1、第九章基因工程和基因组学第九章基因工程和基因组学 遗传工程或基因工程遗传工程或基因工程，是将分子遗传学的理论与技，是将分子遗传学的理论与技术相结合，用来改造、创建动、植物新品种，工业化生术相结合，用来改造、创建动、植物新品种，工业化生产生物产品，诊断和治疗人类遗传疾病的一个新领域。产生物产品，诊断和治疗人类遗传疾病的一个新领域。本章介绍本章介绍遗传工程的基本原理和方法遗传工程的基本原理和方法，基因组学的，基因组学的发展及应用前景。发展及应用前景。广义广义遗传工程包括遗传工程包括:生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程、基因工程及酶工程
2、等。细胞器工程、基因工程及酶工程等。狭义狭义遗传工程是指遗传工程是指:基因工程基因工程(重组重组DNADNA技术技术)。一、基因工程概述一、基因工程概述:第一节第一节 基因工程基因工程.概念：概念：基因工程：基因工程：在分子水平上，采取工程建设方式在分子水平上，采取工程建设方式 按照按照预先设计的蓝图预先设计的蓝图 借助于实验室技术将某种生物的基借助于实验室技术将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去因或基因组转移到另一种生物中去 使使后者定向获得后者定向获得新遗传性状的一门技术。新遗传性状的一门技术。基因工程技术的建立，使所有实验生物学领域产生基因工程技术的建立，使所有实验生物学领域产生
3、巨大的变革。巨大的变革。基因工程是采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物基因工程是采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段建立起来的综合技术。遗传学的现代方法和手段建立起来的综合技术。2.2.发展：发展：19711971年，年，SmithSmith等人从细菌中分离出的一种等人从细菌中分离出的一种限制性酶限制性酶，酶切，酶切病毒病毒DNADNA分子，标志着分子，标志着DNADNA重组时代的开始。重组时代的开始。19721972年，年，BergBerg等用限制性酶分别等用限制性酶分别酶切酶切猿猴病毒和猿猴病毒和TlTl噬菌体噬菌体DNADNA，将两种，将两种DNADNA分子用分
4、子用连接酶连接酶连接起来连接起来 得到得到新的新的DNADNA分子。分子。19731973年，年，CohenCohen等进一步将等进一步将酶切后的酶切后的DNADNA分子与质粒分子与质粒DNADNA连接起来，并将连接起来，并将重组质粒重组质粒转转入入E.E.cloicloi细胞中。细胞中。19821982年，年，美国食品卫生和医药管理局批准，用美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在基因工程在细菌中生产人的胰岛素细菌中生产人的胰岛素投放市场。投放市场。19851985年，年，转基因植物转基因植物获得成功。获得成功。19941994年，年，延熟保鲜的延熟保鲜的转基因番茄转基因番茄商品生产。商品
5、生产。19961996年，年，克隆羊克隆羊诞生。诞生。19961996年年全世界转基因植物种植面积为全世界转基因植物种植面积为170170万公顷，万公顷，19971997年年为为11001100万公顷，万公顷，19981998年年为为27802780万公顷，万公顷，19991999年年达到达到39903990万公顷，万公顷，20002000年年达到达到44204420万公顷，万公顷，20012001年年达到达到52605260万公顷，万公顷，20022002年年达达到到50005000万公顷。万公顷。20012001年种植面积已超过年种植面积已超过100100万公顷的作物有：万公顷的作物有：大
6、豆大豆（33303330万万hm2hm2，占全世界转基因作物的，占全世界转基因作物的63%63%，均为抗，均为抗除草剂大豆）、除草剂大豆）、玉米玉米（980980万万hm2 hm2，占，占19%19%）、）、棉花棉花（680680万万hm2 hm2，占，占13%13%）、）、油菜油菜（270270万万hm2 hm2，5%5%）；）；其它还有其它还有水稻、小麦、花生、向日葵、亚麻、甘蓝、马水稻、小麦、花生、向日葵、亚麻、甘蓝、马铃薯等，番茄、烟草、南瓜和木瓜等铃薯等，番茄、烟草、南瓜和木瓜等5050多种转基因作物多种转基因作物已实现商品化。已实现商品化。主要分布主要分布在美国（在美国（35703
