不能太快，分批加入。搅拌需适中。2 2）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法 用于饱和度不高而原来溶液体积不大用于饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；的情况；可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。3 3）透析平衡法）透析平衡法 优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但
14、程序烦琐，故多用于结晶。效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。硫酸铵的加入有以下几种方法：硫酸铵的加入有以下几种方法：u一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。低。u在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。子强度顺次进行。u每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。使另一种蛋白质组分盐析出来。u组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐组成相近的蛋白质，分子
15、量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。沉淀。2、盐浓度对盐析效果的影响、盐浓度对盐析效果的影响 S=-S=-s sS S蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度，g/L;g/L;I I离子强度，离子强度，I=1/2mI=1/2mi iz zi i2 2 m mi i离子离子i i的摩尔浓度；的摩尔浓度；ZiZi所带电荷所带电荷常数，图中常数，图中截距截距KsKs盐析常数，图中直线斜率盐析常数，图中直线斜率CohnCohn经验式经验式蛋白质溶解度与盐浓度的关系蛋白质溶解度与盐浓度的关系和和Ks的物理意义的物理意义p代表截距，即当离子强度为零
16、，也就是代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。纯水中的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、与蛋白质种类、温度、温度、pHpH值有关，与盐无关；值有关，与盐无关；pKsKs盐析常数，代表图中直线的斜率；盐析常数，代表图中直线的斜率；KsKs与温与温度和度和pHpH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但这种变化不大。这种变化不大。用盐析法分离蛋白质的二种方法用盐析法分离蛋白质的二种方法第一类叫第一类叫Ks分段盐析法，分段盐析法，在一定在一定pH和温度下通和温度下通过改变离子强度实现，（固定过改变离子强度实现，（固定pH，温度，温度，改变改变盐浓度盐浓
17、度），），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液。用于早期的粗提液。第二种叫第二种叫分段盐析法，分段盐析法，在一定离子强度下通过在一定离子强度下通过改变改变PH和温度来实现，（固定离子强度，和温度来实现，（固定离子强度，改变改变pH及温度及温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化和结晶。离纯化和结晶。盐析用盐量的确定盐析用盐量的确定-饱和度饱和度（Saturation）：u以硫酸铵为例：以硫酸
18、铵为例：25时，硫酸铵的饱和溶解度时，硫酸铵的饱和溶解度是是767g/L定义为定义为100%饱和度。饱和度。u对多数蛋白质，当达到对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度饱和度时，溶解度都小于都小于 0.1 mg/L，通常为兼顾收率与纯度，饱，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在和度的操作范围在40%-60%之间。之间。原蛋白溶液体积为原蛋白溶液体积为V V，欲使其硫铵饱和度达到，欲使其硫铵饱和度达到S S，需加入饱和硫酸铵溶液的体积数？需加入饱和硫酸铵溶液的体积数？X=VX=VS/(1-S)S/(1-S)X X：应加入的饱和硫铵溶液的体积：应加入的饱和硫铵溶液的体积 V V：原蛋白质的
