1、目目 录录第第 十十 章章三羧酸循环三羧酸循环Tricarboxylic Acid Cycle目目 录录第第 一一 节节 三羧酸循环的发现三羧酸循环的发现目目 录录糖原糖原 三酯酰甘油三酯酰甘油 蛋白质蛋白质 葡萄糖葡萄糖 脂酸脂酸+甘油甘油 氨基酸氨基酸 乙酰乙酰CoA TCA循环循环 呼吸链呼吸链 ADP+Pi ATP 一、三羧酸循环是三类营养物质氧化分一、三羧酸循环是三类营养物质氧化分解的（共同）第二阶段解的（共同）第二阶段目目 录录n在真核生物，在真核生物，TCA循环在循环在线粒体线粒体中进行，中进行，与呼吸链在功能和结构上相偶联。与呼吸链在功能和结构上相偶联。目目 录录三羧酸循环三羧
2、酸循环亦称柠檬酸循亦称柠檬酸循环（环（citric acid cycle），这是），这是因为循环反应中的第一个中间因为循环反应中的第一个中间产物是一个含三个羧基的柠檬产物是一个含三个羧基的柠檬酸。由于酸。由于Krebs正式提出了三正式提出了三羧酸循环的学说，故此循环又羧酸循环的学说，故此循环又称为称为Krebs循环。循环。目目 录录n1937年，年，Hans Krebs利用鸽子胸肌（这块肌肉在利用鸽子胸肌（这块肌肉在飞行中有相当高的呼吸频率，因此特别适合于氧飞行中有相当高的呼吸频率，因此特别适合于氧化过程的研究）的组织悬液，测定了在不同的有化过程的研究）的组织悬液，测定了在不同的有机酸作用下，
3、丙酮酸氧化过程中的耗氧率，机酸作用下，丙酮酸氧化过程中的耗氧率，首次首次提出在动物组织中丙酮酸氧化途径的假说提出在动物组织中丙酮酸氧化途径的假说。目目 录录nAlbert Szent-Gyorgyi等已经发现动物肌肉组织中等已经发现动物肌肉组织中某些某些4碳二羧酸（碳二羧酸（琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和草琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和草酰乙酸酰乙酸）能刺激氧的消耗。）能刺激氧的消耗。nKrebs证实了这项发现，并且发现它们也可刺激证实了这项发现，并且发现它们也可刺激丙丙酮酸酮酸的氧化过程。而且他还发现肌肉中丙酮酸的的氧化过程。而且他还发现肌肉中丙酮酸的氧化还可被氧化还可被6碳三羧酸，如碳三羧酸，如柠
4、檬酸、顺乌头酸和异柠檬酸、顺乌头酸和异柠檬酸柠檬酸及及5碳的碳的-酮戊二酸酮戊二酸激活。上述有机酸的激激活。上述有机酸的激活效应是显著的，任何一种这些有机酸的增加，活效应是显著的，任何一种这些有机酸的增加，甚至是很少量的增加都能大大激活丙酮酸的氧化甚至是很少量的增加都能大大激活丙酮酸的氧化过程。过程。目目 录录nKrebs的第二项重大发现是观察到丙二酸对丙酮酸的第二项重大发现是观察到丙二酸对丙酮酸有氧氧化的抑制作用。有氧氧化的抑制作用。n丙二酸是琥珀酸的类似物，是琥珀酸脱氢酶的竞争丙二酸是琥珀酸的类似物，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，在肌肉悬浮液中，无论加入上述哪一种性抑制剂，在肌肉悬浮液中，
5、无论加入上述哪一种有机酸，只要丙二酸存在，丙酮酸的有氧氧化过程有机酸，只要丙二酸存在，丙酮酸的有氧氧化过程就会被抑制。就会被抑制。这表明在涉及丙酮酸氧化的酶促反应这表明在涉及丙酮酸氧化的酶促反应中，琥珀酸和琥珀酸脱氢酶必定是很关键的成分。中，琥珀酸和琥珀酸脱氢酶必定是很关键的成分。nKrebs进一步发现，当用丙二酸去抑制肌肉组织悬进一步发现，当用丙二酸去抑制肌肉组织悬液中的丙酮酸的有氧氧化时，在这个悬液介质中就液中的丙酮酸的有氧氧化时，在这个悬液介质中就会有柠檬酸、会有柠檬酸、-酮戊二酸和琥珀酸的积累，酮戊二酸和琥珀酸的积累，这表明这表明柠檬酸和柠檬酸和-酮戊二酸通常为琥珀酸的前体。酮戊二酸通