7、570万万hm2hm2）、阿根廷（）、阿根廷（11801180万万hm2hm2）、）、加拿大（加拿大（320320万万hm2hm2）和中国（）和中国（150150万万hm2hm2）等国。）等国。20012001年全世界转基因作物占相应种植总面积的百分率年全世界转基因作物占相应种植总面积的百分率 2001 2001年年我国我国的转基因农作物和林木的转基因农作物和林木已达已达2222种种，其中，其中转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麦等进行了田间试验，甜椒、小麦等进行了田间试验，转基因棉花已经大规模转基因棉花已经大规模商品化
8、生产商品化生产。3 3内容：内容：从细胞和组织中从细胞和组织中分离分离DNADNA；限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切DNADNA分子，分子，制备制备DNADNA片段片段；将酶切将酶切DNADNA分子与载体分子与载体DNADNA连接连接构建能在宿主细胞内构建能在宿主细胞内自我复制的自我复制的重组重组DNADNA分子分子；把重组把重组DNADNA分子引入宿主受体细胞分子引入宿主受体细胞复制；复制；重组重组DNADNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞随宿主细胞的分裂而分配到子细胞建立无建立无性繁殖系性繁殖系(Clone)(Clone)或或发育成个体发育成个体；从细胞群体中从细胞群体中选出所需要的无性繁
9、殖系选出所需要的无性繁殖系并使外源基并使外源基因在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质等因在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质等基因产物基因产物、回、回收；收；或或筛选出获得定向的性状变异的筛选出获得定向的性状变异的个体个体。1.1.限制性内切酶限制性内切酶(restriction enzyme)(restriction enzyme)：一种水解一种水解DNADNA的磷酸二脂酶，遗传工程中重要工具。的磷酸二脂酶，遗传工程中重要工具。这种酶这种酶能识别能识别双链双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，分子中一段特异的核苷酸序列，在这一段序列内将双链在这一段序列内将双链DNA分子切断。分子切断。细菌细胞中
10、存在细菌细胞中存在限制修饰系统限制修饰系统：限制：限制：降解外源降解外源DNADNA，防御异源遗传信息进入的手段。，防御异源遗传信息进入的手段。修饰：修饰：修饰外源修饰外源DNADNA片段后，保留在新细胞中。片段后，保留在新细胞中。二、限制性内切核酸酶二、限制性内切核酸酶限制性内切酶限制性内切酶EcoREcoR：识别序列：识别序列：回纹回纹对称序列对称序列(palindrome)(palindrome)，不同生物的，不同生物的DNADNA具具 有相同识别序列。有相同识别序列。酶切方式：酶切方式：以交错以交错方式切断方式切断DNADNA双链，产生二个相同的双链，产生二个相同的单单链粘性末端。链粘
11、性末端。重组过程：重组过程：两种片段在适宜两种片段在适宜条件下，可经碱酸二脂链，条件下，可经碱酸二脂链，连接成重组连接成重组DNADNA分子分子。限制性内切酶的命名：限制性内切酶的命名：根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示；根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示；.HindHind来自来自HaemophilusHaemophilus influenzaeinfluenzae。.EcoRIEcoRI 来自来自Escherichia coliEscherichia coli；限制性内切酶的类别：限制性内切酶的类别：第第类酶类酶:每隔一段每隔一段DNADNA序列随机切割双链序列随机切割双链
12、DNADNA分子，分子，没有序列特异性没有序列特异性,酶切位点不定酶切位点不定。如如EcoBEcoB(大肠杆菌大肠杆菌B B株株)、EcoKEcoK(大肠杆菌大肠杆菌K K株株)分子量较大分子量较大(约约300000)300000)，作用时需，作用时需ATPATP、Mg+Mg+等辅助因子。等辅助因子。第第类酶类酶:能识别一段特异的能识别一段特异的DNADNA序列，准确地酶切双序列，准确地酶切双链链DNADNA的特异序列。的特异序列。如如EcoRIEcoRI(大肠杆菌大肠杆菌)、Hind(Hind(嗜血杆菌嗜血杆菌)，分子量较小，分子量较小(约约20000-100000)20000-100000