19、溶液的体积：原蛋白质的溶液的体积 S S：应达到的硫铵饱和度：应达到的硫铵饱和度原蛋白溶液饱和度为原蛋白溶液饱和度为S S1 1，现饱和度增加为，现饱和度增加为S S2 2，需加，需加入多少饱和硫酸铵溶液入多少饱和硫酸铵溶液?X=V X=V(S(S2 2-S-S1 1)/(1-S)/(1-S2 2)X X：应加入的饱和硫铵体积：应加入的饱和硫铵体积 V V：原有溶液的体积：原有溶液的体积 S S：原溶液硫铵的饱和度：原溶液硫铵的饱和度 S S：要达到的硫铵的饱和度：要达到的硫铵的饱和度加固体硫铵的方法加固体硫铵的方法加饱和硫铵溶液会使加饱和硫铵溶液会使溶液体积增大或使蛋白质浓溶液体积增大或使蛋
20、白质浓度降低度降低，因此加入固体硫铵比较适合。，因此加入固体硫铵比较适合。在在20 时使时使1L M1摩尔浓度时（摩尔浓度时（NH4）2SO4溶液增溶液增至至M2摩尔浓度，所需加入（摩尔浓度，所需加入（NH4）2SO4的克数的克数C：C=533C=533（M M-M-M）/(4.05-0.3M/(4.05-0.3M2 2)C：需加硫铵的g数 M：原溶液的浓度摩尔数M：需达到的浓度摩尔数在在20 时使时使1L S1饱和度时（饱和度时（NH4）2SO4溶液增至溶液增至S2饱和度，所需加入（饱和度，所需加入（NH4）2SO4的克数：的克数：C=533（S2-S1）/(100-0.3S2)C：需加硫铵
21、的：需加硫铵的g数数 S1：原溶液的饱和度：原溶液的饱和度 S2：需达到的饱和度：需达到的饱和度以上数据都可在有关书上查到以上数据都可在有关书上查到 204060800100总蛋白总蛋白目标蛋白质目标蛋白质上清液蛋白浓度上清液蛋白浓度l由于不同的蛋白质溶解度由于不同的蛋白质溶解度不同，沉淀时所需的离子不同，沉淀时所需的离子强度也不相同，强度也不相同，l如果需要先除去些杂蛋白，如果需要先除去些杂蛋白，然后在较高的饱和度下，然后在较高的饱和度下，沉淀目标蛋白质，则可采沉淀目标蛋白质，则可采用分段盐析改变盐的浓度，用分段盐析改变盐的浓度，可将混合液中的蛋白质分可将混合液中的蛋白质分批盐析分开。批盐析
22、分开。分段盐析(fractional salting out)在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和度达在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和度达35时，尿素酶基本上仍留在溶液中；而饱和度时，尿素酶基本上仍留在溶液中；而饱和度达达55%时，尿素酶几乎全都沉淀出来。时，尿素酶几乎全都沉淀出来。3、pH值值u一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。解度最小。u为提高盐析效率，多将溶液为提高盐析效率，多将溶液pH值调到目的蛋值调到目的蛋白的等电点处。白的等电点处。在进
23、行盐析时，必在进行盐析时，必须控制须控制pH图中直线都相互平图中直线都相互平行行4、温度的影响、温度的影响u在低离子强度或纯水中，蛋白在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度随温度增加而增加。质溶解度随温度增加而增加。u但在高浓度下，溶解度随温度但在高浓度下，溶解度随温度上升而下降。上升而下降。u在一般情况下，蛋白质对盐析在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在感的酶要求在0-4进行。进行。u随温度升高减小，热促失水随温度升高减小，热促失水膜膜uKs不随温度而变不随温度而变 5、蛋白质浓度、蛋白质浓
24、度 沉淀蛋白质盐的浓度范围并不固定，而和起始浓度有关。沉淀蛋白质盐的浓度范围并不固定，而和起始浓度有关。Z高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。Z在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会降低。作用比较少，但回收率会降低。Z分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一点中性盐，
25、使共沉淀作用减至最低限度。Z一般认为一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于的蛋白质浓度比较适中。相当于25 mg/mL30mg/mL。u起始浓度起始浓度30g/L30g/L的的COMbCOMb，大部分蛋白质在，大部分蛋白质在58-6558-65饱和度饱和度沉淀；沉淀；u稀释稀释1010倍的倍的COMbCOMb溶液，饱和度达到溶液，饱和度达到66%66%才开始沉淀，而相才开始沉淀，而相应的沉淀范围为应的沉淀范围为66-73%66-73%饱和度。饱和度。五、盐析注意事项五、盐析注意事项(选择适宜饱和度(采用分步盐析(盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH用磷酸缓冲液(加盐