6、常为琥珀酸的前体。目目 录录n根据上述实验观察和一些其他的证据，根据上述实验观察和一些其他的证据，Krebs得出得出一个结论：上述有机三羧酸和二羧酸可以以一个一个结论：上述有机三羧酸和二羧酸可以以一个符合化学逻辑的序列排列。因为用丙酮酸和草酰符合化学逻辑的序列排列。因为用丙酮酸和草酰乙酸与肌组织共同孵育，即可导致溶液介质中柠乙酸与肌组织共同孵育，即可导致溶液介质中柠檬酸的堆积，所以檬酸的堆积，所以Krebs推理这一系列反应是以循推理这一系列反应是以循环的方式而不是以线性的方式存在，即它的开始环的方式而不是以线性的方式存在，即它的开始和结尾是连在一起的。和结尾是连在一起的。目目 录录n从这些简单
7、的实验和逻辑推理中，从这些简单的实验和逻辑推理中，Krebs假定他所假定他所称的柠檬酸循环是肌肉中碳水化合物氧化的主要称的柠檬酸循环是肌肉中碳水化合物氧化的主要途径。柠檬酸循环也称途径。柠檬酸循环也称TCA循环，因为在循环，因为在Krebs提出这个循环假说的若干年以后，还不确定柠檬提出这个循环假说的若干年以后，还不确定柠檬酸或者一些其它的三羧酸，例如异柠檬酸是否是酸或者一些其它的三羧酸，例如异柠檬酸是否是由丙酮酸和草酰乙酸反应所形成的第一个产物。由丙酮酸和草酰乙酸反应所形成的第一个产物。自自Krebs提出提出TCA循环的假设后，研究发现该循循环的假设后，研究发现该循环不仅在肌肉组织中起作用，而
8、且在需氧动物和环不仅在肌肉组织中起作用，而且在需氧动物和植物的所有组织中，以及许多需氧微生物中均发植物的所有组织中，以及许多需氧微生物中均发挥着功能。挥着功能。目目 录录nTCA循环最初只是建立在实验基础上的假说。随循环最初只是建立在实验基础上的假说。随后，在体外对参与循环中酶的研究证实并阐明了后，在体外对参与循环中酶的研究证实并阐明了该循环的细节。但是这些酶是否在完整的活细胞该循环的细节。但是这些酶是否在完整的活细胞的循环中真正发挥功能？细胞内该循环的效率是的循环中真正发挥功能？细胞内该循环的效率是否足以解释动物组织中葡萄糖氧化的效率？这些否足以解释动物组织中葡萄糖氧化的效率？这些问题已经通
9、过用同位素标记的代谢物研究（如丙问题已经通过用同位素标记的代谢物研究（如丙酮酸或乙酸酯分子中特定碳原子的酮酸或乙酸酯分子中特定碳原子的13C或或14C标记标记等同位素示踪实验），证实等同位素示踪实验），证实TCA循环确实以很高循环确实以很高的效率在活细胞中存在。现在的效率在活细胞中存在。现在TCA循环已被公认循环已被公认为是营养物分解代谢的必经途径。为是营养物分解代谢的必经途径。目目 录录第第 二二 节节三羧酸循环的反应过程三羧酸循环的反应过程Reactions of Tricarboxylic Acid Cycle Reactions目目 录录nTCA循环是一个由一系列酶促反应构成的循环反循
10、环是一个由一系列酶促反应构成的循环反应系统，在该反应过程中，首先由应系统，在该反应过程中，首先由乙酰乙酰CoA（主（主要来自于三大营养物质的分解代谢）与要来自于三大营养物质的分解代谢）与草酰乙酸草酰乙酸缩合生成含缩合生成含3个羧基的个羧基的柠檬酸柠檬酸（citric acid），再），再经过经过4次脱氢、次脱氢、2次脱羧，生成次脱羧，生成4分子还原当量分子还原当量（reducing equivalent）和）和2分子分子CO2，重新生成，重新生成草酰乙酸草酰乙酸的这一循环反应过程称为的这一循环反应过程称为三羧酸循环三羧酸循环。目目 录录n还原当量（还原当量（reducing equivalen
11、t）一般是指以氢原子或氢离子形式存在的一般是指以氢原子或氢离子形式存在的一个电子或一个电子当量。一个电子或一个电子当量。目目 录录目目 录录（一）乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸 乙酰辅酶A（acetyl CoA）与草酰乙酸（oxaloacetate）缩合成柠檬酸（citrate）；反应由柠檬酸合酶（citrate synthase）催化。目目 录录（二）柠檬酸经顺乌头酸转变为异柠檬酸 此反应是由顺乌头酸酶催化的异构化反应。由两步反应构成，(1)脱水反应；(2)水合反应。目目 录录（三）异柠檬酸氧化脱羧转变为-酮戊二酸 异柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase
12、）作用下，氧化脱羧而转变成-酮戊二酸（-Ketoglutarate）。目目 录录（四）-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰 CoA 在-酮戊二酸脱氢酶复合体催化下-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA(succinyl-CoA)；该脱氢酶复合体的组成及催化机制与丙酮酸脱氢酶复合体类似。目目 录录（五）琥珀酰CoA合成酶催化底物水平磷酸化反应 在琥珀酰CoA合成酶催化下，琥珀酰CoA的高能硫酯键水解与GDP磷酸化偶联，生成琥珀酸、GTP和辅酶A。这是三羧酸循环中唯一直接生成高能磷酸键的反应。GTPGDPATPADP核苷二磷核苷二磷酸激酶酸激酶目目 录录目目 录录（六）琥珀酸脱氢生成延胡索酸 此步反应由琥珀酸
13、脱氢酶催化，其辅酶是FAD，是三羧酸循环中唯一与内膜结合的酶。目目 录录（七）延胡索酸加水生成苹果酸 延胡索酸酶催化此步反应（八）（八）苹果酸脱氢生成草酰乙酸苹果酸脱氢生成草酰乙酸n苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶催化此步反应，辅酶是催化此步反应，辅酶是NAD+。目目 录录CoASHNADH+H+NAD+NAD+NADH+H+FADFADH2NADH+H+NAD+H2OH2OH2OCoASHCoASHH2O柠檬酸合酶柠檬酸合酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶-酮戊二酸脱氢酶复合体酮戊二酸脱氢酶复合体琥珀酰琥珀酰CoA合成酶合成酶琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶延胡索酸酶延胡索酸酶苹果酸脱氢酶苹
14、果酸脱氢酶GTPGDPATPADP核苷二磷酸激酶核苷二磷酸激酶目目 录录 目目 录录2CO242H目目 录录n在在TCA循环反应过程中，从循环反应过程中，从2个碳原子的乙酰个碳原子的乙酰CoA与与4个碳原子的草酰乙酸缩合成个碳原子的草酰乙酸缩合成6个碳原子的个碳原子的柠檬酸开始，柠檬酸开始，反复地脱氢氧化。反复地脱氢氧化。nTCA循环中通过脱羧方式生成循环中通过脱羧方式生成CO2。1个二碳单个二碳单位进入位进入TCA后，有后，有2次脱羧反应，生成次脱羧反应，生成2分子分子CO2，这是体内这是体内CO2的主要来源。的主要来源。nTCA循环过程中，共有循环过程中，共有4次脱氢，其中次脱氢，其中3次
15、脱氢由次脱氢由NAD+接受，接受，1次由次由FAD接受。接受。目目 录录nTCA循环过程中，共有循环过程中，共有4次脱氢，其中次脱氢，其中3次脱氢由次脱氢由NAD+接受，接受，1次由次由FAD接受。接受。nTCA循环本身每循环一次只能以底物水平磷酸化循环本身每循环一次只能以底物水平磷酸化生成生成1个个ATP。TCA循环总反应式：循环总反应式：CH3COSCoA+3NAD+FAD+GDP+Pi+2H2O2CO2+3NADH+3H+FADH2+HSCoA+GTP目目 录录nTCA循环的中间产物包括草酰乙酸在内起着催化循环的中间产物包括草酰乙酸在内起着催化剂的作用，本身并无量的变化。剂的作用，本身并
16、无量的变化。n不可能通过不可能通过TCA直接从乙酰直接从乙酰CoA合成草酰乙酸或合成草酰乙酸或其他中间产物；同样，这些中间产物也不可能直其他中间产物；同样，这些中间产物也不可能直接在接在TCA循环中被氧化生成循环中被氧化生成CO2和和H2O。nTCA循环中的草酰乙酸主要来自丙酮酸的直接羧循环中的草酰乙酸主要来自丙酮酸的直接羧化，也可通过苹果酸脱氢产生。无论何种来源，化，也可通过苹果酸脱氢产生。无论何种来源，其最终来源是葡萄糖。其最终来源是葡萄糖。目目 录录第第 三三 节节三羧酸循环的调控三羧酸循环的调控Regulation of Tricarboxylic Acid Cycle目目 录录n别构