13、)，作用时需，作用时需MgMg2+2+存在。存在。第第类酶特点：类酶特点：(1)(1)切割产生切割产生平末端平末端(blunt ends)(blunt ends)如如SmaSma ：(2)(2)有的产生粘性末端有的产生粘性末端 从两个方向阅读而序列相同的序列。从两个方向阅读而序列相同的序列。识别特定碱基顺序识别特定碱基顺序，为回文对称序列为回文对称序列,又称反向重复序列：又称反向重复序列：如如EcoREcoR：载体载体：将将“目的目的”基因导入受体细胞的运载工具。基因导入受体细胞的运载工具。DNA DNA片段与适合的载体片段与适合的载体DNADNA连接构成重组连接构成重组DNA DNA 在在载
14、体载体DNADNA的运载下，高效率地进入宿主细胞，并在其中进的运载下，高效率地进入宿主细胞，并在其中进行复制。行复制。DNA DNA载体载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体等。染色体等。三、载体（三、载体（vectorvector）：）：载体的条件：载体的条件：.具有复制原点，能具有复制原点，能自我复自我复 制制；.具具多克隆位点多克隆位点(multiple(multiple cloningsitecloningsite，MCS MCS 或或PolylinkerPolylinker region)region)即有多即有多种限制酶的切点；种限制
15、酶的切点；.选择时的选择时的遗传标记遗传标记，如，如抗生素基因；抗生素基因；.易易从宿主细胞中从宿主细胞中回收回收。、细菌质粒：、细菌质粒：质粒质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链能自我复制、易分离和导入的环状双链DNADNA分子。分子。质粒具有质粒具有重组表型检测标记重组表型检测标记，检测是否携带外源，检测是否携带外源DNADNA片段。片段。在细胞内的复制程度：在细胞内的复制程度：严紧型：严紧型：一个细菌细胞内的质粒数量有一个细菌细胞内的质粒数量有1-21-2个；个；松驰型：松驰型：每个细胞内有的每个细胞内
16、有的20-6020-60个。个。如如pUCpUC1818质粒具有以下特点：质粒具有以下特点：.克隆位点的酶切位点多克隆位点的酶切位点多，克隆方便；克隆方便；.具有具有a a互补的互补的显色表显色表型型，用于检测重组质粒的，用于检测重组质粒的选择标记。选择标记。.分子量小分子量小，可接受较大外源片段；，可接受较大外源片段；.拷贝数多拷贝数多，每个细胞中每个细胞中有有500个；个；噬菌体噬菌体DNADNA中间约中间约2/32/3的序列的序列为中间基因簇，位于两端的为中间基因簇，位于两端的为为DNADNA左、右臂。左、右臂。中间基因中间基因簇簇可被外源可被外源DNADNA替代而不影替代而不影响浸染细
17、菌的能力。响浸染细菌的能力。能接受能接受15-23kb15-23kb外源外源DNADNA片段，可以作为片段，可以作为cDNAcDNA或或核核DNADNA克隆的载体。克隆的载体。、噬菌体噬菌体(温和型温和型)：基因组全长基因组全长49kb49kb。优点：优点：2.2.不易引起生物危害，不易引起生物危害，有助于有助于“目的目的”基因进入基因进入细胞并增殖细胞并增殖；1.1.携带携带大片段大片段外源外源DNADNA分子，可占用总量的分子，可占用总量的25%25%时时仍不失活。仍不失活。、柯斯质粒、柯斯质粒(cosmidcosmid)：部分部分噬菌体噬菌体DNA DNA+部分细菌部分细菌质粒质粒DNA
18、DNA序列组建序列组建 柯斯质粒柯斯质粒。带有噬菌体带有噬菌体coscos序列和细菌质粒复制原点、抗生素抗性标记。序列和细菌质粒复制原点、抗生素抗性标记。这种质粒分子量较小，但这种质粒分子量较小，但可接受可接受长达长达50kb50kb的外源的外源DNADNA片段，在克隆片段，在克隆真核真核生生物基因中十分有用。物基因中十分有用。一个长片段一个长片段DNADNA可能具有可能具有真核生物基因的编码序列真核生物基因的编码序列及其它调控序列。及其它调控序列。指能在指能在两种不同两种不同的生物中复制的载体。的生物中复制的载体。如能在如能在原核原核生物（如生物（如E.coliE.coli）、）、真核真核细
19、胞（如酵母）细胞（如酵母）中复制的载体。中复制的载体。穿梭载体需穿梭载体需同时具有同时具有细菌质粒的细菌质粒的复制原点复制原点、真核生物、真核生物自主复制序列自主复制序列(Auto-(Auto-nomouslynomously replicating sequence,replicating sequence,ARS)ARS)以及两者的选择标记。以及两者的选择标记。、穿梭载体（、穿梭载体（shuttle vectorsshuttle vectors）：）：穿梭载体穿梭载体在细菌在细菌中用于克隆、扩增基因，中用于克隆、扩增基因，在酵母菌中在酵母菌中用用于基因表达分析。于基因表达分析。酵母菌的酵母