26、缓慢均匀，搅拌缓慢，以免局部浓度过高，致酶失活。(盐析后最好缓慢搅拌1h，再在冰浴中放置一段时间。(为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。(盐析蛋白尽快脱盐处理，以免变性，透析慢，用超滤。盐析注意事项盐析注意事项硫酸铵的使用硫酸铵的使用 硫酸铵中含有少量的重金属离子，对巯基敏感，H2S处理 高浓度的硫酸铵呈酸性（pH=5.0左右），用氨水调pH。硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意。固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化已考虑在表中；盐析后一般放置0.5-1h后过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，离心多用于较低浓度硫酸铵溶液。六、盐析法特点六、盐析法特点1.成本低，不需要特别
27、昂贵的设备。成本低，不需要特别昂贵的设备。2.操作简单、安全。操作简单、安全。3.不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。到保持生物活性的纯化蛋白质。4.分离效果不理想，通常只是作为初步的分离分离效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。纯化，还需要结合其它的纯化方法。第三节第三节 等电点沉淀法等电点沉淀法Isoelectric point precipitationn蛋白质属于两性电解质，溶液pH值高，蛋白质带负电；pH值低，带正电。当溶液的pH值为某一值时，蛋白质几乎不带电，即净电荷为零，这时的pH值为
28、等电点，常用pI表示。n两性电解质在溶液中pH处于等电点pI时，分子表面静电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低并沉淀析出。一、等电点沉淀的原理一、等电点沉淀的原理不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。基础可进行分离。pH=pI等电点沉淀法操作十分简便，试剂消耗少，给体等电点沉淀法操作十分简便，试剂消耗少，给体系引入的外来物系引入的外来物(杂质杂质)也少。也少。是一种常用的分离是一种常用的分离纯化方法。纯化方法。收率低：收率低：等电点附近（处）仍有一定的溶解度，等电点附近（处）仍有一定的溶解度，(有
29、时甚至比较大有时甚至比较大)，沉淀不完全。沉淀不完全。等电点沉淀法等电点沉淀法往往不能获得高的回收率。很少单独使用，与盐往往不能获得高的回收率。很少单独使用，与盐析，有机溶剂沉淀等结合使用。析，有机溶剂沉淀等结合使用。二、等电点沉淀的特点二、等电点沉淀的特点分辨率较低：许多分子的等电点比较接近，容易分辨率较低：许多分子的等电点比较接近，容易共沉淀，分辨率较低。共沉淀，分辨率较低。主要用于去杂蛋白。主要用于去杂蛋白。n最大缺点：最大缺点：无机酸有引起较大的蛋白质不可逆变无机酸有引起较大的蛋白质不可逆变性的危险。性的危险。三、等电点沉淀注意事项三、等电点沉淀注意事项(1)生物高分子的等电点易受盐离
30、子的影响发生生物高分子的等电点易受盐离子的影响发生变化。变化。p由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生发生“漂移漂移”。p阳阳-高，阴高，阴-低。低。(2)目的物的稳定性。目的物的稳定性。有些蛋白质或酶在等电点附近不稳定。如有些蛋白质或酶在等电点附近不稳定。如-糜蛋糜蛋白酶白酶(pI=8.18.6)，胰蛋白酶，胰蛋白酶(pI=10.1)，它们在，它们在中性或偏碱的环境中由于自身或其他蛋白水解酶中性或偏碱的环境中由于自身或其他蛋白水解酶的作用而部分降解失活。的作用而部分降解失活。(3)生物大分子在等电点附近盐溶作用很明显。生物大分子在等电点附近盐溶作
31、用很明显。单独使用或与溶剂沉淀法合用，控制离子强度。单独使用或与溶剂沉淀法合用，控制离子强度。第四节第四节 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法organic sovent precipitationl在含有溶质的水溶液中加入一定量在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的亲水的有机溶有机溶剂，剂，降低溶质的溶解度降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。，使其沉淀析出。l有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。的沉淀方法之一。一、有机溶剂沉淀法的概念一、有机溶剂沉淀法的概念