17、调节别构调节当脂肪酸或乙酰当脂肪酸或乙酰CoA充足时，或充足时，或ATP/ADP 和和 NADH/NAD_比值增高时，该酶活性被别构抑制；比值增高时，该酶活性被别构抑制；而当机体需要能量时，或而当机体需要能量时，或ATP/ADP降低时，该酶被降低时，该酶被AMP等变构激活。等变构激活。n化学修饰调节化学修饰调节当胞内当胞内ATP增高时，丙酮酸脱氢酶复合体成分中的丙增高时，丙酮酸脱氢酶复合体成分中的丙酮酸脱氢酶（酮酸脱氢酶（E1）由于磷酸化而失活；）由于磷酸化而失活；当当ATP减少时，磷蛋白磷酸酶去除减少时，磷蛋白磷酸酶去除E1上的磷酸基团而上的磷酸基团而激活该复合体。激活该复合体。目目 录录n
18、TCA循环的速度和流量主要受种因素的调控：循环的速度和流量主要受种因素的调控：底物的供应量底物的供应量催化循环最初几步反应的酶的反馈别构抑制催化循环最初几步反应的酶的反馈别构抑制产物堆积的抑制作用产物堆积的抑制作用目目 录录（一）（一）TCA循环中有个调节调节酶循环中有个调节调节酶nTCA循环中催化个不可逆反应的酶：循环中催化个不可逆反应的酶：柠檬酸合酶柠檬酸合酶异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶-酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶目目 录录乙酰乙酰CoA 柠檬酸柠檬酸 草酰乙酸草酰乙酸 琥珀酰琥珀酰CoA -酮戊二酸酮戊二酸 异柠檬酸异柠檬酸 苹果酸苹果酸 NADH FADH2 GTPATP异柠檬酸异柠
19、檬酸 脱氢酶脱氢酶柠檬酸合酶柠檬酸合酶 -酮戊二酸酮戊二酸脱氢酶复合体脱氢酶复合体 ATP +ADP ADP +ATP 柠檬酸柠檬酸 琥珀酰琥珀酰CoA NADH 琥珀酰琥珀酰CoA NADH +Ca2+Ca2+ATP、ADP的影响的影响 产物堆积引起抑制产物堆积引起抑制循环中后续反应循环中后续反应中间产物别位反中间产物别位反馈抑制前面反应馈抑制前面反应中的酶中的酶其他，如其他，如Ca2+可可激活许多酶激活许多酶三羧酸循环的调节三羧酸循环的调节目目 录录（二）（二）TCA循环与上游和下游反应协调循环与上游和下游反应协调n在正常情况下，（糖）酵解途径和在正常情况下，（糖）酵解途径和TCA循环的循
20、环的速度相协调；速度相协调；n氧化磷酸化的速率对氧化磷酸化的速率对TCA循环的运转也起着非循环的运转也起着非常重要的作用。常重要的作用。目目 录录nTCA循环中的酶在线粒体中是以多种酶组成的循环中的酶在线粒体中是以多种酶组成的复合体形式存在，这种酶复合体被称为代谢区复合体形式存在，这种酶复合体被称为代谢区室（室（metabolons），它在细胞内能够有效地将），它在细胞内能够有效地将代谢中间产物从一种酶传递给另一种酶。这些代谢中间产物从一种酶传递给另一种酶。这些复合体具有高效介导中间产物流通的功能，因复合体具有高效介导中间产物流通的功能，因此也可影响代谢的速率。此也可影响代谢的速率。目目 录录
21、第四节第四节三羧酸循环的生理意义三羧酸循环的生理意义 Physiologic Significance of Tricarboxylic Acid Cycle目目 录录nTCA循环在大多数生物中是分解代谢途径循环在大多数生物中是分解代谢途径;n多种生物合成途径也利用多种生物合成途径也利用TCA循环的中间产物循环的中间产物作为合成反应的起始物。作为合成反应的起始物。（一）（一）TCA循环参与合成和分解途径的组成循环参与合成和分解途径的组成目目 录录TCA中间产物中间产物（二）（二）TCA循环中间产物是合成糖、脂肪酸和循环中间产物是合成糖、脂肪酸和氨基酸的前体氨基酸的前体1.TCA循环中间产物可以