20、菌的YEpYEp 系列载体系列载体(yeast(yeast episomaplasmidepisomaplasmid)YIpYIp和和YRpYRp系列载体系列载体均是穿均是穿梭载体。梭载体。YEp24具有具有Amp及及Tc二二个抗生素抗性基因，可个抗生素抗性基因，可将外源将外源DNA片段插在抗片段插在抗生素基因中，通过生素基因中，通过插入插入失活失活,选择阳性克隆选择阳性克隆。、细菌人工染色体、细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosomeBacterial artificial chromosome，BACBAC)BACBAC载体载体可以可以携带大于携带大于5
21、0kb50kb的外源的外源DNADNA片段片段。特点：特点：带有外源带有外源DNADNA的的BACBAC载体载体在细胞中是单拷贝的；在细胞中是单拷贝的；载体本身分子量很小载体本身分子量很小(7.4kb)(7.4kb)；选择标记：选择标记：氯霉素抗性基因；氯霉素抗性基因；多克隆位点。多克隆位点。F F因子经基因工程改造成因子经基因工程改造成BACBAC载体，可用于克载体，可用于克隆隆100kb100kb以上的以上的DNADNA片段。片段。、酵母人工染色体、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome(yeast artificial chromosome，YAC)YAC
22、)：YACYAC具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；可可接受接受100-1000kb100-1000kb的外源的外源DNADNA片段。片段。YACYAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具；已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具；并促进了并促进了人类人工染色体人类人工染色体(human artificial chromosome(human artificial chromosome，HACHAC)的研究。的研究。1996年完成了酵母菌全
23、基因组序列的测定、TiTi质粒及其衍生载体：质粒及其衍生载体：适合于适合于植物植物的载体系统的载体系统将重组将重组DNADNA运载到植物细运载到植物细胞并使目的基因表达。胞并使目的基因表达。TiTi质粒质粒是一种细菌质粒，它自然存在于是一种细菌质粒，它自然存在于土壤农杆菌土壤农杆菌(革革兰氏阴菌兰氏阴菌)()(AgrobacteriumAgrobacterium tumefacienstumefaciens)细胞中细胞中可可诱导植物产生瘤细胞诱导植物产生瘤细胞(tumor-Inducing,(tumor-Inducing,TiTi)冠瘿瘤冠瘿瘤(grown(grown galltumorsga
24、lltumors)。TiTi质粒一部分质粒一部分DNADNA叫叫转移转移DNADNA (transfer DNA(transfer DNA，T-DNAT-DNA)，当农，当农杆菌感染植物时，杆菌感染植物时，T-DNAT-DNA便转移便转移到植物的染色体上，诱导冠瘿到植物的染色体上，诱导冠瘿瘤瘤，并能合成冠瘿碱，并能合成冠瘿碱(opine)(opine)，作为农杆菌的碳源和氮源。作为农杆菌的碳源和氮源。农杆菌感染产生农杆菌感染产生冠缨瘤冠缨瘤 一般而言，一般而言，一个基因一个基因 是编码一条多肽链的一是编码一条多肽链的一个个DNADNA片段，包括启动子、终止子及内含子等。片段，包括启动子、终止子
25、及内含子等。在在DNADNA重组技术出现之前重组技术出现之前，由于，由于DNADNA分子量大而结构分子量大而结构单一，单一，DNADNA是细胞中最难分析的大分子。是细胞中最难分析的大分子。DNA DNA重组技术发展成功重组技术发展成功之后之后，DNADNA已成为细胞中最易已成为细胞中最易操作分析的大分子。操作分析的大分子。四、基因的分离与鉴定：四、基因的分离与鉴定：利用这一技术，可从一个含有利用这一技术，可从一个含有1010万个基因的大基因万个基因的大基因组中，组中，准确地分离出准确地分离出特异的特异的单个目的基因单个目的基因。1.1.体外通过体外通过限制性内切酶限制性内切酶的修剪和的修剪和D