32、 许多能与水互溶许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下常用于低盐浓度下沉淀蛋白质沉淀蛋白质。pH4.8时人白蛋白在乙醇时人白蛋白在乙醇-水溶液中的溶解度水溶液中的溶解度二、有机溶剂沉淀的特点二、有机溶剂沉淀的特点1 1、优点、优点l1 1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；l2 2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易。）沉淀不用脱盐，过滤较为容易。2 2、缺点、缺点1 1）对生物活性大分子容易引起变性失活；）对生物活性大分子容易引起变性失活
33、；2 2）操作要求在低温下进行。）操作要求在低温下进行。3 3）成本高。）成本高。l总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。盐析法普遍。三、有机溶剂沉淀法机理三、有机溶剂沉淀法机理 *A 降低溶剂介电常数降低溶剂介电常数（介电常数（介电常数D有机有机 D水）水），减小溶剂极性，削弱溶剂分子与蛋白质分子间的减小溶剂极性，削弱溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加带电粒子间的作用力，因相互相互作用力，增加带电粒子间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。吸引而聚合沉淀。*B 破坏水化膜：破坏水化膜：使用的有机溶剂与水互溶，从蛋使用的有机溶剂与水互溶，从
34、蛋白质分子周围的水化层中夺走水分子，降低蛋白白质分子周围的水化层中夺走水分子，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。蛋白质沉淀。*C 相反力：相反力：疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层。结合形成疏水层。有机溶剂沉淀法机理有机溶剂沉淀法机理降低介电常数破坏水化膜四、常用的有机溶剂沉析剂四、常用的有机溶剂沉析剂1、选择依据、选择依据(水溶性要好，一般与水无限混溶。水溶性要好，一般与水无限混溶。(沉淀作用要强，介电常数要小。沉淀作用要强，介电常数要小。(致变性作用要小。致变性作用要小。(毒性
35、要小、挥发性适中。沸点过低有利于除去和毒性要小、挥发性适中。沸点过低有利于除去和回收，但挥发损失较大，且不安全。给劳动保护回收，但挥发损失较大，且不安全。给劳动保护及安全生产带来麻烦。及安全生产带来麻烦。(容易获取。容易获取。2、常用的有机溶剂沉淀剂、常用的有机溶剂沉淀剂p沉淀蛋白质和酶常用的是沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮乙醇、甲醇和丙酮。p沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇乙醇。p乙醇是最常用的沉淀剂乙醇是最常用的沉淀剂。3、有机溶剂沉淀剂的特点、有机溶剂沉淀剂的特点(乙醇：乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，用于沉析作用强，挥发性适中
36、，无毒，用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析。蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析。(丙酮丙酮：沉析作用大于乙醇，用量小。代替乙醇：沉析作用大于乙醇，用量小。代替乙醇可减少用量可减少用量1/4-1/3，但沸点低、挥发大、着，但沸点低、挥发大、着火点低、对肝脏有一定毒性。应用范围不广。火点低、对肝脏有一定毒性。应用范围不广。(甲醇：甲醇：沉析作用与乙醇相当，对蛋白质的变性沉析作用与乙醇相当，对蛋白质的变性作用比乙醇和丙酮都小，但口服有强毒，限制作用比乙醇和丙酮都小，但口服有强毒，限制了使用。了使用。不同溶质的介电常数不同溶质的介电常数水水 8020乙醇乙醇 7040乙醇乙醇 6060乙醇乙醇
37、 48100乙醇乙醇 242.5mol/L甘氨酸甘氨酸 1375 mol/L尿素尿素 91丙酮丙酮 22甲醇甲醇 33(2.5mol/L甘氨酸的介电常数很大，可以用作蛋白甘氨酸的介电常数很大，可以用作蛋白质等生物高分子溶液的稳定剂。质等生物高分子溶液的稳定剂。五、溶剂浓度的计算五、溶剂浓度的计算 V=V0(S2-S1)/(100-S2)V-V-需加入的有机溶剂的体积；需加入的有机溶剂的体积；V Vo o-原溶液体积；原溶液体积；S S1 1-原溶液中有机溶剂的浓度；原溶液中有机溶剂的浓度；S S2 2-需达到的有机溶剂的浓度；需达到的有机溶剂的浓度；该公式该公式未考虑混合后体积的变化未考虑混合