22、异生为糖循环中间产物可以异生为糖草酰乙酸草酰乙酸异生为葡萄糖异生为葡萄糖氨基酸氨基酸目目 录录乙酰乙酰CoA2.TCA循环中间产物可为脂酸合成提供原料循环中间产物可为脂酸合成提供原料合成脂酸合成脂酸柠檬酸柠檬酸-丙酮酸循环丙酮酸循环目目 录录-酮戊二酸酮戊二酸+NH4+3.TCA循环中间产物可为非必需氨基酸合成提供碳架循环中间产物可为非必需氨基酸合成提供碳架谷氨酸谷氨酸谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶NADH+H+NAD+目目 录录目目 录录（三）添补反应补充（三）添补反应补充TCA循环中间产物循环中间产物n参与其他代谢途径而消耗的参与其他代谢途径而消耗的TCA循环中间产物必循环中间产物必须及时补充，
23、才能保持须及时补充，才能保持TCA循环顺利进行。这类循环顺利进行。这类反应被称为反应被称为添补反应（添补反应（anaplerotic reaction）。n最重要的添补反应是由丙酮酸羧化酶催化的，从最重要的添补反应是由丙酮酸羧化酶催化的，从丙酮酸生成草酰乙酸的反应。丙酮酸生成草酰乙酸的反应。丙酮酸丙酮酸+CO2草酰乙酸草酰乙酸丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶ATPADP+Pi目目 录录n乙酰乙酰CoA是丙酮酸羧化酶的激活剂；是丙酮酸羧化酶的激活剂；nTCA循环中的酶促反应可以将草酰乙酸转变为其循环中的酶促反应可以将草酰乙酸转变为其他中间产物；他中间产物；n此外，可由别的途径生成一些中间产物，如：此外，
24、可由别的途径生成一些中间产物，如：奇数碳链脂肪酸奇数碳链脂肪酸琥珀酰琥珀酰CoA某些氨基酸某些氨基酸-酮戊二酸、草酰乙酸酮戊二酸、草酰乙酸目目 录录（一）（一）TCA循环是三大营养物质的最终代谢循环是三大营养物质的最终代谢通路通路（二）（二）TCA循环是糖、脂肪和氨基酸代谢联循环是糖、脂肪和氨基酸代谢联系的枢纽系的枢纽目目 录录第五节第五节三羧酸循环关键反应的分析三羧酸循环关键反应的分析原理原理 Analytical Principles of Key Reactions of Tricarboxylic Acid Cycle目目 录录反应生成的辅酶反应生成的辅酶A和和5,5-二硫代双（二硫代
25、双（2-硝基苯甲酸）硝基苯甲酸）（DNTB）在）在pH 7.4、0.1 M 三乙醇胺和三乙醇胺和 0.2 M 乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸钙钠（钙钠（EDTA）溶液中反应生成硫氢辅酶）溶液中反应生成硫氢辅酶A，其在，其在412 nm时时有吸收峰，通过分光光度计测定吸光度，测定硫氢辅酶有吸收峰，通过分光光度计测定吸光度，测定硫氢辅酶A的的生成量。以此反映柠檬酸合酶酶活性。生成量。以此反映柠檬酸合酶酶活性。目目 录录反应中异柠檬酸脱氢酶酶活性的检测主要通过测定生成反应中异柠檬酸脱氢酶酶活性的检测主要通过测定生成的的NADH在在340 nm吸光度。检测体系包括吸光度。检测体系包括120 mM 的D，L-
26、异异柠檬酸三钠柠檬酸三钠，30 mM 的硫酸锰的硫酸锰,20 mM 的的NAD+及异柠檬酸及异柠檬酸脱氢酶。脱氢酶。目目 录录通过测定通过测定NADH在在340 nm时吸光度的变化反映时吸光度的变化反映-酮戊酮戊二酸脱氢酶复合体酶活性。检测体系包括二酸脱氢酶复合体酶活性。检测体系包括1.0 ml的磷酸盐；的磷酸盐；0.15 ml 的辅酶的辅酶A；0.1 ml 的半胱氨酸的半胱氨酸;0.1 ml NAD+；0.5ml的酶。的酶。目目 录录检测体系包括检测体系包括100 mmol/L 的氯化钠，的氯化钠，30 mmol/L柠檬酸柠檬酸钠钠,20 mmol/L Tris/HCl 和酶，在和酶，在 1.00 ml反应终体积，反应终体积，pH 7.4的溶液中，反应在的溶液中，反应在25进行，通过检测顺乌头酸在进行，通过检测顺乌头酸在240nm的吸光度反映顺乌头酸酶的酶活性。的吸光度反映顺乌头酸酶的酶活性。