26、NADNA连接酶连接酶的连接；的连接；2.2.目标目标DNADNA分子分子 +载体载体DNADNA，共价连接；，共价连接；3.3.获得获得重组重组DNADNA分子分子。DNADNA的体外重组：的体外重组：分离与鉴定基因是分离与鉴定基因是DNA重组中的关键步骤之一。重组中的关键步骤之一。分离的基因可用于分离的基因可用于分析基因序列、结构与表达分析基因序列、结构与表达，又可为基因工程又可为基因工程提供目的基因提供目的基因。、从基因库中分离基因：、从基因库中分离基因：1.1.构建构建基因库（基因库（librarylibrary）基因库基因库是一组是一组DNADNA和和cDNAcDNA序列克隆的集合体
27、。序列克隆的集合体。根据克隆核酸序列、来源，根据克隆核酸序列、来源，基因库可分为基因库可分为：核基因库核基因库、染色体库染色体库、cDNAcDNA库库、线粒体库线粒体库等。等。.核基因库：核基因库：核基因库核基因库(genomic library)(genomic library)：将将某生物全部基因组某生物全部基因组DNA DNA 酶酶切后与载体连接构建而成的。理想的核基因库应能包括全部切后与载体连接构建而成的。理想的核基因库应能包括全部基因组序列。基因组序列。构建文库可采用不同的载体：构建文库可采用不同的载体：质粒载体：质粒载体：重组质粒导入感受态细胞，收集所有菌落。重组质粒导入感受态细胞
28、，收集所有菌落。噬菌体或噬菌体或(柯斯质粒柯斯质粒)载体：载体：重组重组DNADNA包装进噬菌体，包装进噬菌体，感染细菌，感染细菌，收集噬菌斑。收集噬菌斑。BAC(BAC(细菌人工染色体细菌人工染色体)或或YAC(YAC(酵母人工染色体酵母人工染色体)载体：载体：重组重组人工染色体，导入相应宿主细胞，收集所有细胞，即为基人工染色体，导入相应宿主细胞，收集所有细胞，即为基因库因库。.染色体基因库：染色体基因库：将基因组的将基因组的一部分如一条染色体一部分如一条染色体用来构建基因库用来构建基因库可可选择选择特异基因以及分析染色体结构和组织。特异基因以及分析染色体结构和组织。果蝇的多线染色体中果蝇的
29、多线染色体中，对染色体进行对染色体进行微切割，微切割，构建染色构建染色体区段基因文库。如对体区段基因文库。如对X X染色体上多线染色体带的分析。染色体上多线染色体带的分析。人类基因组项目研究中，人类基因组项目研究中，利用利用流动细胞分离流动细胞分离(flow(flow cytometrycytometry)技术将人类染色体分开，用于技术将人类染色体分开，用于构建单个染色体基构建单个染色体基因库，因库，大大加速了人类基因组作图和分析。大大加速了人类基因组作图和分析。流式细胞分离原理流式细胞分离原理分离后的染色体进行涂色验证分离后的染色体进行涂色验证酵母菌：酵母菌：利用改良的利用改良的脉冲电泳方法
30、脉冲电泳方法(pulsed field gel electro-(pulsed field gel electro-phoresisphoresis,PFGE),PFGE)，将酵母菌，将酵母菌1616根染色体根染色体据其分子量大小据其分子量大小分开分开后，用于构建染色体库，在基因组分析中发挥作用。后，用于构建染色体库，在基因组分析中发挥作用。.cDNAcDNA库：库：以以mRNAmRNA为模板为模板经反转经反转录酶合成互补录酶合成互补DNADNA构建构建基因库。基因库。真核生物真核生物mRNAmRNA的的55端端具有一段多聚具有一段多聚A A尾端序尾端序列列得到的双链得到的双链DNADNA分分
31、子经两端补齐后子经两端补齐后以带以带有限制性酶切点的人有限制性酶切点的人工接头连接工接头连接酶切后与酶切后与载体载体(通常是噬菌体通常是噬菌体)连接连接制备制备cDNAcDNA库。库。cDNAcDNA库与核库与核DNADNA库不同：库不同：cDNAcDNA库仅具有细胞或组织内库仅具有细胞或组织内表达表达基因的基因的mRNAmRNA序序列列仅包括基因组的仅包括基因组的部分基因序列。部分基因序列。cDNA库对于库对于研究基因的表达模式、分离某一特定研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的基因是十分有用的。通常是将通常是将cDNA库与核基因库配合使用库与核基因库配合使用，以便既，以便既能得到
32、基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。2.2.筛选基因库：筛选基因库：根据待选基因相关信息根据待选基因相关信息 确定筛选方法和条件确定筛选方法和条件从基因库中筛选、分离基因。从基因库中筛选、分离基因。多数方法多数方法是利用一段核苷酸序列是利用一段核苷酸序列(DNA(DNA、cDNAcDNA或寡聚核或寡聚核苷酸苷酸)或抗体或抗体作探针作探针(Probe)(Probe)，用放射性同位素或非放，用放射性同位素或非放射性同位素射性同位素标记探针标记探针 筛选筛选基因库。基因库。筛库过程：筛库过程：将转化或转染后菌落将转化或转染后菌落印影在滤膜上印影在滤膜