38、后体积的变化，实际上等体积的乙醇和水相，实际上等体积的乙醇和水相混后体积会缩小混后体积会缩小5，如此的体积变化对大多数工作影响不大，如此的体积变化对大多数工作影响不大，在有精确要求的场合可按摩尔比计算，这样可将体积变化因素在有精确要求的场合可按摩尔比计算，这样可将体积变化因素抵消。抵消。1、温度、温度p低温有利于防止溶质变性；低温有利于防止溶质变性；有机溶剂与水混合产有机溶剂与水混合产热，体系温度升高，蛋白质变性。因此，热，体系温度升高，蛋白质变性。因此，务必要务必要控制在低温下。控制在低温下。p低温提高收率（温度越低，溶解度越小）。低温提高收率（温度越低，溶解度越小）。p有的情况下，把沉淀后
39、清液的温度降低可沉淀出有的情况下，把沉淀后清液的温度降低可沉淀出另一种产品，这就是另一种产品，这就是温差分级沉淀。温差分级沉淀。六、有机溶剂沉淀法的影响因素六、有机溶剂沉淀法的影响因素A A、预冷、预冷：将溶液和有机溶剂分别预冷。后者最好预：将溶液和有机溶剂分别预冷。后者最好预冷至冷至-10-10-20-20，操作时应不断搅拌。，操作时应不断搅拌。搅拌一方面是散热，另一方面防止溶剂局部过浓引搅拌一方面是散热，另一方面防止溶剂局部过浓引起的变性和分辨率下降。溶剂的加入速度也须控制，起的变性和分辨率下降。溶剂的加入速度也须控制，不宜太快。不宜太快。B B、短时间的老化处理：、短时间的老化处理：为减
40、少溶剂的变性作用，通为减少溶剂的变性作用，通常使沉淀在低温下作短时间的老化处理（常使沉淀在低温下作短时间的老化处理（0.5-2h0.5-2h）即离心分离，减少有机溶剂与目的产物的接触。即离心分离，减少有机溶剂与目的产物的接触。控制温度的具体做法：控制温度的具体做法：2、pHp适宜的适宜的pH提高产品的收率和分辨率。提高产品的收率和分辨率。p许多蛋白质在等电点附近有较好的沉淀效果，但不是所有的蛋白质，少数蛋白质等电点附近不稳定。p注意：使溶液中大多数蛋白质带相同电荷，不要使溶液中大多数蛋白质带相同电荷，不要让目的物与主要杂质分子带相反电荷，以致出现让目的物与主要杂质分子带相反电荷，以致出现较严重
41、的共沉作用。较严重的共沉作用。3、离子强度、离子强度 n较低离子强度有利于沉淀，保护蛋白质，防止变较低离子强度有利于沉淀，保护蛋白质，防止变性，减少水和溶剂相互溶解及稳定介质性，减少水和溶剂相互溶解及稳定介质pH。n离子强度离子强度0.01-0.05mol/L，不超过，不超过5%。n离子强度过高溶剂用量大，沉淀物还夹带盐多。离子强度过高溶剂用量大，沉淀物还夹带盐多。4、样品浓度、样品浓度n样品稀增加溶剂投入量和损耗，降低溶质收率，样品稀增加溶剂投入量和损耗，降低溶质收率，易产生稀释变性，但共沉作用小，分离效果好。易产生稀释变性，但共沉作用小，分离效果好。n浓的样品增强共沉作用，降低分辨率，减少
42、溶剂浓的样品增强共沉作用，降低分辨率，减少溶剂用量，但回收率提高，变性的危险性小。用量，但回收率提高，变性的危险性小。n蛋白质的初浓度蛋白质的初浓度0.5%2%，粘多糖则，粘多糖则1%2%。5、金属离子助沉作用、金属离子助沉作用n一些金属离子如一些金属离子如Zn2+，Ca2+等可与呈阴离子状态的等可与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物。蛋白质形成复合物。n复合物的溶解度降低不影响活性，有利于沉淀，降复合物的溶解度降低不影响活性，有利于沉淀，降低溶剂耗量。低溶剂耗量。n0.005-0.02mol/L的的Zn2+可减少溶剂用量可减少溶剂用量l/3-1/2，要，要避免与金属离子形成难溶盐的阴离子的存在避
43、免与金属离子形成难溶盐的阴离子的存在(如磷如磷酸根酸根)。第五节第五节 其他沉淀法其他沉淀法在生化制备中经常使用的沉淀方法还有成在生化制备中经常使用的沉淀方法还有成盐沉淀法、变性沉淀法和共沉淀法。所使用的盐沉淀法、变性沉淀法和共沉淀法。所使用的沉淀剂有金属盐、有机酸类、表面活性剂、离沉淀剂有金属盐、有机酸类、表面活性剂、离子型或非离子型的多聚物、变性剂或其他一些子型或非离子型的多聚物、变性剂或其他一些化合物。化合物。1、概述、概述n非离子多聚物非离子多聚物20世纪世纪60年代发展，最早用于提纯年代发展，最早用于提纯免疫球蛋白免疫球蛋白(IgG)和沉淀一些细菌与病毒，近年用和沉淀一些细菌与病毒，
44、近年用于核酸和酶的分离纯化。于核酸和酶的分离纯化。n聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）、壬苯乙烯化氧（）、壬苯乙烯化氧（NPEO）、）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯。葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯。一、非离子型聚合物一、非离子型聚合物2、常用的非离子型聚合物、常用的非离子型聚合物聚乙二醇聚乙二醇n结构式：结构式：HO-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OHn相对分子质量从相对分子质量从200D到到20KDa的的产品都有效。的的产品都有效。n通常使用通常使用PEG-6000或或PEG-4000。3、PEG沉淀蛋白质的特点沉淀蛋白质的特点优点：优点：1、室温；、室温；2、沉淀的颗粒大，产物容易收集；、沉淀的颗