33、上用碱裂解、用碱裂解、中和后洗涤烘干中和后洗涤烘干再用目再用目的基因的放射性的基因的放射性DNADNA或或mRNAmRNA作探针进行杂交放射作探针进行杂交放射性自显影性自显影凡凡黑点菌落即黑点菌落即为阳性克隆。为阳性克隆。.限制性酶图谱：限制性酶图谱：构建构建阳性克隆阳性克隆的限制性酶图谱的限制性酶图谱 根据同源性分析，根据同源性分析，可了解阳性克隆片段的可了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置酶切位点及相对位置 用于用于进一步进一步亚克隆或亚克隆或同已知的其它同已知的其它序列比较序列比较。3.3.阳性克隆的分析与鉴定：阳性克隆的分析与鉴定：从基因库中筛选出的阳性克隆从基因库中筛选出的阳性克隆
34、分析、鉴定分析、鉴定 得到得到目的基因。目的基因。图示：图示：一个一个15kb DNA15kb DNA片段的片段的限制性酶图谱构建方法限制性酶图谱构建方法。将阳性克隆将阳性克隆DNADNA分装分装3 3个管个管中中酶切酶切DNADNA琼脂糖凝胶电琼脂糖凝胶电泳泳 溴化乙锭染色溴化乙锭染色紫外灯紫外灯下见到下见到DNADNA带。带。从凝胶电泳结果分析：从凝胶电泳结果分析：模式模式就是这个就是这个15kb DNA15kb DNA片片段用上述两种酶酶切后的段用上述两种酶酶切后的限限制性酶图谱制性酶图谱。用类似的方法，将不同用类似的方法，将不同DNADNA用限制性酶消化，用限制性酶消化，根据其根据其产
35、生的多型性产生的多型性，即限制性酶片段长度的多型即限制性酶片段长度的多型性性来分析来分析DNADNA水平的变异程度，水平的变异程度，以以RFLPRFLP作为分子作为分子标记进行基因组图谱分析。标记进行基因组图谱分析。.核酸分子杂交：核酸分子杂交：SouthernSouthern杂交分析：杂交分析：由英国的由英国的SouthernSouthern发明发明(1975)(1975)，一种，一种将将琼脂糖中的琼脂糖中的DNADNA转移到转移到尼龙膜尼龙膜进行进行DNADNA分子杂交分子杂交分析的方法。分析的方法。筛选基因库得到筛选基因库得到阳性克隆阳性克隆后后将限制性酶酶切与将限制性酶酶切与South
36、ernSouthern杂杂交结合交结合绘制限制性酶图谱。绘制限制性酶图谱。NorthernNorthern杂交分析：杂交分析：与与SorthernSorthern杂交相同的原理和程序。杂交相同的原理和程序。用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平，用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平，检检测测mRNAmRNA的存在的存在。Western 杂交分析：杂交分析：用于用于蛋白质蛋白质的分析的分析。.核酸序列测定核酸序列测定克隆后的克隆后的DNADNA片段进行核酸序列测定片段进行核酸序列测定后后确定该确定该DNADNA片段序列的正确性。片段序列的正确性。一般采用一般采用Sanger(197
37、7)Sanger(1977)发明发明的的双脱氧核糖核酸终止法双脱氧核糖核酸终止法测定核测定核酸序列。酸序列。在在Sanger双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记：双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记：.核酸序列分析：核酸序列分析：测定的核酸序列是否为基因、有什么功能，需用计算测定的核酸序列是否为基因、有什么功能，需用计算机软件或生物学实验进一步分析。机软件或生物学实验进一步分析。（1 1）同源性比较同源性比较 将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上比较基因间的比较基因间的同源性同源性，将序列发送到将序列发送到BlastBlast等等DNA DataDNA
38、Data数据库进行比较。数据库进行比较。核酸序列分析方法：核酸序列分析方法：对于那些同已知序列无任何同源性的新序列，可能对于那些同已知序列无任何同源性的新序列，可能还要进行基因功能性研究。还要进行基因功能性研究。一个一个ORFORF是一条能编码一条多肽链的是一条能编码一条多肽链的DNADNA序列，具有翻译序列，具有翻译起始信号和终止信号等。起始信号和终止信号等。（2）分析核酸序列的）分析核酸序列的阅读框架阅读框架PCRPCR反应三个步聚反应三个步聚(一个循环一个循环)：1.1.变性变性：94-9594-95使模板使模板DNADNA双链变成单链；双链变成单链；2.2.复性复性：50-7050-7