45、粒大，产物容易收集；3、非但不使蛋白质变性，而且提高稳定性。、非但不使蛋白质变性，而且提高稳定性。缺点：缺点：1、难去除，需用超滤和液液萃取。、难去除，需用超滤和液液萃取。2、价格较昂贵。、价格较昂贵。（1）两种水溶性非离子多聚物组成液）两种水溶性非离子多聚物组成液-液两相系统。液两相系统。n生物大分子或微粒在两相系统不等量分配而分离。生物大分子或微粒在两相系统不等量分配而分离。n主要基于不同生物分子和微粒表面结构不同，有不主要基于不同生物分子和微粒表面结构不同，有不同分配系数。同分配系数。n并外加离子强度，并外加离子强度，pH值和温度等因素的影响，增值和温度等因素的影响，增强分离效果。强分离
46、效果。4、非离子多聚物沉淀生物大分子和微粒的方法、非离子多聚物沉淀生物大分子和微粒的方法（2）选用一种水溶性非离子多聚物）选用一种水溶性非离子多聚物。n生物大分子或微粒在同一液相，由于被排斥相互生物大分子或微粒在同一液相，由于被排斥相互凝集而沉淀析出。凝集而沉淀析出。n先离心除去粗大悬浮颗粒，调整溶液先离心除去粗大悬浮颗粒，调整溶液pH值和温值和温度，加入中性盐和多聚物至一定浓度，冷贮一段度，加入中性盐和多聚物至一定浓度，冷贮一段时间，即形成沉淀。时间，即形成沉淀。蛋白质浓度对用蛋白质浓度对用PEG6000沉淀酵母醇脱氢酶时的影响沉淀酵母醇脱氢酶时的影响吸附法吸附法乙醇沉淀法乙醇沉淀法盐析法盐
47、析法5、沉淀中杂质的去除、沉淀中杂质的去除吸附法吸附法沉淀物溶于沉淀物溶于磷酸缓冲液磷酸缓冲液用用DEAE-纤维素纤维素离子交换剂吸附离子交换剂吸附蛋白质蛋白质蛋白质再用蛋白质再用KCl洗脱洗脱透析脱盐透析脱盐PEG不被吸不被吸附而除去附而除去乙醇沉淀法乙醇沉淀法沉淀物溶于沉淀物溶于磷酸缓冲液磷酸缓冲液用用20%乙醇乙醇沉淀蛋白质沉淀蛋白质离心（离心（PEG留留在上清液）在上清液）盐析法盐析法沉淀物溶于沉淀物溶于磷酸缓冲液磷酸缓冲液用用35%硫酸铵硫酸铵沉淀蛋白质沉淀蛋白质PEG留在留在上清液上清液二、聚电解质沉淀二、聚电解质沉淀n聚电解质是含有聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚合物重复离
48、子化基团的水溶性聚合物。可用于蛋白质沉淀的聚电解质有可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、聚乙烯聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等。等。n蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成多分蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成多分子络合物发生沉淀。子络合物发生沉淀。p高分子量聚电解质沉淀高分子量聚电解质沉淀架桥机理架桥机理p低分子量聚电解质沉淀低分子量聚电解质沉淀电荷中和作用电荷中和作用。p聚电解质过量，导致聚电解质过量，导致蛋白质重新溶剂化蛋白质重新溶剂化。三、成盐类复合物沉淀三、成盐类复合物沉淀此类沉析剂有以下三种：此类沉析剂有以下三种：
49、（1）高价金属盐：高价金属盐：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+与酸性基团结合；与酸性基团结合；（2）苦味酸盐、单宁酸盐、苦酮酸盐等，苦味酸盐、单宁酸盐、苦酮酸盐等，与碱性基团结合与碱性基团结合（3）无机复合盐：无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等磷钨酸盐、磷钼酸盐等n缺点：缺点：容易导致活性蛋白的容易导致活性蛋白的不可逆变性不可逆变性，需采用较温和需采用较温和的条件，有时还需加一定的稳定剂。的条件，有时还需加一定的稳定剂。、金属离子沉淀、金属离子沉淀n金属离子与蛋白质分子中的特殊部位反应。例如锌易与组氨酸残基中咪唑基结合，从而降低蛋白质的溶解度。Zn2+用于沉淀杆菌肽、尿激酶和胰岛素。用于沉
50、淀杆菌肽、尿激酶和胰岛素。Ca2+（CaCO3）分离乳酸，血清蛋白和柠檬酸。）分离乳酸，血清蛋白和柠檬酸。硫酸钡在柠檬酸生产中去除重金属。硫酸钡在柠檬酸生产中去除重金属。MgSO4用以去除用以去除DNA和其他核酸。和其他核酸。金属离子沉淀蛋白质金属离子沉淀蛋白质n能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子，如：结合的一些金属离子，如：MnMn2+2+、FeFe2+2+、o o2+2+、NiNi2+2+、u u2+2+、ZnZn2+2+、CdCd2+2+;n能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子，能与羧酸结合而不与含