39、0下，引物分别与互补的下，引物分别与互补的DNADNA单链互补配对；单链互补配对；3.3.延伸延伸：在引物的引导和在引物的引导和TaqTaq酶作用下，于酶作用下，于72 72 下合成模板下合成模板DNADNA的互补链。的互补链。PCRPCR反应通常有反应通常有25-3525-35个循环个循环，一般可，一般可扩扩增增5kb5kb左右的片段。左右的片段。由该技术衍生出一些新的技术，如由该技术衍生出一些新的技术，如RAPDRAPD和和AFLPAFLP等技术。等技术。、PCRPCR扩增基因：扩增基因：聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase(polymerase chainReactionc
40、hainReaction，PCR)PCR)可以体外快速扩增可以体外快速扩增DNADNA。美国。美国Mullis(1986)Mullis(1986)发明，发明，是现代生是现代生物学发展史上的一个物学发展史上的一个里程碑里程碑。、人工合成基因：、人工合成基因：根据已知的基因或氨基酸序列，根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法将化学合成寡核苷酸的方法与与酶促合成酶促合成DNADNA的方法结合的方法结合起来起来可很快地人工合成基因。可很快地人工合成基因。如如SOE-PCRSOE-PCR技术技术可扩增出可扩增出完整的基因序列。完整的基因序列。1.1.化学合成的寡聚核苷酸化学合成的寡聚核苷酸
41、(80-100(80-100个个核苷酸核苷酸)通过通过SOESOE将单链部分补齐；将单链部分补齐；2.2.PCRPCR扩增扩增DNADNA片段；片段；3.DNA3.DNA变性；变性；4.4.两个单链部分经两个单链部分经SOESOE补齐补齐双链；双链；5.PCR5.PCR扩增扩增DNADNA，利用多级，利用多级SOE-PCR SOE-PCR 扩增出完整的基因。扩增出完整的基因。目前，目前，基因工程研究发展迅速基因工程研究发展迅速，已取得一系列重大突破。，已取得一系列重大突破。基因工程技术已基因工程技术已广泛用于广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了巨
42、大的财富。法学等领域，为人类创造了巨大的财富。五、基因工程的应用：五、基因工程的应用：具有生长激素具有生长激素的转基因鼠的转基因鼠转基因的方法和技术转基因的方法和技术 ：、基因工程工业：、基因工程工业：最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是在细菌在细菌中表达人的胰岛素中表达人的胰岛素(1982)(1982)。胰岛素是一种控制糖代谢的蛋白质激素。不能产生胰岛素是一种控制糖代谢的蛋白质激素。不能产生胰岛素的患者会有糖尿病，患者必须每天注射胰岛素。胰岛素的患者会有糖尿病，患者必须每天注射胰岛素。现已在细菌中生产现已在细菌中生产1010多种多种医药产品医药产品，如
43、表皮生长如表皮生长因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝类工程疫苗因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝类工程疫苗等。等。有些有些真核细胞真核细胞的蛋白质需要的蛋白质需要糖基糖基化等修饰加工化等修饰加工以后才具有活性，而细以后才具有活性，而细菌细胞缺少真核细胞的这些修饰系统菌细胞缺少真核细胞的这些修饰系统真核生物细胞更适合于表达真核生真核生物细胞更适合于表达真核生物蛋白质基因。物蛋白质基因。目前，目前，酵母菌酵母菌、植物悬浮细胞植物悬浮细胞、植株和动物培养细胞植株和动物培养细胞成功地均应用于成功地均应用于表达表达外源蛋白。外源蛋白。基因工程应用大肠杆菌基因工程应用大肠杆菌生产人类生长激素生产人类生
44、长激素、植物基因工程：、植物基因工程：植物基因转化植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞内、并整是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。许多植物基因已经被分离、克隆。植物基因转化技许多植物基因已经被分离、克隆。植物基因转化技术也得到不断发展和完善。应用最多的为术也得到不断发展和完善。应用最多的为农杆菌转化法农杆菌转化法和和基因枪转化法基因枪转化法。抗虫稻抗虫稻对照对照1.1.根癌农杆菌转化技术：根癌农杆菌转化技术：根癌农杆菌根癌农杆菌介导的植物转化是应用得最早而广泛的介导的植物转化是应用得最早而广泛的植物转化方法（双子叶
45、植物、单子叶植物）。植物转化方法（双子叶植物、单子叶植物）。过程：过程：将目的基因与启动子（花椰菜病毒将目的基因与启动子（花椰菜病毒35S35S）及终止子）及终止子组成嵌合组成嵌合DNADNA分子分子插入到插入到TiTi衍生质粒衍生质粒RBRB与与LBLB内构成内构成重组重组质粒质粒 再转化到再转化到农杆菌农杆菌细胞细胞 将重组农杆菌去将重组农杆菌去感染感染植物植物细胞细胞 使质粒的部分使质粒的部分DNADNA包括目的基因，整合到植物染色包括目的基因，整合到植物染色体，实现体，实现遗传转化。遗传转化。利用从利用从抗草甘磷抗草甘磷(glyphosateglyphosate)E.coliE.col
46、i中分离克隆的中分离克隆的EPSPEPSP合成酶基因，合成酶基因，已培育出高抗除草剂转基因植物已培育出高抗除草剂转基因植物。基因枪介导的植物转化是通过高压气体为动力，基因枪介导的植物转化是通过高压气体为动力，高速高速发射包裹有重组发射包裹有重组DNADNA的的金属颗粒金属颗粒将目的基因直接将目的基因直接导入植物细胞，并整合到染色体上的方法。导入植物细胞，并整合到染色体上的方法。2.2.基因枪转化技术：基因枪转化技术：转化的载体多数是以转化的载体多数是以pUCpUC系列质粒系列质粒为基础构建的。为基础构建的。它们通常具有它们通常具有细菌复制原点细菌复制原点及及抗性选择标记，抗性选择标记，具有可在
47、具有可在植物中表达的启动子终止子及调控序列，以及植物抗性植物中表达的启动子终止子及调控序列，以及植物抗性选择标记选择标记(如除草剂、潮霉素等抗性如除草剂、潮霉素等抗性)。几种基因枪类型的几种基因枪类型的共同特点：共同特点：是用一种是用一种动力系统动力系统将金属微将金属微粒和包被粒和包被DNADNA导入受体细胞或组织进行转化。导入受体细胞或组织进行转化。1.1.位于高压气体桶底部位于高压气体桶底部的的爆破片爆破片；2.2.载有重组载有重组DNADNA和金属微和金属微粒的粒的大载体大载体；3.3.阻挡板阻挡板；4.4.包裹有重组包裹有重组DNADNA的的金属微粒金属微粒；5.5.被轰击被轰击样品样
48、品。、转基因动物、转基因动物:与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢些。与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢些。转基因动物：转基因动物：目的基因目的基因+载体载体重组重组DNADNA微量注射法微量注射法将重组将重组DNADNA导入受体合子细胞核中导入受体合子细胞核中遗传转化。遗传转化。如：如：利用转基因羊，大量表达人类的利用转基因羊，大量表达人类的抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶。可分泌人类生长可分泌人类生长因子因子的转基因羊的转基因羊“Polly”Polly”(下图下图)。(WilmutWilmut等，等，Nature Nature 385,385,1997)1997)受精卵细胞注射法受精卵细胞注射法
49、转基因牛：受精卵注射法转基因牛：受精卵注射法人类生长激素人类生长激素转基因猪转基因猪同胞鼠对照同胞鼠对照转移有人类生长激转移有人类生长激素转基因鼠素转基因鼠、遗传疾病诊断：、遗传疾病诊断：利用重组利用重组DNADNA技术进行遗传疾病诊断，技术进行遗传疾病诊断，是直接从是直接从DNADNA即基因水平进行诊断即基因水平进行诊断准确度高，速度快。准确度高，速度快。进行进行产前诊断产前诊断，分析胎儿是否有遗传疾病。，分析胎儿是否有遗传疾病。如：镰刀性贫血病的诊断如：镰刀性贫血病的诊断、基因治疗：、基因治疗：利用基因工程技术，将利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到有遗特异基因导入并整合到有遗传缺陷患
50、者的基因组中传缺陷患者的基因组中治疗遗传疾病，通常叫做治疗遗传疾病，通常叫做基因基因治疗治疗(gene therapy)(gene therapy)。方法：方法：利用利用减毒的病毒减毒的病毒DNADNA作载体作载体(retro virus DNA(retro virus DNA)构建重组构建重组DNADNA分子分子用病毒包装物包装后形成的减毒病用病毒包装物包装后形成的减毒病毒感染患者的细胞毒感染患者的细胞将正常基因整合到染色体上。将正常基因整合到染色体上。例如，例如，用用漠洛尼氏鼠漠洛尼氏鼠白血病病毒白血病病毒(MLV)(MLV)改造而成的改造而成的retro retro virusvirus
